mRNA疫苗相關(guān)產(chǎn)業(yè)鏈價值分析：酶是價值鏈最大的一塊

1、mRNA疫苗相關(guān)產(chǎn)業(yè)鏈價值分析：酶是價值鏈最大的一塊一、mRNA 疫苗生產(chǎn)可分為兩大塊：mRNA 制備和脂質(zhì)微粒進行包封mRNA 疫苗生產(chǎn)可分為兩大塊，可以類比為“原料藥”（mRNA）的生產(chǎn)和純化， 以及“制劑”（利用脂質(zhì)微粒進行包封）階段。原料藥（mRNA）生產(chǎn)涉及 DNA 原液制備和 mRNA 原液的制備，mRNA 原液的制備（體外轉(zhuǎn)錄），是整個 mRNA 工藝流程 中核心的步驟，而原料主要是酶。(一) mRNA 疫苗的生產(chǎn)mRNA 疫苗生產(chǎn)可分為兩大塊，原料藥（mRNA）的生產(chǎn)以及制劑（利用脂質(zhì)微 粒進行包封）階段。mRNA 生產(chǎn)涉及 DNA 原液制備和 mRNA 原液的制備。所以 mR

2、NA 疫苗的生產(chǎn)可分為三大階段，第一步 DNA 原液制備，第二步 mRNA 原液的制備，第 三步是利用脂質(zhì)微粒進行包封。第一步：DNA 模板生產(chǎn)，主要是質(zhì)粒生產(chǎn)。編碼抗原的 DNA 模板生產(chǎn)，常用大腸桿 菌大規(guī)模體內(nèi)表達，最后提取和純化攜帶目的序列的質(zhì)粒；第二步：mRNA 原液的制備，轉(zhuǎn)錄，由 DNA 到 mRNA。在無細胞的反應器內(nèi)進行轉(zhuǎn) 錄，通過 T7、SP6 或 T3 等 RNA 多聚酶作用，通過一步或者兩步法轉(zhuǎn)錄成為 mRNA， 同時加上 5的 Cap 及 3的 Poly A 尾巴，在進一步使用 DNA 酶將殘留的 DNA 模板進行 消除；純化，使用離子交換等層析步驟進一步將轉(zhuǎn)錄形成的

3、 mRNA 進行純化，進行超 濾濃縮形成原液；第三步：制劑階段，利用脂質(zhì)微粒進行包封。通過微流體泵精確地控制著 mRNA 原液 和脂質(zhì)流速，將他們混合成脂質(zhì)納米粒 LNP。最后則是成品的灌裝及質(zhì)量控制，貼簽 形成終產(chǎn)品。二、mRNA 合成過程所需原料及成本測算（一）國內(nèi)外 mRNA 新冠疫苗的合成工藝BioNTech/輝瑞、Moderna 和艾博生物 mRNA 疫苗的合成工 、藝如下：1） BNT162b2BioNTech/輝瑞三核苷酸 cap1 類似物（m27,3-O）Gppp（m2-O）ApG）（TriLink）和 N1-甲基 假尿苷-5-三磷酸（m1TP）（Thermo Fisher S

4、cientific）取代尿苷-5-三磷酸（UTP） 的存在下，通過 T7 RNA 聚合酶對 DNA 進行純化和體外轉(zhuǎn)錄。總結(jié)：轉(zhuǎn)錄采用一步法，帽子類似物作引物；甲基假尿苷取代尿苷。2）mRNA-1273Moderna利用優(yōu)化的T7 RNA聚合酶介導的轉(zhuǎn)錄反應在體外合成了編碼序列優(yōu)化的mRNA， 尿苷被 N1-甲基假尿苷完全取代。轉(zhuǎn)錄后，使用牛痘苗封蓋酶（新英格蘭生物實驗室） 和痘苗 2O-甲基轉(zhuǎn)移酶（新英格蘭生物實驗室）將 Cap 1 結(jié)構(gòu)添加到 5端。通過 oligo dT 親和純化純化 mRNA，通過切向流過濾將緩沖液交換到 pH 為 5.0 的醋酸鈉中，無 菌過濾，并在-20C 下冷凍，

5、直到進一步使用。總結(jié)：轉(zhuǎn)錄采用兩步法，需要加帽酶的參與，甲基假尿苷取代尿苷。3）ARCoV -艾博生物該 mRNA 在體外使用 T7 RNA 聚合酶介導的轉(zhuǎn)錄從質(zhì)粒 ABOP-028（GENEWIZ） 的線性化 DNA 模板中產(chǎn)生，該質(zhì)粒編碼 SARS-CoV-2 的密碼子優(yōu)化 RBD 區(qū)域，并包 含 5和 3的未翻譯區(qū)域（UTR）和一條 poly-a 尾巴，以未修飾的 NTP 作為原料和 T7 聚合酶體外進行 mRNA 的合成，使用了牛痘加帽系統(tǒng)（Vaccinia Capping System ） (Novoprotein) 進行加帽。總結(jié)：轉(zhuǎn)錄采用兩步法，需要加帽酶的參與。（二）mRNA

6、制備過程原料mRNA 制備過程需要用到的主要原料包括質(zhì)粒 DNA 模板、一系列酶（主要為 7 種酶）以及底物核苷酸等;1、模板 DNA 所需原料：質(zhì)粒DNA 模板生產(chǎn)，主要是質(zhì)粒的生產(chǎn)。編碼抗原的 DNA 模板，通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到大 腸桿菌大規(guī)模體內(nèi)表達，最后提取和純化攜帶目的序列的質(zhì)粒，即得到 DNA 模板。目 前質(zhì)粒的生產(chǎn)提取和純化工藝很成熟，可以自建生產(chǎn)線或者外包出去，例如輝瑞自建 質(zhì)粒生產(chǎn)工廠，大部分 mRNA 企業(yè)外包，Moderna 和國內(nèi)企業(yè)目前是外包。制備 mRNA 質(zhì)粒的要求：質(zhì)粒用于制備 mRNA，這類 DNA 本身不屬于 API，DNA 需要按照 GMP 規(guī)范進行，GMP 質(zhì)

7、粒要求生產(chǎn)設(shè)備必須是專用的、符合 GMP 規(guī)范且配 備潔凈間。2、mRNA 體外轉(zhuǎn)錄所需原料：一系列酶+核苷酸底物mRNA 疫苗的研發(fā)與生產(chǎn)需要一系列酶的參與：mRNA T7 聚合酶、無機焦磷酸酶、 Rnase Inhibitor、加帽酶以及 2O-甲基轉(zhuǎn)移酶、Poly(A)聚合酶和 DNAase 等主要 7 種酶。2.1 轉(zhuǎn)錄過程所需要的酶RNA 聚合酶體系：RNA 聚合酶是體外轉(zhuǎn)錄 mRNA 的關(guān)鍵酶。T3、T7 和 SP6 RNA 聚合酶分別對 T3、T7 和 SP6 噬菌體啟動子具有高度的特異性。 將目的基因序列克隆到 T7 和 SP6 啟動子下游的多克隆位點中，以克隆的 DNA 為模

8、板 體外合成相應的 RNA。T7 RNA Polymerase（T7 RNA 聚合酶）高度特異識別 T7 啟動子序列，以含有 T7 啟動子序列的單鏈或雙鏈 DNA 為模板，以核甘酸（NTP）為底物，合成與啟動子下游 的單鏈 DNA 互補的 RNA。無機焦磷酸酶：加入無機焦磷酸酶，增加 RNA 產(chǎn)量。無機焦磷酸酶（PPase）可 催化無機焦磷酸鹽水解生成正磷酸鹽，可以為蛋白、RNA 和 DNA 的生物合成反應提 供動力，促進產(chǎn)物的生成。在工業(yè)化生產(chǎn) mRNA 疫苗的時候會產(chǎn)生大量的無機焦磷酸 鹽，為了保證 mRNA 疫苗高效生產(chǎn)，可以添加無機焦磷酸酶，可解除生成的無機焦磷酸鹽對反應體系的抑制。R

9、Nase 抑制劑：防止 RNA 的降解。少量 RNase 在 RNA 制備過程中引入，會導致 RNA 的降解，污染可能通過實驗過程中使用的槍頭、試管（離心管）和其他試劑引入。 通常使用 RNase 抑制劑作為減少和控制此類污染物的預防措施。RNase 抑制劑能與 RNase A 形成 1:1 復合體，抑制 RNase 活性，在 mRNA 疫苗研 發(fā)和生產(chǎn)過程需要保持 mRNA 的穩(wěn)定性以保證疫苗高質(zhì)量的生產(chǎn)。2、轉(zhuǎn)錄所需材料-核苷酸和修飾核苷酸mRNA 疫苗研發(fā)中常進行假尿嘧啶化修飾，尿嘧啶修飾是最豐富的 RNA 修飾， 一般由尿苷的異構(gòu)化產(chǎn)生，mRNA 的假尿嘧啶化修飾主要有三個功能：改變密

10、碼子、 增強轉(zhuǎn)錄本穩(wěn)定性和應激反應應答。3、加帽和加尾：共轉(zhuǎn)錄加帽/模板加尾，轉(zhuǎn)錄后加帽/加尾真核生物體內(nèi)會對轉(zhuǎn)錄形成的 mRNA 進行加帽，即在 mRNA 的 5端添加一個甲基 化的鳥苷酸帽子（m7GPPPN 結(jié)構(gòu)），從而保護 mRNA 免遭核酸外切酶的攻擊以增加 mRNA 的穩(wěn)定性，并且協(xié)助 mRNA 與核糖體的結(jié)合以促進翻譯起始。生物體內(nèi)的帽子 結(jié)構(gòu)有 cap0，cap1，cap2 三種形式，牛痘病毒加帽酶能夠在 mRNA 的 5端添加 cap0 帽子，再使用甲基轉(zhuǎn)移酶處理即可得到 cap1 帽子。此外，5帽子還參加 mRNA 前體的剪接，參與 mRNA 3末端多聚腺苷酸化，保證 mRN

11、A 在細胞質(zhì)中的穩(wěn)定運輸。加帽需要的酶：牛痘病毒加帽酶可以將 7-甲基鳥苷帽結(jié)構(gòu)（m7Gppp，Cap0）加到 RNA 的 5末端，大幅提高 mRNA 的穩(wěn)定性和啟動mRNA的翻譯。牛痘病毒加帽酶能夠在一小時之內(nèi)對mRNA進行加帽， 效率接近 100%。在 mRNA 疫苗研發(fā)生產(chǎn)過程中，mRNA 加帽效率和加帽 mRNA 穩(wěn)定表達的效率 對疫苗的工業(yè)化生產(chǎn)有重大的影響。牛痘病毒加帽酶體系加帽的 mRNA 在細胞內(nèi)的表 達效率大于帽子類似物 mRNA 的表達效率。加尾酶：Poly(A)聚合酶Poly(A)聚合酶可以催化 ATP 以 AMP 的形式依次摻入到 RNA 的 3末端，即在 RNA 的

12、3末端加多聚 A 尾。Poly(A)尾巴能夠增強 mRNA 的穩(wěn)定性、提高翻譯起始 效率、引導 mRNA 出核。主要用到的酶：1）牛痘病毒加帽酶：2）痘苗 2O-甲基轉(zhuǎn)移酶3）Poly(A)聚合酶加帽酶非常昂貴，如何替代加帽酶？一步法合成 mRNA 疫苗產(chǎn)品的加帽可以在 mRNA 的體外轉(zhuǎn)錄過程中通過摻入“帽子序列”實現(xiàn)， 這種加帽技術(shù)會將加帽序列反向加在 mRNA 上，在反應體系中加入 5帽類似物，可 以省一個加帽酶，以及減少純化步驟，一定程度上降低成本（尤其是節(jié)省了昂貴的加 帽酶成本），但相對應地，產(chǎn)量較之兩步法（加帽酶參與）減少，因為加帽酶的加帽效 率更高。4、消除 DNA 模板：需要

13、DNA 酶合成后的產(chǎn)物可能會有 DNA 殘留，在疫苗開發(fā)階段，殘留的去除是關(guān)鍵的步驟， 以減少下游純化難度并增加產(chǎn)品的純度。需要用 DNA 酶（DNAase 將殘留的 DNA 模 板進行消除，在 mRNA 疫苗生產(chǎn)的過程中對 DNA 的殘留控制非常嚴格。（三）mRNA 制備過程原料成本測算1、DNA 模板或者質(zhì)粒成本：以 100ug mRNA 所需成本為計（考慮質(zhì)粒生產(chǎn)外包 的情況下）測算假設(shè)如下：1）從質(zhì)粒 DNA 酶切到模板，預計占比 30%左右，預計在 1mg 質(zhì)粒到 DNA 模板 是 300 ug；2）質(zhì)粒生產(chǎn)價格，參考金斯瑞官網(wǎng)公布的質(zhì)粒價格，臨床級別 4000 元/mg?？紤]質(zhì)粒用

14、于制備 mRNA，工業(yè)化需求量大，具有采購優(yōu)勢，預計價格會更便宜，預計低于1000 元/mg；3）1ug DNA 在 RNA 聚合酶等催化下，能得到約 200ug 的 mRNA。結(jié)論：以質(zhì)粒（DNA）1000 元/mg 為計，則成本是 3 元/ugDNA，折算下來 1.5 元 /100ug mRNA。若 1劑mrna 疫苗為 100ug mRNA，則 1 億劑 mrna 疫苗，帶來質(zhì)粒需 求的規(guī)模在 1.5 億元，則 10 億劑 mrna 疫苗，帶來質(zhì)粒需求的規(guī)模在 15 億元左右。備注：以上測算假設(shè)條件太多，與實際結(jié)果恐偏差大，結(jié)果僅供參考。2、mRNA 制備過程中酶和和核苷酸底物成本：小規(guī)

15、模體外轉(zhuǎn)錄合成 100 ug RNA 成本約 20 元，工業(yè)生產(chǎn)酶的出廠價為小規(guī)模實驗室規(guī)模采購價格的 1/3 左右，則預計成本在 6 元-7 元左右，隨著工業(yè)化規(guī)模的放大，酶的價 格有望進一步下降。1）轉(zhuǎn)錄成本：以實驗室規(guī)模為例測算公式：酶的成本=價格*使用量。我們參考翌圣生物開發(fā)的試劑盒的用量，來測算 mRNA 制備過程的酶和核苷酸底物消耗量以及成本情況。I、一系列酶+核苷酸底物成本：假設(shè)條件如下：1）參考翌圣生物 mRNA 合成所需試劑，以 1g 的 DNA 模板投入量可以產(chǎn)生 100-200 g 的 mRNA（適用于以 Cap analog 為引物合成 Capped mRNA），我們測

16、算以 1g 的 DNA 得 到 150 g 的 mRNA 為準。2）用量：以 1 g 的模板投入量可以產(chǎn)生 100-200 g 的 RNA（我們?nèi)Q中位數(shù) 150ug）， 需要試劑盒量 2ul。3）試劑盒價格價格：約 30 元/2ul。則測算下來對應成本：20 元/100ug mRNA。II、其中核苷酸底物成本：參考國內(nèi)核苷酸底物成本估算為：0.8 元/100ugRNA（翌圣生物）測算假設(shè)如下：1）用量：參考翌圣生物試劑盒配方，以 1 g 的模板，需要核苷酸 100mM 2ul，可以 產(chǎn)生 100-200 g 的 RNA，我們?nèi)Q中位數(shù) 150ug，以 1g 的 DNA 得到 150 g 的

17、mRNA 為準。2）價格：核苷酸底物翌圣生物定價為 4400l 229 元，2ul 則為 1.2 元賽默飛定價為 4250l 1298 元，則 2ul 為 10.4 元。則測算下來對應成本：核苷酸底物成本估算為： 0.8 元/100ugmRNA（翌圣生物） 7 元/100ugmRNA（賽默飛）備注：以上測算假設(shè)條件太多，與實際結(jié)果恐偏差大，結(jié)果僅供參考。以上核苷酸底物價格不包括修飾核苷酸成本，若考慮修飾核苷酸，成本更高。以上測 算，核苷酸底物僅占轉(zhuǎn)錄成本 10%不到，相對酶來講占比低。mRNA 制備過程中，酶是最 主要的原料，也是最主要成本?？偨Y(jié)：1）小規(guī)模實驗室合成100 ug RNA成本約

18、20元，以上成本不含加帽或帽子類似物、 修飾核苷酸等成本，總體來說實驗室規(guī)模成本偏高。3）大規(guī)?；a(chǎn)的體外轉(zhuǎn)錄需要控制成本以及保證 mRNA 的質(zhì)量，需要對轉(zhuǎn)錄 和純化的每一個步驟進行優(yōu)化。同時，工業(yè)化生產(chǎn)對酶的需求量非常大，具有采購的 價格優(yōu)勢，根據(jù)草根調(diào)研數(shù)據(jù)，工業(yè)生產(chǎn)酶的出廠價為小規(guī)模實驗室規(guī)模采購價格的 1/3 左右，則預計成本在 6 元-7 元左右，隨著工業(yè)化規(guī)模的放大，酶的價格有望進一步 下降，從而生產(chǎn) mRNA 成本有望進一步降低。4）mRNA 制備過程中，酶是最主要的原料，也是最主要成本。放大規(guī)模之后的體 外轉(zhuǎn)錄將需要對轉(zhuǎn)錄和純化的每一個步驟進行優(yōu)化，這一系列過程解決方案提供

19、需要 酶生產(chǎn)企業(yè)的高度參與，所以我們預計體外轉(zhuǎn)錄過程中所需要的一系列酶一般會由同 一家酶生產(chǎn)企業(yè)提供。備注：我們以上測算過程，嘗試以小規(guī)模試驗室生產(chǎn)成本來計算大規(guī)模生產(chǎn)的成 本，難以避免的問題是大規(guī)模生產(chǎn)和小規(guī)模試驗室生產(chǎn)的用量和原料采購價格都會存 在很大的差異。將會導致與實際結(jié)果偏差大，結(jié)果僅供參考。（五）原材料供應商情況1、DNA 模板或者質(zhì)粒目前質(zhì)粒的生產(chǎn)提取和純化工藝很成熟，可以自建生產(chǎn)線或者外包，輝瑞自建質(zhì)粒工廠，大部分 mRNA 疫苗企業(yè)通常選擇外包，Moderna 和國內(nèi)企業(yè)目前是外包。制備 mRNA 質(zhì)粒的要求：質(zhì)粒用于制備 mRNA，這類 DNA 本身不屬于 API，這 種情

20、況下，DNA 只是按照 GMP 規(guī)范進行 API 生產(chǎn)的一種原材料或者起始物質(zhì)。2、轉(zhuǎn)錄一系列酶和核苷酸底物：mRNA 轉(zhuǎn)錄酶、mRNA 加帽酶、底物核苷酸及反應緩沖液等可由 mRNA 技術(shù)服務(wù)與生物制劑公司提供，轉(zhuǎn)錄一系列酶要求有控制 DNA 和 BAF 污染，以及批間一致性。 酶在供應商之間不可互換，酶異質(zhì)性的變化可能會影響體外轉(zhuǎn)錄的結(jié)果。更換時需要 進行批對批測試，以得出供應的質(zhì)量和一致性。海外分子酶提供商主要是新英格蘭實驗室、賽默飛、默克，Takara，其中應用最廣 泛的是新英格蘭實驗室。3、相關(guān)公司分析：1）近岸生物：近岸蛋白質(zhì)科技有限公司（原欣百諾生物）成立于 2004 年，近岸提

21、供一系列 mRNA 體外合成酶及試劑，解決 mRNA 疫苗的關(guān)鍵痛點。所有產(chǎn)品均采用藥用規(guī)格原輔料生 產(chǎn)，嚴格控制宿主蛋白質(zhì)殘留、核酸殘留及常見病原體污染，符合 GMP 規(guī)范的產(chǎn)品生 產(chǎn)與質(zhì)量管理規(guī)程，保障生產(chǎn)過程及所有原輔料可追溯。產(chǎn)品特點：GMP級mRNA 體 外合成及修飾原料，animal-free，ampicillin-free，產(chǎn)品生產(chǎn)、質(zhì)量控制及配套文件體系， 符合 mRNA 疫苗及藥物研發(fā)生產(chǎn)需求。經(jīng)過臨床使用驗證，單批次產(chǎn)能千萬人份，年 產(chǎn)能 50 億人份。2）諾唯贊諾唯贊成立于 2012 年，是一家圍繞酶、抗原、抗體等功能性蛋白及高分子有機材 料進行技術(shù)研發(fā)和產(chǎn)品開發(fā)的生物科

22、技企業(yè)，依托于自主建立的關(guān)鍵共性技術(shù)平臺， 先后進入了生物科研、體外診斷、生物醫(yī)藥等業(yè)務(wù)領(lǐng)域，是國內(nèi)少數(shù)同時具有自主可 控上游技術(shù)開發(fā)能力和終端產(chǎn)品生產(chǎn)能力的研發(fā)創(chuàng)新型企業(yè)。依托自主核心技術(shù)，搭建自主可控的關(guān)鍵共性技術(shù)平臺，可快速、高效、規(guī)?；?地進行產(chǎn)品開發(fā)，現(xiàn)有 200 余種基因工程重組酶和 1,000 余種高性能抗原和單克隆抗體 等關(guān)鍵原料，擁有 500 多個終端產(chǎn)品，可廣泛應用于科學研究、高通量測序、體外診 斷、醫(yī)藥及疫苗研發(fā)和動物檢疫等領(lǐng)域。諾唯贊擁有著一支 400 余人的研發(fā)創(chuàng)新團隊，由分子生物學、酶學、免疫學、生 物信息學、有機化學和材料學等多領(lǐng)域復合型研發(fā)人員組成，其中 50%

23、以上的研發(fā)人 員擁有碩士及以上學歷。3）翌圣生物：翌圣生物成立于 2014 年，是一家專注于工具酶原料及抗原抗體研發(fā)與生產(chǎn)的高新 技術(shù)型企業(yè)。公司現(xiàn)階段建設(shè)有分子、蛋白、細胞和免疫四大技術(shù)平臺，涵蓋全面豐 富的產(chǎn)品線，包括 PCR、qPCR、高保真 DNA 聚合酶、逆轉(zhuǎn)錄相關(guān)制劑、克隆試劑盒、 高通量測序 MaxUP 系列 DNA 和 RNA 建庫試劑盒、細胞培養(yǎng)、支原體檢測/預防/去除 試劑，以及體外診斷相關(guān)的酶原料、試劑和磁珠等 3000 多種試劑和試劑盒，服務(wù)于全 國各級高校、研究所、醫(yī)院、第三方檢測機構(gòu)、生物醫(yī)藥公司等 2.5 萬家客戶，助力發(fā)表高質(zhì)量 SCI 論文 1000 余篇。翌

24、圣生物作為國內(nèi)分子酶產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新領(lǐng)導者，通過先進的分子酶雙向技術(shù)平臺、大 規(guī)模蛋白發(fā)酵純化技術(shù)平臺，提供低殘留和高效率加帽的 Vaccinia Capping Enzyme（牛 痘病毒加帽酶），經(jīng)過 GMP 工藝生產(chǎn)獲得，完全滿足疫苗生產(chǎn)所需，并提供其他 mRNA 疫苗相關(guān)的酶和試劑。4）上海兆維上海兆維科技發(fā)展有限公司于2001年6月成立。公司主要從事核苷、核苷酸系列產(chǎn) 品和分子生物學試劑的研發(fā)和生產(chǎn)。上海兆維是國內(nèi)最大的能夠生產(chǎn)高品質(zhì)的修飾堿 基，dNTP，NTP，靶向示蹤劑等產(chǎn)品，是核酸合成領(lǐng)域當之無愧的隱形冠軍，在國內(nèi)外 核酸合成和原料供應領(lǐng)域占有絕對領(lǐng)先的市場份額。三、關(guān)于遞送系統(tǒng)（LN

25、P）原料及成本測算mRNA 分子量大、親水性強，但自身的單鏈結(jié)構(gòu)致使其極為不穩(wěn)定，易被降解， 自身攜帶負電荷，穿過表面同為負電荷的細胞膜遞送是難題，所以需要特殊的修飾或 包裹遞送系統(tǒng)才能實現(xiàn) mRNA 的胞內(nèi)表達，遞送技術(shù)是 mRNA 公司的核心專利技術(shù)。脂質(zhì)納米顆粒（Lipidnanoparticle，LNP）是目前主流的遞送載體方式。由于其比 較容易被抗原呈遞細胞吸收，因此最常被用于疫苗，目前三大 mRNA 疫苗巨頭企業(yè)， Moderna、CureVac 和 BioNTech 新冠疫苗均采用了 LNP 遞送技術(shù)。此外還有陽離子脂質(zhì)復合物 (lipoplex，LPX)、脂質(zhì)多聚復合物 (li

26、popolyplex，LPP)、 聚合物納米顆粒（Polymer nanoparticles，PNP）、無機納米顆粒（Inorganic nanoparticles， INP）陽離子納米乳（Cationic nanoemulsion，CNE)，以及瑞博生物自主研發(fā)的 GalNac N-乙酰半乳糖胺技術(shù)，能夠進行肝臟的定點傳遞。（一）LNP 為主流的遞送載體方式最廣泛應用的LNP組成成分：聚乙二醇脂質(zhì)、膽固醇、合成磷脂、可電離陽離子脂質(zhì)、mRNA。目前上市的mRNA疫苗成分主要有以下5種：1）mRNA；2）陽離子脂質(zhì)，與帶負電的mRNA結(jié)合，LNP最關(guān)鍵的成分；3）膽固醇，介導LNP內(nèi)吞，以及穩(wěn)

27、定LNP結(jié)構(gòu)（膽固醇有助于增加細胞膜的流動性或硬度，加入膽固醇能提高納米顆粒的穩(wěn)定性）；4）磷脂酰膽堿，輔助型脂質(zhì)，可以在內(nèi)吞時加快mRNA的釋放；5）聚乙二醇化磷脂，延長代謝時間，提高LNP穩(wěn)定性。1、陽離子脂質(zhì)體：LNP最關(guān)鍵的成分，是LNP逃離內(nèi)體的關(guān)鍵成分目前Moderna、輝瑞、BioNTech，Curevac，Acuitas，Genevant等公司都自行篩選 或授權(quán)從其他公司購買的陽離子類脂質(zhì)分子作為主要遞送材料，每家公司材料具體結(jié) 構(gòu)各不相同，但都屬于特定條件下戴正電荷的陽離子脂質(zhì)。陽離子脂質(zhì)體開發(fā)，在遞送效率和細胞毒性之間平衡?？呻婋x陽離子脂質(zhì)作用是 LNP遞送系統(tǒng)的關(guān)鍵，提高

28、mRNA的體內(nèi)穩(wěn)定性，并幫助mRNA逃避溶酶體的降解。在生產(chǎn)原液時，將mRNA和陽離子脂質(zhì)體在特定PH值下混合一起，則陰離子mRNA就 會和陽離子脂質(zhì)體產(chǎn)生靜電吸引融合在一起，一旦LNP被細胞吸收，核內(nèi)體的低pH環(huán)境 將會融合LNP，從而釋放mRNA進入胞質(zhì)溶膠。陽離子脂質(zhì)作為載體有著廣闊的應用前景，一些陽離子脂質(zhì)會引起細胞毒性。陽 離子脂質(zhì)的細胞毒性取決于其親水性頭基的結(jié)構(gòu)，含有季銨頭基的兩親分子比含有叔 胺的兩親分子毒性更大。陽離子有細胞毒性，解決對人體的副反應是關(guān)鍵，可電離陽 離子脂質(zhì)是LNP技術(shù)的核心，也是專利保護的重點。2、非陽離子脂質(zhì)：膽固醇，介導LNP內(nèi)吞，穩(wěn)定LNP結(jié)構(gòu)膽固醇有

29、利于確保LNP的雙層結(jié)構(gòu)及脂質(zhì)的流動性。中性脂質(zhì)（如各種磷脂）也是 用于構(gòu)建LNP雙層結(jié)構(gòu)的，因為陽離子脂質(zhì)體的雙層結(jié)構(gòu)并不穩(wěn)定。3、PEG-lipid：PEG修飾的脂質(zhì)體形成親水保護層，維持LNP空間的穩(wěn)定性，聚乙二醇在顆粒表面 可屏蔽血漿蛋白等成分結(jié)合顆粒，以避免LNP顆粒在體內(nèi)被清除。PEG-脂質(zhì)結(jié)合物也可能引起不期望的毒性，含有PEG的LNP已知脂質(zhì)結(jié)合物與免疫 細胞相互作用，產(chǎn)生針對某些聚乙二醇化脂質(zhì)的不希望出現(xiàn)的抗體。4、磷脂酰膽堿，輔助型脂質(zhì)，可以在內(nèi)吞時加快mRNA的釋放。5、其他賦形劑：有利于穩(wěn)定pH、溫度等。（二）LNP 遞送系統(tǒng)專利壁壘LNP 遞送系統(tǒng)的核心壁壘其實是材料

30、的專利。Arbutus 公司在 2009 年持有的 US8058069 號專利和 2015 年在中國申請的 CN1021192178 專利對于核酸和陽離子脂質(zhì) 混合物進行了非常全面的保護，對于幾乎所有陽離子脂質(zhì)和核酸和混合物，都進行了 覆蓋，預計到 2029 年到期，到期之前專利保護難以撼動。069 核心專利內(nèi)容：包含一種或多種活性劑或治療劑的新型穩(wěn)定脂質(zhì)顆粒、制備脂質(zhì)顆粒的方法和遞送和/或施用脂質(zhì)顆粒的方法；更具體地，包含核酸(例如一種或多種干擾 RNA)的穩(wěn)定 核酸-脂質(zhì)顆粒(SNALP)、制備 SNALP 的方法和遞送和/或施用 SNALP 的方法；一種核 酸-脂質(zhì)顆粒，包括：(a) 核

31、酸；(b) 占顆粒中總脂質(zhì)的 50mol%至 65mol%的陽離子脂質(zhì)；(c) 包含磷脂和膽固醇或其衍生物的混合物的非陽離子脂質(zhì)，其中磷脂占顆粒中存 在的總脂質(zhì)的 4mol%至 10mol%，膽固醇或其衍生物占顆粒中存在的總脂質(zhì)的 30mol% 至 40mol%；(d) 抑制顆粒聚集的綴合脂質(zhì)，其占顆粒中總脂質(zhì)的 0.5mol%至 2mol%（三）脂質(zhì)包封過程所需原料1、LNP 遞送系統(tǒng)的關(guān)鍵原料:可離子化脂質(zhì)、PEG 脂質(zhì)、DSPC 脂質(zhì)、膽固醇。LNP 直徑為 80-100 nm，每個脂質(zhì)納米粒含有約 100 個 mRNA 分子。以 Moderna mRNA-1273 疫苗為例：脂質(zhì)壁由四

32、種不同的化合物組成，1）SM-102專有陽離子脂質(zhì)，是構(gòu)成納米顆粒壁的基本結(jié)構(gòu)2）DSPC磷脂酰膽堿，助力納米顆粒的壁結(jié)構(gòu)3）膽固醇膽固醇存在于人體所有的細胞膜中，根據(jù)溫度的不同，膽固醇有助 于增加細胞膜的流動性或硬度，加入膽固醇能提高納米顆粒的穩(wěn)定性。4）PEG-2000 DMG一種融于聚乙二醇的脂質(zhì)，能幫助納米顆粒的形成。專有陽離子脂質(zhì) ALC-0315（輝瑞）和 SM-102（Moderna）這兩種脂質(zhì)都是叔胺， 在低 pH 值下質(zhì)子化（因此帶正電），在 mRNA 傳遞后實現(xiàn)安全清除。PEG 脂質(zhì)都是 PEG-2000 結(jié)合物。LNP 和 mRNA 的顆粒是通過自組裝形成，通過兩種液體按

33、照適當?shù)牡牧魉俸团浔刃?成?；驹恚篢 型管一端是 RNA 的水溶液，一端是脂質(zhì)的乙醇溶液，通過兩相的快速 混合，從而讓 LNP 完成自主裝，需要控制水相和乙醇相的流速比，設(shè)計管道的形狀。脂質(zhì)體的結(jié)構(gòu)在很大程度上取決于它們的制備方法。脂質(zhì)體可以是直徑 20-100nm 的單層（小的單層）囊泡（SUV），直徑為 100-1000nm 的大單層囊泡（LUV）-1000nm 或直徑1000nm 的巨大單層囊泡（GUV）或直徑500nm 的多層囊泡（MLV）。藥物輸送系 統(tǒng)主要使用 SUV 和小型 MLV，而 GUV 主要用作細胞模型。粒徑是決定脂質(zhì)體藥物包封率 和循環(huán)半衰期的一個關(guān)鍵參數(shù)，較小的脂

34、質(zhì)體更有可能逃脫吞噬細胞的攝取。脂質(zhì)納米顆粒生產(chǎn)過程：LNP 是在低 pH（pH 4.0）下制備的，此時可電離脂質(zhì)帶 正電荷，因此它很容易與每個脂質(zhì)納米粒約 100 個 mRNA 分子形成復合物。微流控裝 置用于將水中含有 mRNA 的流與乙醇中含有脂質(zhì)混合物的流混合。當快速混合時，這 兩種流的成分形成納米粒，將帶負電的 mRNA 包埋。如何組裝 LNP 是 mRNA 疫苗生產(chǎn)最大的 Know-how，需要控制 LNP 的組分、粒度、流 量、流體形態(tài)等參數(shù)，來完成結(jié)構(gòu)復雜的納米微粒組裝。目前從微流控到 T 型混合裝 置核心技術(shù)掌握在極少數(shù)企業(yè)手中。BioNTech/Pfizer 新冠疫苗的納米

35、脂質(zhì)體顆粒（LNPs）生產(chǎn)采用沖擊式射流混合法， 采用高壓泵，讓 mRNA 溶液和脂質(zhì)體溶液形成兩股射流，在一個腔體中進行對沖，從而 產(chǎn)生劇烈的湍流。這種湍流能讓 LNP 各個組分充分地混合，從而形成包裹 mRNA 的納米 脂質(zhì)體。采用德國 Knauer 研發(fā)生產(chǎn)的 IJM（碰撞噴射混合器）。規(guī)模化生產(chǎn)的沖擊式射流 混合器結(jié)構(gòu)和參數(shù)是根據(jù) Moerna、BioNTech 等企業(yè)需求量身定制。國內(nèi)企業(yè)上海邁安納目前可以提供納米載藥和微球載藥的整體解決方案，提供從 實驗室到商業(yè)化生產(chǎn)的整體解決方案。（四）mRNA 制劑過程 LNP 用量測算根據(jù)相關(guān)文獻披露成份比例，輝瑞為 mRNA 疫苗中脂類成分陽離子：PEG 脂質(zhì)： 膽固醇：DSPC 的摩爾比為 46.3:1.6:42.7:9.4，Modern 為 50:1.5:38.5:10。參考輝瑞和 Moderna 披露的疫苗成分，進行測算：1、PEG 修飾脂質(zhì)：參考輝瑞和 Moderna 披露的 PEG 修飾脂