生物催化技術(shù)考試總結(jié)

1、第一章 緒論工業(yè)生物技術(shù)定義：在工業(yè)規(guī)模的生產(chǎn)過程中使用或部分使用生物技術(shù)來實現(xiàn)產(chǎn)品的制造，這種技術(shù)是應(yīng)用微生物和生物催化劑來提供產(chǎn)品和服務(wù).核心目標：大規(guī)模利用生物體系（如細胞或酶）作為催化劑實現(xiàn)物質(zhì)轉(zhuǎn)化. 工業(yè)生物技術(shù)是生物技術(shù)的重要組成部分第一章 緒論工業(yè)生物技術(shù)發(fā)展空間提升傳統(tǒng)產(chǎn)業(yè)生物能源環(huán)境生物技術(shù)生物材料第一章 緒論生物催化（Biocatalysis)利用酶或有機體（細胞或細胞器等）作為催化劑實現(xiàn)化學(xué)轉(zhuǎn)化的過程。生物轉(zhuǎn)化（Biotransformation)氧化-還原酶催化氧化-還原反應(yīng)。主要包括脫氫酶(dehydrogenase)和氧化酶(Oxidase)。如乳酸(Lactate

2、)脫氫酶催化乳酸的脫氫反應(yīng)。(1) 氧化還原酶 Oxidoreductase轉(zhuǎn)移酶催化基團轉(zhuǎn)移反應(yīng)，即將一個底物分子的基團或原子轉(zhuǎn)移到另一個底物的分子上。例如， 谷丙轉(zhuǎn)氨酶催化的氨基轉(zhuǎn)移反應(yīng)。(2) 轉(zhuǎn)移酶 Transferase水解酶催化底物的加水分解反應(yīng)。主要包括淀粉酶、蛋白酶、核酸酶及脂酶等。例如，脂肪酶(Lipase)催化的脂的水解反應(yīng)：(3) 水解酶 hydrolase裂合酶催化從底物分子中移去一個基團或原子形成雙鍵的反應(yīng)及其逆反應(yīng)。主要包括醛縮酶、水化酶及脫氨酶等。例如， 延胡索酸裂合酶催化的反應(yīng)。(4) 裂合酶 Lyase異構(gòu)酶催化各種同分異構(gòu)體的相互轉(zhuǎn)化，即底物分子內(nèi)基團或原子

3、的重排過程。例如，6-磷酸葡萄糖異構(gòu)酶催化的反應(yīng)。(5) 異構(gòu)酶 Isomerase合成酶，又稱為連接酶，能夠催化C-C、C-O、C-N 以及C-S 鍵的形成反應(yīng)。這類反應(yīng)必須與ATP分解反應(yīng)相互偶聯(lián)。A + B + ATP + H-O-H =A B + ADP +Pi 例如，丙酮酸羧化酶催化的反應(yīng)。 丙酮酸 + CO2 草酰乙酸(6) 合成酶 Ligase or Synthetase(四) 活性部位和必需基團必需基團：這些基團若經(jīng)化學(xué)修飾使其改變，則酶的活性喪失?；钚圆课唬好阜肿又兄苯优c底物結(jié)合，并和酶催化作用直接有關(guān)的部位。必需基團活性部位維持酶的空間結(jié)構(gòu)結(jié)合基團催化基團專一性催化性質(zhì)酶作

4、用的專一性結(jié)構(gòu)專一性立體異構(gòu)專一性族（基團）專一性絕對專一性(五) 酶作用的專一性族專一性：可作用于一類或一些結(jié)構(gòu)很相似的底物。絕對專一性：只能作用于某一底物。專一性酶的專一性是指在一定的條件下，一種酶只能催化一種或一類結(jié)構(gòu)相似的底物進行某種類型反應(yīng)的特性。1絕對專一： 只催化一種底物進行快速反應(yīng)，甚至是立體專一性2 相對專一性：一種酶能夠催化一類結(jié)構(gòu)相似的底物進行某種相同類型的反應(yīng)，這種專一性稱為相對專一性。基團專一和鍵專一 酶的催化作用受到底物濃度、酶濃度、溫度、pH值、激活劑濃度、抑制劑濃度等諸多因素的影響。在酶的應(yīng)用過程中，必須控制好各種環(huán)境條件，以充分發(fā)揮酶的催化功能。(六) 影響酶

5、催化的各種因素底物濃度的影響 在底物濃度較低的情況下，酶催化反應(yīng)速度與底物濃度成正比，反應(yīng)速度隨著底物濃度的增加而加快。當?shù)孜餄舛冗_到一定的數(shù)值時，反應(yīng)速度的上升不再與底物濃度成正比，而是逐步趨向平衡。 S VVm酶濃度的影響在底物濃度足夠高的條件下,酶催化反應(yīng)速度與酶濃度成正比 反應(yīng)速度 酶濃度溫度的影響 每一種酶的催化反應(yīng)都有其適宜溫度范圍和最適溫度。在最適溫度條件下，酶的催化反應(yīng)速度達到最大。反應(yīng)速度 溫度pH值的影響 酶的催化作用與反應(yīng)液的pH值有很大關(guān)系, 每一種酶都有其各自的適宜pH值范圍和最適pH值。反應(yīng)速度 pH抑制劑的影響 酶的抑制劑：使酶的催化活性降低或者喪失的物質(zhì)。抑制劑

6、有可逆性抑制劑和不可逆抑制劑之分。不可逆抑制劑：與酶分子結(jié)合后，抑制劑難于除去，酶活性不能恢復(fù)?？赡嫘砸种苿号c酶的結(jié)合是可逆的，只要將抑制劑除去，酶活性即可恢復(fù)。根據(jù)可逆性抑制作用的機理不同， 酶的可逆性抑制作用可以分為競爭性抑制、非競爭性抑制和反競爭性抑制三種。抑制劑的影響競爭性抑制：指抑制劑和底物競爭與酶分子結(jié)合而引起的抑制作用。機制：競爭性抑制劑與酶作用底物的結(jié)構(gòu)相似。它與酶分子結(jié)合以后，底物分子就不能與酶分子結(jié)合，從而對酶的催化起到抑制作用。例如，丙二酸是琥珀酸的結(jié)構(gòu)類似物。丙二酸是琥珀酸脫氫酶的競爭性抑制劑。競爭性抑制的特點：是酶催化反應(yīng)的最大反應(yīng)速度Vm不變，而米氏常數(shù)Km增大。

7、 抑制劑的影響非競爭性抑制（noncompetitive inhibition）：指抑制劑與底物分別與酶分子上的不同位點結(jié)合，而引起酶活性降低的抑制作用。機制：由于非競爭性抑制劑是與酶的活性中心以外的位點結(jié)合，所以，抑制劑的分子結(jié)構(gòu)可能與底物分子的結(jié)構(gòu)毫不相關(guān)。增加底物濃度也不能使非競爭性抑制作用逆轉(zhuǎn)。非競爭性抑制的特點：最大反應(yīng)速度Vm減小，而米氏常數(shù)Km不變。 抑制劑的影響反競爭性抑制(uncompetitive inhibition)：在底物與酶分子結(jié)合生成中間復(fù)合物后， 抑制劑再與中間復(fù)合物結(jié)合而引起的抑制作用。機制：反競爭性抑制劑不能與未結(jié)合底物的酶分子結(jié)合，只有當?shù)孜锱c酶分子結(jié)合以

8、后由于底物的結(jié)合引起酶分子結(jié)構(gòu)的某些變化，使抑制劑的結(jié)合部位展現(xiàn)出來，抑制劑才能結(jié)合并產(chǎn)生抑制作用。所以亦不能通過增加底物濃度使反競爭抑制作用逆轉(zhuǎn)。反競爭性抑制的特點：最大反應(yīng)速度Vm和米氏常數(shù)Km同時減小。 激活劑的影響 酶的激活劑或活化劑：能夠增加酶的催化活性或使酶的催化活性顯示出來的物質(zhì)。常見的激活劑有Ca+、Mg+、Co+、Zn+、Mn+等金屬離子和Cl- 等無機負離子。例如，氯離子（Cl-）是-淀粉酶的激活劑，鈷離子（Co+2）和鎂離子（Mg+2）是葡萄糖異構(gòu)酶的激活劑等。有的酶也可以作為激活劑，通過激活劑的作用使酶分子的催化活性提高或者使酶的催化活性顯示出來。酶的生產(chǎn)方法提取分離法

9、(Extraction)生物合成(Biosynthesis)化學(xué)合成(chemicalsynthesis)SOD - bloodPapain-PapayaChymotrypsin-Pancrea organ/tissue/cellAmylase from BacillusProtease from BacillusPhosphatase from BacillusGlucoamylase from AspergillusPlant cell cultureAnimal cell cultureFew example五大要素：碳源、氮源、無機鹽、生長因子、水培養(yǎng)基幾乎是一切對微生物進行研究和利用

10、工作的基礎(chǔ)培養(yǎng)基（medium）是人工配制的，適合微生物生長繁殖或產(chǎn)生代謝產(chǎn)物的營養(yǎng)基質(zhì)。任何培養(yǎng)基都應(yīng)該具備微生物生長所需要五大營養(yǎng)要素微生物發(fā)酵產(chǎn)酶優(yōu)良的產(chǎn)酶微生物具備的條件：（1）酶的產(chǎn)量高；（2）產(chǎn)酶穩(wěn)定性好；（3）容易培養(yǎng)和管理；（4）利于酶的分離純化；（5）安全可靠、無毒性等。構(gòu)成細胞物質(zhì)和代謝產(chǎn)物中氮素（不能用作能源 ）氮源有機氮源蛋白胨、酵母膏、牛肉膏無機氮源銨鹽、硝酸鹽 參與酶的組成、構(gòu)成酶活性基、激活酶活性維持細胞結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性調(diào)節(jié)細胞滲透壓控制細胞的氧化還原電位有時可作某些微生物生長的能源物質(zhì) 常用：硫酸鹽、磷酸鹽、氯化物以及含有鉀、鈉、鈣、鎂、鐵等元素的化合物。 氮源無機

11、鹽需要注意合適的碳氮比實驗室的常用培養(yǎng)基：細菌： 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（或簡稱普通肉湯培養(yǎng)基）；放線菌：高氏1號合成培養(yǎng)基培養(yǎng)；酵母菌：麥芽汁培養(yǎng)基；霉菌： 查氏合成培養(yǎng)基；例如枯草芽孢桿菌：一般培養(yǎng)：肉湯培養(yǎng)基或LB培養(yǎng)基；自然轉(zhuǎn)化：基礎(chǔ)培養(yǎng)基；觀察芽孢：生孢子培養(yǎng)基；產(chǎn)蛋白酶：以玉米粉、黃豆餅粉為主的產(chǎn)酶培養(yǎng)基；1、酶生物合成的模式細胞在一定條件下培養(yǎng)生長， 其生長過程一般經(jīng)歷調(diào)整期、生長期、平衡期和衰退期等4個階段 通過分析比較細胞生長與酶產(chǎn)生的關(guān)系, 可以把酶生物合成的模式分為4種類型。即同步合成型，延續(xù)合成型，中期合成型和滯后合成型。 同步合成型 酶的生物合成與細胞生長同步進行的一種酶

12、生物合成模式。該類型酶的生物合成速度與細胞生長速度緊密聯(lián)系， 又稱為生長偶聯(lián)型。 屬于該合成型的酶，其生物合成伴隨著細胞的生長而開始；在細胞進入旺盛生長期時，酶大量生成；當細胞生長進入平衡期后，酶的合成隨著停止。 大部分組成酶的生物合成屬于同步合成型，有部分誘導(dǎo)酶也按照此種模式進行生物合成。 例如米曲霉在含有單寧或者沒食子酸的培養(yǎng)基中生長，在單寧或沒食子酸的誘導(dǎo)作用下，合成單寧酶（tanase EC3.1.1.20）。 影響產(chǎn)酶的環(huán)境因素發(fā)酵溫度、PH、溶氧誘導(dǎo)物阻遏物表面活性劑產(chǎn)酶促進劑的使用延續(xù)合成型 酶的生物合成在細胞的生長階段開始，在細胞生長進入平衡期后，酶還可以延續(xù)合成一段較長時間。

13、 屬于該類型的酶可以是組成酶，也可以是誘導(dǎo)酶。例如， 在黑曲霉在以半乳糖醛酸或果膠為單一碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，可以誘導(dǎo)聚半乳糖醛酸酶（Polygalacturonase，EC3.2.1.15）的生物合成。 中期合成型 該類型的酶在細胞生長一段時間以后才開始，而在細胞生長進入平衡期以后，酶的生物合成也隨著停止。 例如，枯草桿菌堿性磷酸酶（Alkaline phophatase，EC 3.1.3.1)的生物合成模式屬于中期合成型。這是由于該酶的合成受到其反應(yīng)產(chǎn)物無機磷酸的反饋阻遏，而磷又是細胞生長所必不可缺的營養(yǎng)物質(zhì)，培養(yǎng)基中必須有磷的存在。這樣， 在細胞生長的開始階段, 培養(yǎng)基中的磷阻遏堿性磷酸酶

14、的合成，只有當細胞生長一段時間， 培養(yǎng)基中的磷幾乎被細胞用完（低于0.01mmol/L）以后，該酶才開始大量生成。又由于堿性磷酸酶所對應(yīng)的mRNA不穩(wěn)定，其壽命只有30 min左右，所以當細胞進入平衡期后， 酶的生物合成隨著停止。滯后合成型 此類型酶是在細胞生長一段時間或者進入平衡期以后才開始其生物合成并大量積累。又稱為非生長偶聯(lián)型。許多水解酶的生物合成都屬于這一類型。 屬于滯后合成型的酶，之所以要在細胞生長一段時間甚至進入平衡期以后才開始合成，主要原因是由于受到培養(yǎng)基中存在的阻遏物的阻遏作用。只有隨著細胞的生長，阻遏物幾乎被細胞用完而使阻遏解除后，酶才開始大量合成。 若培養(yǎng)基中不存在阻遏物，

15、該酶的合成可以轉(zhuǎn)為延續(xù)合成型。該類型酶所對應(yīng)的mRNA穩(wěn)定性很好，可以在細胞生長進入平衡期后的相當長的一段時間內(nèi)，繼續(xù)進行酶的生物合成。理想的酶合成模式酶所對應(yīng)的mRNA的穩(wěn)定性以及培養(yǎng)基中阻遏物的存在是影響酶生物合成模式的主要因素。其中，mRNA穩(wěn)定性好的，可以在細胞生長進入平衡期以后，繼續(xù)合成其所對應(yīng)的酶；mRNA穩(wěn)定性差的，就隨著細胞生長進入平衡期而停止酶的生物合成；不受培養(yǎng)基中存在的某些物質(zhì)阻遏的，可以伴隨著細胞生長而開始酶的合成；受到培養(yǎng)基中某些物質(zhì)阻遏的，則要在細胞生長一段時間甚至在平衡期后， 酶才開始合成并大量積累。在酶的發(fā)酵生產(chǎn)中， 為了提高產(chǎn)酶率和縮短發(fā)酵周期，最理想的合成模

16、式應(yīng)是延續(xù)合成型。因為屬于延續(xù)合成型的酶，在發(fā)酵過程中沒有生長期和產(chǎn)酶期的明顯差別。細胞一開始生長就有酶產(chǎn)生，直至細胞生長進入平衡期以后，酶還可以繼續(xù)合成一段較長的時間。對于其他合成模式的酶，可以通過基因工程細胞工程等先進技術(shù),選育得到優(yōu)良的菌株, 并通過工藝條件的優(yōu)化控制, 使他們的生物合成模式更加接近于延續(xù)合成型?；乇竟?jié)2、酶生產(chǎn)過程中細胞生長動力學(xué)細胞在控制一定條件的培養(yǎng)基中生長的過程中,其生長速度受到細胞內(nèi)外各種因素的影響,變化比較復(fù)雜，情況各不相同。 細胞生長動力學(xué)主要研究細胞生長速度以及外界環(huán)境因素對細胞生長速度影響的規(guī)律。1950年，法國的莫諾德(Monod)首先提出了表述微生物

17、細胞生長的動力學(xué)方程。 在培養(yǎng)過程中， 細胞生長速率與細胞濃度成正比 假設(shè)培養(yǎng)基中只有一種限制性基質(zhì)，而不存在其他生長限制因素時，為這種限制性基質(zhì)濃度的函數(shù)。KS 為莫諾德常數(shù)， 是指比生長速率達到最大比生長速率一半時的限制性基質(zhì)濃度?；乇竟?jié)莫諾德方程是基本的細胞生長動力學(xué)方程。在發(fā)酵過程優(yōu)化以及發(fā)酵過程控制方面具有重要的應(yīng)用價值。不少學(xué)者從不同的情況出發(fā)或運用不同的方法，對莫諾德方程進行了修正，得出了適用于不同情況的各種動力學(xué)模型。連續(xù)培養(yǎng)時的方程變化形式3、產(chǎn)酶動力學(xué) 產(chǎn)酶動力學(xué)主要研究細胞產(chǎn)酶速率以及各種環(huán)境因素對產(chǎn)酶速率的影響規(guī)律。產(chǎn)酶動力學(xué)的研究可以從整個發(fā)酵系統(tǒng)著眼，研究群體細胞的

18、產(chǎn)酶速率及其影響因素，這稱為宏觀產(chǎn)酶動力學(xué)或這稱為非結(jié)構(gòu)動力學(xué)。也可以從細胞內(nèi)部著眼，研究細胞中酶合成速率及其影響因素，這謂之微觀產(chǎn)酶動力學(xué)或稱為結(jié)構(gòu)動力學(xué)。細胞破碎許多酶存在于細胞內(nèi)。為了提取這些胞內(nèi)酶，首先需要對細胞進行破碎處理。1）機械破碎2）物理破碎3）化學(xué)破碎4）酶解破碎JY92-II D超聲波細胞粉碎機細胞破碎珠高壓細胞破碎機DY89-I型 電動玻璃勻漿機酶的分離純化細胞破碎1. 機械破碎法通過機械運動所產(chǎn)生的剪切力的作用，使細胞破碎的方法稱為機械破碎法。常用的破碎機械有組織搗碎機，細胞研磨器，勻漿器等。機械破碎法分為3種:搗碎法，研磨法和勻漿法。酶的分離純化細胞破碎2. 物理破碎

19、法通過溫度、壓力、聲波等各種物理因素的作用，使組織細胞破碎的方法，稱為物理破碎法。物理破碎法多用于微生物細胞的破碎。常用的物理破碎法方法有溫度差破碎法、壓力差破碎法、超聲波破碎法：(1)溫度差破碎法：利用溫度的突然變化，由于熱脹冷縮的作用而使細胞破碎的方法稱為溫度差破碎法。酶的分離純化2. 物理破碎法(2)壓力差破碎法：通過壓力的突然變化，使細胞破碎的方法稱為壓力差破碎法。常用的有高壓沖擊法、突然降壓法、及滲透壓變化法等。(3)超聲波破碎法：利用超聲波發(fā)生器所發(fā)出的聲波或超聲波的作用，使細胞膜產(chǎn)生空穴作用（cavitation）而使細胞破碎的方法稱為超聲波破碎法。酶的分離純化化學(xué)破碎法通過各種

20、化學(xué)試劑對細胞膜的作用，而使細胞破碎的方法稱為化學(xué)破碎法。常用的化學(xué)試劑有甲苯、丙酮、丁醇、氯仿等有機溶劑，和曲通（Triton）、吐溫（Tween）等表面活性劑。酶的分離純化化學(xué)破碎法有機溶劑可以使細胞膜的磷脂結(jié)構(gòu)破壞，從而改變細胞膜的透過性，使胞內(nèi)酶等細胞內(nèi)物質(zhì)釋放到細胞外。表面活性劑可以和細胞膜中的磷脂以及脂蛋白相互作用，使細胞膜結(jié)構(gòu)破壞，從而增加細胞膜的透過性。酶的分離純化酶促破碎法通過細胞本身的酶系或外加酶制劑的催化作用，使細胞外層結(jié)構(gòu)受到破壞，而達到細胞破碎的方法稱為酶促破碎法，或稱為酶學(xué)破碎法。將細胞在一定的pH值和溫度條件下保溫一段時間，利用細胞本身酶系的作用，使細胞破壞，而使

21、細胞內(nèi)物質(zhì)釋出的方法，稱為自溶法。酶的分離純化自溶法效果的好壞取決于溫度、pH值、離子強度等自溶條件的選擇與控制。為了防止其他微生物在自溶細胞液中生長，必要時可以添加少量的甲苯、氯仿、疊氮鈉等防腐劑。 根據(jù)細胞外層結(jié)構(gòu)的特點，還可以外加適當?shù)拿缸饔糜诩毎?，使細胞壁破壞，并在低滲透壓的溶液中，使細胞破裂。酶的分離方法超臨界萃取 超臨界萃取又稱為超臨界流體萃取，是利用欲分離物質(zhì)與雜質(zhì)在超臨界流體中的溶解度不同而達到分離的一種萃取技術(shù)。超臨界流體（supercritical fluid, SF）是一種物質(zhì)狀態(tài)，當物質(zhì)在超過臨界溫度及臨界壓力以上，氣體與液體的性質(zhì)會趨近于類似，最后會達成一個均勻相流體

22、現(xiàn)象。 超臨界流體類似氣體具有可壓縮性，而且又兼具有類似液體的流動性，密度一般都介于0.1到1.0g/ml之間。酶的分離方法4 層析分離吸附層析吸附層析是利用吸附劑對不同物質(zhì)的吸附力不同而使混合物中各組分分離的方法。吸附層析通常采用柱型裝置，將吸附劑裝在吸附柱中，裝置成吸附層析柱。酶的分離方法4 層析分離吸附層析層析時，欲分離的混合溶液自柱頂加入，當樣品液全部進入吸附層析柱后，再加入洗脫劑解吸洗脫。在洗脫時，層析柱內(nèi)不斷發(fā)生解吸、吸附、再解吸、再吸附的過程。酶的分離方法4 層析分離吸附層析吸附劑與洗脫劑的選擇 極性物質(zhì)容易被極性表面吸附；非極性物質(zhì)容易被非極性表面吸附；溶液中溶解度越大的物質(zhì)越

23、難被吸附。無機吸附劑和有機吸附劑。吸附劑通常由一些化學(xué)性質(zhì)不活潑的多孔材料制成，比表面積很大。酶的分離方法4 層析分離吸附層析洗脫劑選擇對于極性組分，用極性大的溶劑洗脫效果較好。而對于非極性組分，則用非極性溶劑洗脫較佳。洗脫劑的種類有：飽和烴、醇、酮、酚、醚、鹵代烷、水等。酶的分離方法1、沉淀分離鹽析沉淀法鹽析沉淀機理鹽之所以會改變蛋白質(zhì)的溶解度，是由于鹽在溶液中離解為正離子和負離子。由于反離子作用，使蛋白質(zhì)分子表面的電荷改變，同時由于離子的存在改變了溶液中水的活度，使分子表面的水化膜改變。酶和細胞固定化技術(shù)固定化酶的定義通過物理的或化學(xué)的手段，將酶束縛于水不溶的載體上，或?qū)⒚讣砜`在一定的空間

24、內(nèi)，限制酶分子的自由流動，但能使酶充分發(fā)揮催化作用；過去曾稱其為水不溶酶或固相酶。細胞和酶固定化技術(shù)固定化酶固定化酶新方法無載體固定化酶新技術(shù)交聯(lián)溶解酶、交聯(lián)酶晶體、交聯(lián)酶聚集體和交聯(lián)噴霧干燥酶。定向固定化新技術(shù)借助化學(xué)方法的位點專一性固定化磷蛋白的位點專一性固定化免疫球蛋白的位點專一性固定化糖蛋白的位點專一性固定化利用基因工程的位點專一性固定化新型固定化材料的應(yīng)用 通過磁性、輻射、光、等離子體、電子等新材料新方法均可制備高活性固定化酶。細胞和酶固定化技術(shù)固定化細胞3、動物細胞固定化固定化動物細胞的特點：（2）提高產(chǎn)率：動物細胞固定化后，可先在生長培養(yǎng)基中生長繁殖，使細胞在載體上形成最佳分布并

25、達到一定的細胞密度。然后可簡便地改換成發(fā)酵培養(yǎng)基，控制發(fā)酵條件，使細胞從生長期轉(zhuǎn)變到生產(chǎn)期，以利于提高產(chǎn)率。 細胞和酶固定化技術(shù)固定化細胞3、動物細胞固定化固定化動物細胞的特點：（3）固定化動物細胞可反復(fù)使用或連續(xù)使用較長的時間。例如，中國倉鼠卵巢細胞（CHO）生產(chǎn)人干擾素可以穩(wěn)定地生產(chǎn)30天。（4）固定化細胞易于與產(chǎn)物分開，利于產(chǎn)物分離純化，提高產(chǎn)品質(zhì)量。細胞和酶固定化技術(shù)固定化細胞3、動物細胞固定化動物細胞固定化方法：動物細胞固定化地方法有吸附法和包埋法兩種。(1)吸附法：大多數(shù)動物細胞屬于附著細胞，它們在培養(yǎng)過程中，必須趨向于附著在固體表面。故此吸附法特別適合于動物細胞的固定化。細胞和酶

26、固定化技術(shù)固定化細胞3、動物細胞固定化動物細胞固定化材料：轉(zhuǎn)瓶是由玻璃或塑料制成，表面經(jīng)過一定方法處理而帶上電荷。微載體是指顆粒細小的固定化載體，直徑一般為100200m，相對密度接近1.0。是由帶有表面電荷的葡聚糖、明膠、纖維素、聚丙烯酰胺、聚苯乙烯或玻璃等材料制成。微載體已用于多種動物細胞的固定化； 細胞和酶固定化技術(shù)固定化細胞4 原生質(zhì)體固定化固定化原生質(zhì)體的特點：(1)固定化原生質(zhì)體由于解除了細胞壁這一擴散屏障，可增加細胞膜的通透性，有利于氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)的傳遞和吸收，也有利于胞內(nèi)物質(zhì)的分泌，可顯著提高產(chǎn)率。細胞和酶固定化技術(shù)固定化細胞4 原生質(zhì)體固定化(2)固定化原生質(zhì)體由于有載體的保

27、護作用，具有較好的操作穩(wěn)定性和保存穩(wěn)定性，可反復(fù)使用和連續(xù)使用較長的時間，利于連續(xù)化生產(chǎn)。在冰箱保存較長時間后仍能保持其生產(chǎn)能力。(3)固定化原生質(zhì)體易于和發(fā)酵產(chǎn)物分開，有利于產(chǎn)物的分離純化，提高產(chǎn)品質(zhì)量。細胞和酶固定化技術(shù)固定化細胞4 原生質(zhì)體固定化(4)固定化原生質(zhì)體發(fā)酵的培養(yǎng)基中需要添加滲透壓穩(wěn)定劑，以保持原生質(zhì)體的穩(wěn)定性。這些滲透壓穩(wěn)定劑在發(fā)酵結(jié)束后，可用層析或膜分離技術(shù)等方法與產(chǎn)物分離。細胞和酶固定化技術(shù)固定化細胞4 原生質(zhì)體固定化固定化原生質(zhì)體的應(yīng)用固定化原生質(zhì)體一方面保持了細胞原有的新陳代謝特性，可以照常產(chǎn)生原來在細胞內(nèi)產(chǎn)生的各種代謝產(chǎn)物，另一方面又去除了細胞壁這一擴散屏障，有利

28、于胞內(nèi)產(chǎn)物不斷地分泌到胞外，這樣就可以不經(jīng)過細胞破碎和提取工藝而在發(fā)酵液中獲得所需的發(fā)酵產(chǎn)物，為胞內(nèi)物質(zhì)的工業(yè)化生產(chǎn)開辟了新途徑。固定化原生質(zhì)體可用于各種氨基酸、酶和生物堿等物質(zhì)的生產(chǎn)以及甾體轉(zhuǎn)化等。細胞和酶固定化技術(shù)固定化酶與細胞的比較固定化細胞固定化酶適合胞內(nèi)酶胞內(nèi)、外酶都適合既可完成單一反應(yīng)，也可以完成輔助因子參與的代謝過程應(yīng)用于單一反應(yīng)，不能完成復(fù)雜的代謝過程固定化之前不用進行分離純化固定化前必須進行分離純化獲得高度密集的工程菌集合體，較長時間地反復(fù)使用或連續(xù)使用不能獲得難避免副產(chǎn)物的產(chǎn)生，存在細胞膜、細胞壁的擴散限制作用可以控制避免不需要的副產(chǎn)物生成，不存在細胞膜的擴散限制作用細胞和

29、酶固定化技術(shù)固定化載體和方法的比較與選擇載體材料有機高分子材料無機載體材料復(fù)合載體材料新型載體材料酶的結(jié)構(gòu)酶活性中心（activity site)酶的活性中心包括兩個功能部位：一個是結(jié)合部位，是酶與底物結(jié)合的基團，決定酶的專一性；另一個是催化部位，催化底物敏感鍵發(fā)生化學(xué)變化的基團，決定酶的催化能力。但這兩個部位并不是各自獨立存在的，相互聯(lián)系。 改變酶特性有兩種主要的方法1)通過分子修飾的方法來改變已分離出來的天然酶的活性。 2)通過基因工程方法改變編碼酶分子的基因而達到改造酶的目的。1 什么是酶分子修飾？通過各種方法使酶分子的結(jié)構(gòu)發(fā)生某些改變，從而改變酶的某些特性和功能的技術(shù)過程稱為酶分子修飾

30、。即：在體外將酶分子通過人工的方法與一些化學(xué)基團（物質(zhì)），特別是具有生物相容性的物質(zhì)，進行共價連接，從而改變酶的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)。酶分子修飾的原理1、修飾劑分子存在多個反應(yīng)基團，可與酶形成多點交聯(lián)。使酶的天然構(gòu)象產(chǎn)生“剛性”結(jié)構(gòu)。從而增強酶天然構(gòu)象的穩(wěn)定性與耐熱性。酶分子修飾的原理2、大分子修飾劑與酶結(jié)合后，產(chǎn)生的空間障礙或靜電斥力阻擋抑制劑，“遮蓋”了酶的活性部位。從而保護酶活性部位并起到低抗抑制劑和抗蛋白水解酶的作用。酶分子修飾的原理3、酶分子上許多敏感基團交聯(lián)上修飾劑后，減少了受蛋白水解酶破壞的可能性。4、酶蛋白氨基酸組成的抗原決定簇，與修飾劑形成了共價鍵。破壞了抗原決定簇抗原性降低乃至消除，

31、“遮蓋”了抗原決定簇阻礙抗原、抗體結(jié)合。消除酶的抗原性，使酶穩(wěn)定。酶分子修飾的原理5、大分子修飾劑本身是多聚電荷體，能在酶分子表面形成“緩沖外殼”，抵御外界環(huán)境的極性變化，維持酶活性部位微環(huán)境相對穩(wěn)定。修飾劑的選擇原則1.修飾劑的分子量及鏈的長度（要求有較大的分子量）。2.修飾劑上反應(yīng)基團的數(shù)目及位置（要求有較多的反應(yīng)活性基團）。3.修飾劑上反應(yīng)基團的活化方法與條件（要求有完善的方法）。酶分子修飾的基本要求和條件 對酶分子進行修飾必須在修飾原理、修飾劑和反應(yīng)條件的選擇以及酶學(xué)性質(zhì)等方面都要有足夠的了解。（1）酶的穩(wěn)定性熱穩(wěn)定性、酸堿穩(wěn)定性、作用溫度、pH、抑制劑等。 （2）酶活性中心的狀況 活

32、性中心基團、輔因子等。其他如分子大小、性狀、亞基數(shù)等。酶分子修飾的條件修飾反應(yīng)盡可能在酶穩(wěn)定條件下進行，并盡量不破壞酶活性功能的必需基團，使修飾率高，同時酶的活力回收高。（1）pH與離子強度 pH決定了酶蛋白分子中反應(yīng)基團的解離狀態(tài)。由于它們的解離狀態(tài)不同，反應(yīng)性能也不同。（2）修飾反應(yīng)的溫度與時間 嚴格控制溫度和時間可以減少以至消除一些非專一性的修飾反應(yīng)。（3）反應(yīng)體系中酶與修飾劑的比例 回本章目錄酶分子的修飾方法修飾方法表面化學(xué)修飾酶分子內(nèi)部修飾大分子修飾小分子修飾交聯(lián)修飾固定化修飾蛋白主鏈修飾氨基酸置換修飾金屬離子置換修飾二、酶的定向進化概念人為地創(chuàng)造特殊的進化條件，模擬自然進化機制，在

33、體外對基因進行隨機突變，從一個或多個已經(jīng)存在的親本酶（天然的或者人為獲得的）出發(fā)，經(jīng)過基因的突變和重組，構(gòu)建一個人工突變酶庫，通過一定的篩選或選擇方法最終獲得預(yù)先期望的具有某些特性的進化酶。定向進化隨機突變選擇酶的非水相催化 酶的非水相催化酶在非水介質(zhì)中進行的催化作用稱為酶的非水相催化。在非水相中，酶分子受到非水相介質(zhì)的影響，其催化特性與在水相中催化有著較大的不同。酶的非水相催化非水相酶催化的特性（1）增加非極性基質(zhì)的溶解度；（2）使某些原本在水相不能進行的反應(yīng)順利進行，如肽的合成、酯的合成等；（3）可減少在水相容易發(fā)生的副反應(yīng)，如酸酐的水解、鹵化物的水解等；（4）容易分離回收；（5）無微生物

34、污染；酶的非水相催化類型有機介質(zhì)氣相介質(zhì)離子介質(zhì)超臨界介質(zhì)一、酶非水相催化的幾種類型1、有機介質(zhì)中的酶催化：有機介質(zhì)中的酶催化是指酶在含有一定量水的有機溶劑中進行的催化反應(yīng)。特點：1）適用于底物、產(chǎn)物兩者或其中之一為疏水性物質(zhì)的酶催化作用。2）酶在有機介質(zhì)中由于能夠基本保持其完整的結(jié)構(gòu)和活性中心的空間構(gòu)象，所以能夠發(fā)揮其催化功能。一、酶非水相催化的幾種類型1、有機介質(zhì)中的酶催化克利巴諾夫（Klibanov）研究表明：酶在一定濃度的有機溶劑中具有一定的“分子記憶”效應(yīng)，這種記憶是因為酶存在配體而產(chǎn)生的，當配體被移走后，由于大量有機溶劑存在狀態(tài)下酶構(gòu)象的高度剛性， 使得這種與配體具有高親和性的構(gòu)象

35、得以保持，而過量水的介入會加速這種記憶喪失。Klibanov A M. Enzyme memory-what is remembered and why? J. Nature, 1995, 374: 596-600.一、酶非水相催化的幾種類型2、氣相介質(zhì)中的酶催化定義：氣相介質(zhì)中的酶催化是指酶在氣相介質(zhì)中進行的催化反應(yīng)。特點：1）適用于底物是氣體或者能夠轉(zhuǎn)化為氣體的物質(zhì)的酶催化反應(yīng)。2）由于氣體介質(zhì)的密度低，擴散容易，所以酶在氣相中的催化作用與在水溶液中的催化作用有明顯的不同特點。 一、酶非水相催化的幾種類型3、超臨界流體介質(zhì)中的酶催化定義：超臨界介質(zhì)中的酶催化是指酶在超臨界流體中進行的催化反應(yīng)。條件要求：1）用于酶催化反應(yīng)的超臨界流體應(yīng)當對酶的結(jié)構(gòu)沒有破壞作用，對催化作用沒有明顯的不良影響；2）具有良好的化學(xué)穩(wěn)定性，對設(shè)備沒有腐蝕性；3）超臨界溫度不能太高或太低，最好在室溫附近或在酶催化的最適溫度附近；4）超臨界壓力不能太高，可節(jié)約壓縮動力費用；5）超臨界流體要容易獲得，價格要便宜等。酶非水相催化的幾種類型4、離子液介質(zhì)中的酶催化：離子液介質(zhì)中的酶催化是指酶在離子液中進行的催化作用。離子液（ionic liquids）是由有機陽離子與有機（無機）陰離子構(gòu)成的在室溫條件下呈液態(tài)的低熔點鹽類，揮發(fā)性低、穩(wěn)定性好。酶在離子液中的催化作用具有良好的穩(wěn)定性和區(qū)域選擇性、立