生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)的基本操作培訓(xùn)

1、生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)的基本操作培訓(xùn)一、玻璃儀器的使用及清潔（一）玻璃儀器的洗滌及干燥1、一般儀器：燒杯、試管、離心管等普通玻璃儀器，可直接用毛刷蘸餐洗凈刷洗，然后用自來(lái)水沖洗，直至容器內(nèi)不掛水珠即可。最后用少量蒸餾水沖洗內(nèi)壁23次，倒置晾干即可。2、容量分析儀器：容量瓶、滴定管及吸管等容量?jī)x器，用后用自來(lái)水多次沖洗，如能清潔（壁不掛水珠），再用蒸餾水少量沖洗23次晾干即可備用。若仍不干凈附有油污等，則須于干后放入鉻酸洗液內(nèi)浸泡數(shù)小時(shí)，然后倒凈（或撈出）洗液，用自來(lái)水充分沖洗至水不顯黃色后再?zèng)_幾次，最后用少量蒸餾水沖洗23次晾干備用。在做酶學(xué)實(shí)驗(yàn)時(shí)，對(duì)儀器的清潔要求更高，因如有極微量的污物（如重金屬離子

2、）即可導(dǎo)致整個(gè)實(shí)驗(yàn)失敗。因此，必要時(shí)儀器經(jīng)上述方法洗滌后，還需用稀鹽酸或稀硝酸洗滌，以除去鉻及其它金屬離子，然后再用自來(lái)水、蒸餾水沖洗。生化實(shí)驗(yàn)室常用的洗液有以下幾種：（1）鉻酸洗液：為最常用的洗液，由重鉻酸鉀、粗硫酸及水配制而成，去污力強(qiáng)，清洗效果好。其配制方法有多種，可根據(jù)需要進(jìn)行選擇，常用的配方如下表。重鉻酸鉀（）10060100水（）750300200粗硫酸（）250460800清潔性能較弱較強(qiáng)（常用）最強(qiáng)配制方法為：先將重鉻酸鉀溶于水，再慢慢加入濃硫酸。因配制過(guò)程產(chǎn)生大量熱，容器需放入冷水中，邊加硫酸邊攪動(dòng)混合。由于產(chǎn)熱量很大，使用玻璃容器有破裂的危險(xiǎn)，所以最好用耐高溫的陶瓷或耐酸的

3、搪瓷容器。洗液可多次反復(fù)使用，如效力變?nèi)?，可加入少量重鉻酸鉀及濃硫酸繼續(xù)使用，但如果變?yōu)榫G色，則不宜再用。（2）10%尿素液：為蛋白質(zhì)良好溶劑，幫適用于洗滌盛血的容器。（3）草酸鹽液：用于清洗過(guò)錳酸鉀的痕跡。（4）硝酸液：用1：1的硝酸水溶液，用于清洗CO2測(cè)定器及微量滴定管。（5）乙二胺四乙酸二鈉（EDTAN2）液：510%的EDTAN2液可用于洗滌器皿內(nèi)無(wú)機(jī)鹽類(lèi)。玻璃儀器的干燥方法可根據(jù)不同儀器的種類(lèi)而定。一般地說(shuō)洗凈后的玻璃儀器，如不急用應(yīng)倒放在晾架上令其自然干燥。若有急用可放在烘烤箱中烤干，但容量玻璃儀器，如容量瓶、吸量管、滴定管以及燒結(jié)、結(jié)構(gòu)復(fù)雜的玻璃儀器等，嚴(yán)禁烘烤。此類(lèi)儀器，如急

4、用可采用水泵抽氣法干燥。（二）常用玻璃儀器的使用1、吸量管：吸量管是用來(lái)測(cè)量一定容積的液體，并把它從一個(gè)器皿轉(zhuǎn)移至另一個(gè)器皿中的量器。常用的吸量管有以下幾種：（1）刻度吸量管：刻度吸量管是多刻度吸量管，有0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0毫升等規(guī)格。吸量管刻度所標(biāo)的數(shù)字有自上而下和自下而上兩種，使用之前應(yīng)仔細(xì)分辨。實(shí)驗(yàn)室所用之刻度吸管多屬于刻度到尖端的吸管，所以要吹出尖端留存的液體。（2）奧氏吸管：在量取粘度較大的液體如血液、血清等時(shí)，應(yīng)當(dāng)使用奧氏吸管。這種吸管也是單標(biāo)的，并且在其下端有一個(gè)膨大部分。所以液體與吸管表面接觸面積較小，當(dāng)量取血液時(shí)，較他種吸管準(zhǔn)確。奧氏吸管的

5、容量包括遺留在尖端的液體，故在緩緩使液體流出后，再停留數(shù)秒鐘，吹出最后一滴。在學(xué)生實(shí)驗(yàn)中常用的有1、2、5毫升等規(guī)格。吸量管使用法：使用吸量管時(shí)，用拇指和中指靠近頂端部分。將管的下端插入液體里，用吸球吸入液體至需要刻度的標(biāo)線上12厘米處（插入液面下的部分不可太深，以免管的外壁沾附的溶液太多；也不可太淺，防止空氣突然進(jìn)入管內(nèi)，將溶液吸入吸球內(nèi)），將已充滿液體的吸量管提出液面，用小片濾紙揩去管外沾附的溶液，把吸管提到與眼睛在同一水平線上。然后小心松開(kāi)上口，按所需要液體容積緩緩自由流出。最后再根據(jù)規(guī)定吹出或者不吹出尖端的一滴。（3）微量加樣器2、容量瓶及量筒：容量瓶是一個(gè)細(xì)長(zhǎng)頸梨形的平底瓶，具有磨口

6、塞，頸上有標(biāo)線，表示在所示溫度下（一般為20）當(dāng)液體充滿到標(biāo)線時(shí)，液體體積恰好與瓶下所注明的體積相等。容量瓶有10、25、50、100、200、250、500、1000、2000毫升等規(guī)格。容量瓶是裝量型的定量容器，多用作稀釋溶液或配制精確試劑。當(dāng)將液體加至刻度后須用瓶塞塞好，顛倒混勻數(shù)次方可使用。容量瓶是較精確的定量容器，不得直接加熱或烘烤，也不應(yīng)將盛有溶液的容量瓶放入冰箱內(nèi)。當(dāng)配制溶液需要加熱促其溶解時(shí)，必須在燒杯中加熱溶解，并待溶液達(dá)到室溫后，再定量地轉(zhuǎn)入容量瓶?jī)?nèi)，然后稀釋到刻度，并要注意搖勻。當(dāng)所量取的液體量要求不十分準(zhǔn)確時(shí)，可使用量筒，因其較使用吸管或量瓶更為簡(jiǎn)便，量筒之底座及筒身是

7、焊接一起的，因而不能量取過(guò)熱液體，更不能直接加熱，以防炸裂。3、滴定管：滴定管是供容量分析滴定之用，有帶玻塞及橡皮管的兩種類(lèi)型。前者用以量酸，后者用以量堿。滴定管有刻度較精細(xì)的微量滴定管，有1.0、2.0、5.0、10毫升等規(guī)格。還有25、50、100毫升等規(guī)格的常量滴定管。使用滴定管應(yīng)該注意以下事項(xiàng)：（1）檢查是否清潔干燥，是否漏水，玻塞是否滑潤(rùn)，如有漏水或轉(zhuǎn)動(dòng)不靈，應(yīng)拆下活塞重新涂抹凡士林。涂抹前要將玻塞擦干，用手指沾少量凡士林在活塞兩頭各擦一薄層，將活塞插入槽內(nèi)，然后向同一方向轉(zhuǎn)動(dòng)活塞，直到從外面看時(shí)，全部透明為止。油涂好后，在活塞的小頭的槽上套一橡皮圈，以防活塞滑脫。（2）使用前必須認(rèn)

8、出每一格表示多少毫升。先用少量滴定液清洗滴定管23次，然后方可裝液。裝液體后，管內(nèi)如有氣泡必須排出。（3）滴定前先應(yīng)讀取起始點(diǎn)。滴定時(shí)，左手控制玻塞，右手持瓶，邊滴邊搖，密切注意被滴定溶液的顏色變化。（4）裝置滴定管時(shí)，管身必須與地面垂直。讀數(shù)時(shí)眼睛與溶液月形面下緣在同一水平線上，不要仰頭或低頭讀數(shù)。（5）如用酸式滴定管裝堿性溶液，滴定后應(yīng)立即洗凈，以免活塞粘連。二、一般操作技術(shù)1、混勻法：欲使一化學(xué)反應(yīng)充分進(jìn)行，必須使反應(yīng)體系內(nèi)各種物質(zhì)迅速地相互接觸，因此除特別規(guī)定外，一般都需要將反應(yīng)物徹底混勻?；靹蚍绞酱笾掠幸韵聨追N，可隨使用的器皿的液體容量而選用。（1）旋轉(zhuǎn)混勻法：手持容器作離心旋轉(zhuǎn)，適

9、用以未盛滿液體的試管或小口器皿，如三角瓶等。（2）彈指混勻法：左手持試管使直立，以右手食指輕擊試管下部，使管內(nèi)溶液作旋轉(zhuǎn)流動(dòng)。（3）倒轉(zhuǎn)混勻法：適用于有玻璃塞的瓶子，如容量瓶等。（4）彈動(dòng)混勻法：以右手大拇指、食指、中指握住試管上部，將試管放平，于左手掌中彈動(dòng)。（5）吸管混勻法：用吸管將溶液反復(fù)吸放數(shù)次，適用于量少而無(wú)沉淀的液體。（6）攪拌混勻法：適應(yīng)燒杯等大口容器所盛之溶液的混勻，一般在配制混合試劑時(shí)，用玻棒攪拌以助溶，或混勻大量的溶液。2、保溫與加熱：為使某一化學(xué)反應(yīng)在一定的溫度下進(jìn)行，常需要保溫；為促進(jìn)或停止化學(xué)反應(yīng)，有時(shí)需要加熱。（1）保溫：常用恒溫箱或恒溫水浴進(jìn)行，后者的溫度較前者穩(wěn)

10、定。（2）加熱：加熱常用兩種方法，一是直接把試管、燒杯等器皿在酒精燈、電爐或煤氣火焰上加熱；二是在水浴中加熱或煮沸，應(yīng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)的目的而定。3、過(guò)濾：過(guò)濾的目的是將沉淀與液體分開(kāi)，可用濾紙、棉花、紗布等。生化實(shí)驗(yàn)中所進(jìn)行的過(guò)濾，為了不改變?nèi)芤旱臐舛?，一般不要用水濕?rùn)濾紙。過(guò)濾所用的濾紙常摺成多摺狀，以增大過(guò)濾面積。當(dāng)過(guò)濾難濾之物或?yàn)榱思涌焖俣?，可采用減壓抽濾法。實(shí)驗(yàn)室中有時(shí)用離心法代替過(guò)濾。三、實(shí)驗(yàn)樣品的制備在生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)中，無(wú)論是分析組織中各種物質(zhì)的含量，還是研究組織中物質(zhì)代謝的過(guò)程，皆需利用特定的生物樣品。為了達(dá)到一定的實(shí)驗(yàn)?zāi)康?，往往需要將獲得的樣品預(yù)先做適當(dāng)?shù)奶幚?。掌握?shí)驗(yàn)樣品的正確處理方

11、法乃是做好生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)的先決條件?；A(chǔ)生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)中，最常用的動(dòng)物或人體樣品是全血、血清、血漿及無(wú)蛋白血濾液。組織樣品則常用肝、腎、胰、胃粘膜或肌肉等，實(shí)驗(yàn)時(shí)可制成組織勻漿、組織糜、組織切片或組織浸出液等形式。有關(guān)這些組織樣品的制備方法，扼要介紹如下：（一）血液樣品全血：無(wú)論是收集動(dòng)物還是人的血液，均應(yīng)注意儀器的清潔與干燥，同時(shí)也要及時(shí)加入適當(dāng)?shù)目鼓齽┮苑乐寡旱哪?。一般在血液取出后，迅速盛于含有抗凝劑的器皿中，同時(shí)輕輕搖動(dòng)，使血液與抗凝劑充分混合，以免形成小凝塊。取得全血如不立即進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，應(yīng)儲(chǔ)存于冰箱內(nèi)。常用的抗凝劑有草酸鹽、檸檬酸鹽、氟化鈉及肝素等，可視實(shí)驗(yàn)要求而選用。一般實(shí)驗(yàn)用草酸鹽即

12、可，但它不適用于血鈣測(cè)定。氟化鈉因兼有抗凝及抑制糖酵解之作用，故可用于血糖測(cè)定。但因其也能抑制脲酶，故用脲酶測(cè)定尿素時(shí)，則不能應(yīng)用。肝素雖好，但價(jià)格較貴?？鼓齽┑挠昧坎粦?yīng)過(guò)多，否則影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。通常每毫升血液加12mg草酸鹽或5mg檸檬酸鈉或510mg氟化鈉，肝素僅需要0.010.2mg，最好抗凝劑制成適當(dāng)濃度的水溶液，然后取0.5ml置于準(zhǔn)備盛血的器皿內(nèi)，再橫放蒸干（肝素不宜超過(guò)30），則抗凝劑在器皿壁上形成一層薄膜，使用時(shí)較為方便，效果較滿意。血漿：上述抗凝的全血在離心機(jī)中離心，所得的上清液即為血漿。如需用血漿進(jìn)行分析時(shí)，必須嚴(yán)格防止溶血，故采血時(shí)一切用具（注射器、針頭、試管等）皆需清潔干

13、燥，取出的血液也不能劇烈振搖。血清：收集的血液不加抗凝劑，在室溫下放520分鐘即自行凝固。通常經(jīng)3小時(shí)，血塊收縮，析出清亮的血清。為了節(jié)省時(shí)間，必要時(shí)可離心分離血清。制備血清同樣須防止溶血。無(wú)蛋白血濾液：分析血液中許多成分時(shí)，也常除去蛋白質(zhì)，制成無(wú)蛋白血濾液。如血液中的非蛋白氮、尿酸、肌酸等測(cè)定皆需先把血液制成無(wú)蛋白血濾液后，再進(jìn)行分析測(cè)定。蛋白質(zhì)沉淀劑如鎢酸、三氯醋酸或氫氧化鋅皆可用于制備無(wú)蛋白血濾液，可根據(jù)不同的需要而加以選擇。（二）尿液樣品一般定性實(shí)驗(yàn)只需將尿收集一次即可，但一天之中各次排出尿液的成分隨食物、飲水及一晝夜的內(nèi)生理變化等的影響而有很大的差異，因此定量測(cè)定尿液中各種成分皆應(yīng)收

14、集24小時(shí)尿混合后取樣。通常在早晨一定時(shí)間排出殘余尿而棄去，以后每次尿皆收集于清潔大玻瓶中，到第二天早晨同一時(shí)間收集最后一次尿即可，隨即混合并用量筒量準(zhǔn)其體積。收集的尿液如不能立即進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，則應(yīng)置于冷處保存。必要時(shí)可在收集尿時(shí)即于收集的玻瓶中加入防腐劑如甲苯、鹽酸等，通常每升尿中約加入5ml甲苯或5ml鹽酸即可。如須收集動(dòng)物尿液，可將動(dòng)物置于代謝籠中，其排出之尿液經(jīng)籠下漏斗流入瓶中而收集之。（三）組織樣品離體不久的組織，在適宜的溫度及H等條件下，可以進(jìn)行一定程度的物質(zhì)代謝。因此，在生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)中，常利用離體組織，研究各種物質(zhì)代謝的途徑與酶系的作用，也可以從組織中提取各種代謝物質(zhì)或酶進(jìn)行研究。但是各種組織離體過(guò)久后，都要發(fā)生變化。例如，組織中的某些酶在久置后發(fā)生變性而失活。有些組織成分如糖原、ATP等，甚至在動(dòng)物死亡數(shù)分鐘至十幾分鐘內(nèi)，其含量即有明顯的降低，因此，利用離體組織作代謝研究或作為提取材料時(shí)，都必須迅速將它取出，并盡快地進(jìn)行提取或測(cè)定。一般采用斷頭法處死動(dòng)物，放出血液，立即取出實(shí)驗(yàn)所需之臟器或組織，去除外層的脂肪及結(jié)締組織后，用冰冷之生理鹽水洗去血液，必要時(shí)也可用冰冷之生理鹽水灌注臟器以洗去血液，再