端粒、端粒酶與癌癥

1、端粒、端粒酶與癌癥【摘要】端粒和端粒酶是近年來生命科學(xué)研究的熱點。細(xì)胞分裂過程中，因其染色體末端(端粒)DNA不能完全復(fù)制而縮短，使細(xì)胞逐漸失去增殖才能而衰老，端粒酶可延長染色體末端DNA，端粒酶的活化使細(xì)胞獲得無限增殖才能。在永生細(xì)胞系及絕大多數(shù)的惡性腫瘤(85%)細(xì)胞中有活化的端粒酶。本文綜述了端粒與端粒酶的構(gòu)造與功能，端粒酶在端粒合成與穩(wěn)定中的作用，介紹了端粒酶活性的測定方法，并討論了通過抑制端粒酶活性來治療癌癥的可能性?！娟P(guān)鍵詞】端粒；端粒酶；癌癥端粒(telere)和端粒酶(telerase)是近年來生命科學(xué)研究的熱點之一，正常細(xì)胞在分裂過程中，因其染色體末端(端粒)DNA不能完全復(fù)

2、制而縮短，細(xì)胞經(jīng)屢次分裂后，端?？s短到達(dá)危機(jī)點(risis)，促發(fā)某一信號，使細(xì)胞逐漸失去增殖才能而衰老死亡。端粒酶可延長染色體末端DNA，端粒酶的活化使細(xì)胞獲得無限增殖才能?；诖耍猩贁?shù)細(xì)胞(如永生細(xì)胞系)及絕大多數(shù)惡性腫瘤細(xì)胞(85%)可逃逸這一危機(jī)點。因為在這些細(xì)胞中含有活化的端粒酶系統(tǒng)，從而使細(xì)胞獲得無限增殖才能，使之永生化和惡變，因此，對端粒和端粒酶系統(tǒng)的研究，有助于說明細(xì)胞衰老和惡變機(jī)制，對腫瘤的診斷、治療以及抗衰老都具有重要的理論和實際意義。一般認(rèn)為，癌癥是由多種突變的積累，破壞了細(xì)胞正常的生長調(diào)控而引起的，除了一些明確的病因外，有許多實驗結(jié)果支持這樣一種假說，即端粒酶的激活對

3、許多惡性腫瘤細(xì)胞的形成是必需的，且腫瘤細(xì)胞與端粒酶活動增加之間存在互相激發(fā)的關(guān)系1。這種顯著的相關(guān)性提示:在腫瘤細(xì)胞惡性狀態(tài)的進(jìn)展和維持中，端粒酶可能起到關(guān)鍵性的作用。本文就端粒與端粒酶研究的最新進(jìn)展作一綜述，詳細(xì)討論了端粒的構(gòu)造與功能，端粒酶在端粒合成與穩(wěn)定中的作用，介紹了端粒酶活性的測定方法，細(xì)胞永生與端粒酶激活的關(guān)系，提出了通過抑制端粒酶活性來治療癌癥的可能性。1端粒(telere)1.1端粒(telere)的概念端粒是指真核細(xì)胞線性染色體末端的蛋白質(zhì)-DNA特殊構(gòu)造，即染色體末端DNA序列的多個重復(fù)，其作用是保護(hù)和穩(wěn)定染色體的末端，它由220kb串聯(lián)的短片段重復(fù)序列(TTAGGG)n及

4、一些結(jié)合蛋白組成。四膜蟲(單細(xì)胞生物)端粒的構(gòu)造是6個核苷酸5-TTGGGG-3序列的屢次重復(fù)。人類為5-TTAGGG-3序列的屢次重復(fù)。隨著細(xì)胞不斷分裂，染色體復(fù)制次數(shù)增加，端粒DNA序列進(jìn)展性縮短。故粒端長度決定了細(xì)胞壽命，至一定長度時，細(xì)胞停頓分化，并出現(xiàn)程序性死亡(細(xì)胞凋亡，Apptsis)。端粒作為細(xì)胞的“有絲分裂鐘(itsislk)調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂。早衰的端粒長度明顯低于正常人，而人精原細(xì)胞的端粒長度比體細(xì)胞長數(shù)千kb，并不隨年齡增長而遞減2。1.2端粒的構(gòu)造、功能1978年，Blakbu發(fā)現(xiàn)一種單細(xì)胞池塘生物四膜蟲的染色體端粒DNA為一種簡單核苷酸序列的大量重復(fù)，即(TTGGGG)n

5、，后來證明人和脊椎動物的端粒均為含有豐富鳥嘌呤(G)的重復(fù)DNA序列，人類端粒DNA由5TTAGGG3的重復(fù)單位構(gòu)成，細(xì)胞中端粒DNA總是和非組蛋白成分的蛋白質(zhì)結(jié)合成一個復(fù)合體，其構(gòu)造雖不清楚，但它有重要的作用，可以保護(hù)染色體末端不被核酸酶降解，防止染色體末端喪失、交融，并參與染色體在核內(nèi)定位及基因表達(dá)調(diào)控的作用，從而保持遺傳系統(tǒng)的穩(wěn)定性。2端粒酶2.1端粒酶的概念端粒酶為一種RNA依賴性DNA聚合酶，為一種核糖核蛋白酶，是合成端粒必需的酶。端粒的合成是以一段RNA為模板，端粒酶通過反轉(zhuǎn)錄過程合成端粒片段，并使其連接于染色體的端粒末端。端粒酶的發(fā)現(xiàn)，解釋了生物細(xì)胞“末端復(fù)制問題，并將兩個看似不

6、相關(guān)的研究領(lǐng)域衰老和癌癥嚴(yán)密地聯(lián)絡(luò)在一起。Ki等(1994)建立了能穩(wěn)定、成批、快速分析各組織端粒酶活性的Trap法，這是Ki等巧妙引用了PR技術(shù)形成的粒端重復(fù)擴(kuò)增分析法。端粒酶活性的調(diào)節(jié)所知甚少，調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的存活因子Bl-2可能對端粒酶的激活有正相調(diào)節(jié)功能。2.2端粒酶構(gòu)造、功能端粒酶是一種依賴于RNA的DNA聚合酶，目前認(rèn)為它由三局部組成：端粒酶RNA組分、端粒酶相關(guān)蛋白、端粒酶催化亞基。人類端粒酶基因定位在5P1533，其編碼了1132個氨基酸的多肽，它是以RNA為模板的逆轉(zhuǎn)錄酶，通過識別端粒單鏈的富G區(qū)引物，合成多個端粒重復(fù)序列到3端，所以端粒酶有端粒再生的作用。人類胚胎發(fā)育的早期，

7、很多組織可檢測到端粒酶活性，但隨著人類組織和細(xì)胞的分化，端粒酶活性迅速降低，到成人，僅有包括生殖細(xì)胞在內(nèi)的少數(shù)細(xì)胞或細(xì)胞系仍具端粒酶活性，大多體細(xì)胞已檢測不到。3端粒酶活性的測定方法最初采用的標(biāo)準(zhǔn)檢測端粒酶的方法是：分析細(xì)胞提取液在引物32末端上合成重復(fù)序列的才能，通過放射性核苷酸標(biāo)記、聚丙烯酰胺凝膠電泳和放射自顯影的觀察，結(jié)果端粒酶酶促反響呈現(xiàn)出6個核苷酸合成的脈沖性，因此形成典型的間隔6個核苷酸的端粒酶條帶形式圖譜。盡管用這種方法檢測原代腫瘤樣本中的端粒酶較為困難，但還是有兩個研究小組設(shè)法用該項技術(shù)證實了卵巢上皮癌與惡性造血細(xì)胞癌的提取物中有活化的端粒酶3。此外，亦有人用放射性標(biāo)記的特異性

8、探針進(jìn)展原位雜交，通過檢測組織細(xì)胞中RNA表達(dá)程度來反映端粒酶的有無4。人類細(xì)胞中正常的46條染色體，即有92個端粒。通過檢測不同組織類型細(xì)胞中染色體端粒的平均長度，可以間接地檢測端粒酶。端粒DNA長度的測定，一般采用染色體末端限制片段分析法，以(TTAGGG)4為探針的Suthern雜交進(jìn)展分析，該法的缺陷在于永生細(xì)胞中端粒長度并不能真正反映端粒酶的活性。目前，測定端粒酶活性主要采用Ki等建立的端粒重復(fù)序列擴(kuò)增法。該法采用了兩項革新技術(shù)，極大地進(jìn)步了端粒酶分析的敏感性(進(jìn)步了104倍)。首先是對抽提物的準(zhǔn)備和預(yù)處理，使用去污劑裂解細(xì)胞，從少量的細(xì)胞中提取有效的端粒酶(舊法采用的是低滲裂解)；

9、最主要的打破是允許一個端粒酶反響的產(chǎn)物以倍增指數(shù)方式進(jìn)展擴(kuò)增。這種擴(kuò)增是通過應(yīng)用一個端粒酶催化的引物，延伸反響產(chǎn)物作模板進(jìn)展PR，通過連續(xù)的以寡聚核苷酸為引物的DNA合成，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)展電泳，以此來反映端粒酶的活性。該法涉及到的兩對引物是:正向引物為52AATGTGAGAGAGTT23和反向引物為52(TTA)3TAA23。本法具有敏感、快速、高效的特點，但易受各種外來因素的干擾和同位素污染。最近Iaa等對TRAP法又進(jìn)展了改良，采用內(nèi)部端粒酶測定標(biāo)準(zhǔn)的熒光端粒重復(fù)擴(kuò)增法，可克制此點之缺乏，且可進(jìn)展半定量分析，是檢測端粒酶活性較為理想的方法。4端粒酶與腫瘤診斷和治療由于端粒酶活性見于絕大多數(shù)惡性

10、腫瘤，而人正常體細(xì)胞中未見該酶活性，端粒酶活性為惡性腫瘤的診斷和治療帶來了希望。首先，端粒酶活性的檢測有希望成為早期惡性腫瘤診斷和判斷腫瘤預(yù)后的標(biāo)志物。例如端粒酶活性的檢測可作為挑選早期惡性腫瘤的標(biāo)志物，假設(shè)能將轉(zhuǎn)移癌細(xì)胞與外周血細(xì)胞分開亦可作為早期轉(zhuǎn)移癌的標(biāo)志物。大約20%30%乳腺癌不伴有腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的病例未見有端粒酶活性，同時伴有腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的乳腺癌病例其端粒酶活性的檢出率超過95%，說明端粒酶可作為獨立的判斷乳腺癌預(yù)后及復(fù)發(fā)的指標(biāo)5。術(shù)前對組織進(jìn)展端粒酶分析可給外科醫(yī)生提供更多的信息，敏感的端粒酶分析法可用于細(xì)針穿刺組織使得術(shù)前判斷病人預(yù)后成為可能。其次，由于端粒酶活性是保持絕大多

11、數(shù)惡性腫瘤細(xì)胞繼續(xù)生長必須之酶，抗癌藥物建立在抑制端粒酶活性的根底上可能會得到高效治療效果和最低的副作用。端粒酶在生殖細(xì)胞和其它永久存活細(xì)胞內(nèi)的功能是保持端粒長度，使細(xì)胞能不斷地分裂。目前看來該酶是治療癌癥比擬特異和明確的目的69。雖然要考慮到抑制腫瘤細(xì)胞端粒酶活性的同時也抑制了生殖細(xì)胞和造血干細(xì)胞端粒酶活性，但是此治療設(shè)想比現(xiàn)用治療的毒性和副作用低，通常的化療除了對干細(xì)胞有作用外，對所有增生的細(xì)胞均起作用。用端粒酶抑制劑會減輕或防止常規(guī)化療所引起的惡心、脫發(fā)等副作用。應(yīng)該考慮到端粒酶抑制劑一定在端粒縮短到一定程度端粒酶被激活后，才能發(fā)揮效應(yīng)，所以可能需要一段時間。設(shè)計用該酶抑制劑治療腫瘤首先

12、應(yīng)設(shè)法加快腫瘤細(xì)胞端粒的縮短速度，以盡快使抑制劑發(fā)揮作用到達(dá)治療腫瘤的目的。5端粒酶的基因研究初步概況編碼端粒酶全酶的整個基因仍未被人們所認(rèn)識。但目前認(rèn)為，端粒酶為RNA依賴性DNA聚合酶，端粒酶的亞單位工作是以RNA為模板合成端粒DNA片段。在許多生物中包括人類編碼端粒酶的這段RNA模板基因已被克攏除此之外，還確定了與激活端粒酶有關(guān)的3種相關(guān)蛋白：P80、P95和TP1。P80和P95蛋白已從纖毛四膜蟲中純化。編碼與P80相似的哺乳動物的TP1蛋白的基因已克隆成功。迄今為止這些蛋白在端粒酶中所起確實切功能尚不得而知。哺乳動物TP1蛋白與四膜蟲P80蛋白的氨基酸順序極為相似。TP1蛋白表現(xiàn)出與

13、哺乳動物端粒酶RNA的特異性結(jié)合。TP1的抗血清與有端粒酶活性的細(xì)胞提取液顯免疫沉淀反響，提示TP1在體內(nèi)與端粒酶親密相關(guān)。綜上所述，近幾年，端粒及端粒酶的研究引起分子生物學(xué)家的濃重興趣，在酶的三維構(gòu)造預(yù)測、基因的克壟種系的發(fā)生，都獲得一定進(jìn)展1012。在對影響端粒長度的各種分子之間互相作用機(jī)制闡清的根底上，相信端粒及端粒酶的研究必將在延長細(xì)胞壽命、腫瘤檢測與診治、基因治療等方面獲得廣泛的應(yīng)用前景?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】1鄭偉，石一復(fù)，王升啟，等.端粒酶RNA和端粒酶活性在人生殖道癌細(xì)胞株中的表達(dá).細(xì)胞生物學(xué)雜志，1998，20：25.2楊澤.衰老與長壽的遺傳機(jī)制討論.國外醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)分冊，2002，23(4):2111.3鄧銘.端粒、端粒酶和腫瘤發(fā)生的關(guān)系.國外醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)分冊，2002，23(4):2171.4胡云清.端粒、隱性嵌合體、雜合性喪失與多基因病.國外醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)分冊，2000，23(1):48.5胡桂英.端粒、端粒酶與婦科腫瘤.國外醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)分冊，2000，23(6):300.6王偉.端粒、端粒酶及其生物學(xué)功能的研究進(jìn)展.山西大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)，1998，21(4):389-393.7劉鴻禧.端粒、端粒酶活性的研究與癌癥.汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院學(xué)報，1997，10(增