基因重組葡萄糖異構(gòu)酶工程產(chǎn)業(yè)化項目建設(shè)可行性研究報告書(已成功建設(shè)可行性研究報告書國家補助資金)

1、基因重組葡萄糖異構(gòu)酶工程產(chǎn)業(yè)化項目資金申請報告 第一章項目的意義和必要性第一節(jié)國內(nèi)外現(xiàn)狀和技術(shù)發(fā)展趨勢一、國內(nèi)外現(xiàn)狀葡萄糖異構(gòu)酶(Glucose Isomerase，簡稱 GI)，能將 D- 木糖、D-葡萄糖、D-核糖等醛糖轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的酮糖，工業(yè)上主要用作果葡糖漿生產(chǎn)的催化劑。1967年，美國首次成功的進行了 葡萄糖異構(gòu)酶的工業(yè)化應(yīng)用，至今國外的果葡糖漿生產(chǎn)業(yè)均已轉(zhuǎn)向葡萄糖異構(gòu)酶技術(shù)。由于葡萄糖異構(gòu)酶結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，是目前世界上公認的研究酶的催化機制、 建立完整的蛋白質(zhì)工程技術(shù)的最好 模型之一，具有巨大的經(jīng)濟價值和理論研究意義，國外投入了大量的人力、物力對葡萄糖異構(gòu)酶的酶學(xué)性質(zhì)、固定化工藝、基因 工

2、程、晶體學(xué)及其蛋白質(zhì)工程進行了系統(tǒng)的研究。如比利時的植物遺傳所、荷蘭細菌遺傳公司(Gist-brocades )、英國帝國理工 學(xué)院生物工程中心、美國加州 Cetus以及Amgen公司、加拿大 及日本的一些研究機構(gòu)等。國內(nèi)自六十年代起已開展了葡萄糖異構(gòu)酶應(yīng)用于果葡糖漿 生產(chǎn)的研究，山東省食品發(fā)酵工業(yè)研究設(shè)計院通過誘變篩選獲得 的7號淀粉酶鏈霉菌M1033菌株，是國內(nèi)在這方面最具應(yīng)用價 值的工業(yè)菌株之一。目前國內(nèi)外主要是通過誘變篩選等手段來獲 得生產(chǎn)用菌株，中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院是國內(nèi)唯一開展葡萄糖異構(gòu)酶的蛋白質(zhì)工程的研究單位。自國家“八六三”項目“葡萄糖異構(gòu)酶的蛋白質(zhì)工程”立項以來，項目

3、組的研究人員對葡萄 糖異構(gòu)酶的催化機理及其蛋白質(zhì)工程進行了多年的研究和探索。經(jīng)十五年科技攻關(guān)，目前已完成葡萄糖異構(gòu)酶的蛋白質(zhì)工程改 造，獲得性質(zhì)改良的基因重組葡萄糖異構(gòu)酶；并利用基因工程方法構(gòu)建高表達量的基因重組鏈霉菌工業(yè)生產(chǎn)菌株，獲得了具有完整自主知識產(chǎn)權(quán)的同源重組基因工程菌株M1033WZ，其技術(shù)水平及工業(yè)應(yīng)用價值在國內(nèi)外處于領(lǐng)先水平。目前項目共獲得3項國家發(fā)明專利：SM33GI的突變酶GIG138P及一種提高GI熱穩(wěn) 定性的突變方案”（專利號ZL95112782.9 ）、“一種葡萄糖異構(gòu)酶的 247位單突變體酶和138，247位雙突變體酶及其構(gòu)建方法”（專 利號ZL97119714.8

4、）、“表達M1033GI的突變酶 GIG138P 的基 因工程菌株 M1033WZ 及其構(gòu)建方法”（專利號：ZL02143031.4）， 其中“表達 M1033GI的突變酶 GIG138P 的基因工 程菌株 M1033WZ及其構(gòu)建方法”已獲得PCT國際專利受理。（見附件 4-6、 4-7、 4-8、 4-9、 4-10、 4-11）葡萄糖異構(gòu)酶市場方面，目前我國還沒有自己的葡萄糖異構(gòu)酶生產(chǎn)企業(yè)，國內(nèi)市場完全由丹麥諾維信公司所壟斷，其產(chǎn)品均為進口分裝，目前國內(nèi)市場銷售價約為38萬元/噸。二、我國酶制劑產(chǎn)業(yè)現(xiàn)狀1965年，中國第一家酶制劑專業(yè)生產(chǎn)企業(yè)在無錫市成立，標志著中國酶制劑工業(yè)的起步，40年

5、來，我國酶制劑產(chǎn)業(yè)從無到有， 至今已具有一定規(guī)模。目前我國酶制劑生產(chǎn)企業(yè)約100家，但均為中小型企業(yè)，現(xiàn)有年生產(chǎn)能力約40多萬噸，已實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)的酶種有20多種，主要集中在糖化酶、淀粉酶、蛋白酶等三 大類，大部分企業(yè)生產(chǎn)水平僅達到90年代末國際水平。我國酶制劑生產(chǎn)廠家主要產(chǎn)品大多停留在技術(shù)含量低、利潤率低的產(chǎn)品上，如目前市場上5萬單位糖化酶工廠成本約 4400元/噸，售價僅為4600元/噸，2000單位中溫淀粉酶工廠成本約 7000元/噸，售價僅為8000元/噸，10萬單位蛋白酶工廠成本約 7200元/噸，售價僅為8100元/噸。同時許多工業(yè)生產(chǎn)急需的酶 種如葡萄糖異構(gòu)酶、普魯藍酶、真菌淀粉

6、酶、乳酸酶、溶菌酶等 又需大量從國外進口，這種情況既嚴重影響了我國酶制劑行業(yè)的 健康發(fā)展，又增加了下游生產(chǎn)行業(yè)的生產(chǎn)成本。在當(dāng)前的市場情況下，安徽*生物技術(shù)有限公司緊抓機遇， 依托中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)的技術(shù)優(yōu)勢，生產(chǎn)科技含量高、技術(shù)壁壘 高的基因重組葡萄糖異構(gòu)酶，并將進一步發(fā)展多種高技術(shù)含量的 酶種如普魯蘭酶、堿性蛋白酶、啤酒復(fù)合酶、真菌淀粉酶、乳酸 酶、溶菌酶等，并爭取以此帶動國內(nèi)的酶制劑生產(chǎn)企業(yè)趕上國外 同行業(yè)水平。1991-1998年中國各類酶制劑的產(chǎn)量、總產(chǎn)量和銷售情況單位：千噸/百萬元 表1-11991年1992年1993年1994年1995年1996年1997年1998年a-淀粉酶11

7、.6513.9820.0024.8830.8935.0032.0038.00糖化酶67.8274.2674.8093.44125.11160.00150.00138.00蛋白酶12.8314.9915.0227.4340.0245.0038.0040.00其它酶0.130.050.26-0.29-5.00總產(chǎn)量92.33100.33110.10145.92196.31240.00220.00221.00總銷售額190.18225.95250.13328.93416.73521.60478.01480.002001年全國酶制劑行業(yè)重點生產(chǎn)企業(yè)表1-2北京市房山酶制劑總廠無錫杰能科生物工程有限公司

8、黑龍江省肇東市酶制劑廠天津市利華酶制劑技術(shù)有限公司江蘇江陰星達生物工程有限公司山東省沂水隆大生物工程有限責(zé)任公司河北邢臺市翔宇生物工程有限公司江西豪德集團生物工程實業(yè)有限公司湖南津市市新型發(fā)酵有限責(zé)任公司廣東江門生物技術(shù)開發(fā)中心酶制劑廠宜興杰成生物工程有限公司河南省三門峽發(fā)酵廠蘇州宏達制酶有限公司張家港市金源生物化工有限公司煙臺盛元鴻生物工程有限公司山東省安丘市酶制劑廠湖南省津市鴻鷹祥生物工程有限公司鄭州市興達發(fā)酵廠河北勝利酶制劑廠無錫市協(xié)達生物制品有限公司連云港兀升實業(yè)股份有限公司赤峰紅山生物工程有限公司2000年酶制劑行業(yè)收入最大的十家主要企業(yè)表1-3公司名稱（成立年份）主要產(chǎn)品無錫杰能科

9、生物工程有限公司（1993）酶制劑宜興杰成生物工程公司（1992）淀粉酶河南省三門峽發(fā)酵廠（1980）糖化酶安丘市酶制劑廠（1990）糖化酶廣州酶制品廠（1985）木瓜酶江陰市星達牛物工程有限公司（1995）糖化酶河北省邢臺市酶制劑廠（1953）淀粉酶吉林省吉發(fā)集團農(nóng)業(yè)開發(fā)股份有限公司糊精廠（1987）麥芽糊精貴陽白云銀星化工廠（1999）觸酶煙臺盛元鴻生物工程有限公司（1999）酶制劑三、技術(shù)發(fā)展趨勢從天然菌株中分離純化得到的野生型葡萄糖異構(gòu)酶早已商業(yè)化，并取得了良好的經(jīng)濟和社會效益，但同時存在著一定的局限性。主要表現(xiàn)在葡萄糖異構(gòu)酶在較高的反應(yīng)溫度下穩(wěn)定性不夠理想，在異構(gòu)化反應(yīng)中，溫度越高（

10、直至105 C110 C），熱力學(xué) 平衡越趨向于果糖方向。因此，通過蛋白質(zhì)工程改造葡萄糖異構(gòu) 酶的熱穩(wěn)定性，可以提高酶促反應(yīng)速度，延長酶壽命，降低生產(chǎn) 用酶量，增加反應(yīng)平衡過程中果糖的產(chǎn)量。目前各國科學(xué)家都在運用蛋白質(zhì)工程技術(shù)改造葡萄糖異構(gòu) 酶，以尋求具有優(yōu)越特性并適于工業(yè)化生產(chǎn)的葡萄糖異構(gòu)酶及高 表達菌株，使葡萄糖異構(gòu)酶制劑工業(yè)從傳統(tǒng)的依靠野生型菌株生 產(chǎn)發(fā)展到運用基因工程菌株生產(chǎn)的階段。而在這個領(lǐng)域，中國科 學(xué)技術(shù)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院走在了前沿。國內(nèi)外在葡萄糖異構(gòu)酶的突變體構(gòu)建方面存在多種突變方 案，但真正通過蛋白質(zhì)工程方法獲得的有效突變，僅有比利時的 Mrabet與法國、荷蘭科學(xué)家合作構(gòu)建的

11、K253R，以及中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院所構(gòu)建的GIG138P和GIG138P-G247D等。中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院所建立的葡萄糖異構(gòu)酶蛋白 質(zhì)工程研究系統(tǒng)在完整性和有效性上都達到國際先進水平，在7號淀粉酶鏈霉菌 M1033菌株葡萄糖異構(gòu)酶晶體結(jié)構(gòu)模型的基礎(chǔ) 上，確立了突變體的分子設(shè)計，并發(fā)現(xiàn)PDB所提供的橄欖色鏈霉菌葡萄糖異構(gòu)酶晶體結(jié)構(gòu)是錯誤的模型。第二節(jié) 對產(chǎn)業(yè)發(fā)展的作用與影響葡萄糖異構(gòu)酶是生產(chǎn)果葡糖漿的催化劑。人們利用淀粉為原料，經(jīng)液化、糖化、異構(gòu)化等作用，生產(chǎn)出的含葡萄糖和果糖 的混合糖漿，國內(nèi)稱果葡糖漿，國外稱高果糖漿，并分為42型、 55型和90型。其中42型果葡糖漿含糖

12、71 %、其中果糖占42%, 葡萄糖52 %，低聚糖6 %，甜度與蔗糖相當(dāng)。果葡糖漿以其風(fēng)味醇厚、食用后不會引起血糖升高、抑制 體內(nèi)蛋白質(zhì)消耗等蔗糖不可比擬的優(yōu)勢，正在受到世人的青睞。 尤其是果葡糖漿在人體內(nèi)的代謝不需經(jīng)過胰島素途徑，故糖尿病人可以攝入果葡糖漿，這一突出優(yōu)勢更使近年來果葡糖漿的消費 量年年攀升。2002年，美國果葡糖漿的消費量為1084萬噸，而我國僅為120萬噸，遠遠低于發(fā)達國家的水平。目前發(fā)展果葡糖漿已引 起了國務(wù)院、輕工部的重視，計劃到 2010年發(fā)展到330萬噸規(guī) 模，屆時對葡萄糖異構(gòu)酶的需求量將達到800噸/年。果葡糖漿生產(chǎn)技術(shù)、尤其是酶制劑生產(chǎn)技術(shù)的落后是影響 其發(fā)展

13、的主要障礙。基因重組葡萄糖異構(gòu)酶工程產(chǎn)業(yè)化項目的實 施，對提高我國酶制劑產(chǎn)業(yè)化水平，推進國內(nèi)食品行業(yè)的產(chǎn)品創(chuàng)新，提升食品生產(chǎn)技術(shù)水平，拉動農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)化發(fā)展，節(jié)約稀有的 土地資源，減少果葡糖漿生產(chǎn)的資源消耗， 節(jié)省外匯資源等具有 廣泛而深遠的意義。具體體現(xiàn)如下：一、是進行農(nóng)產(chǎn)品深加工、增加農(nóng)產(chǎn)品高附加值、拉動農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè) 化發(fā)展的需要長期以來由于產(chǎn)品深加工技術(shù)落后，我國的許多農(nóng)產(chǎn)品加 工一直處于產(chǎn)品加工鏈的初端，獲得的收益與高端加工相比有巨 大的懸殊。利用本項目產(chǎn)品可以進行玉米等農(nóng)產(chǎn)品的深加工，生產(chǎn)附加值相對較高、經(jīng)濟效益顯著、人民生活需要的果葡糖漿，實現(xiàn)農(nóng)業(yè)的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展。我國是淀粉生產(chǎn)的原材料大國，

14、原料如玉米、薯干、馬鈴 薯等資源豐富，以玉米為例，年產(chǎn)量已達1.2億噸，居世界第二位，玉米的增產(chǎn)為發(fā)展果葡糖漿提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。從市場看，進 入2000年以來，果葡糖漿發(fā)展形勢看好，產(chǎn)量攀升很快。果葡 糖漿行業(yè)的快速發(fā)展，可以解決農(nóng)民增產(chǎn)不增收的制約瓶頸。一方面，由于玉米產(chǎn)區(qū)連年增產(chǎn)，市場供大于求，糧價下跌，為保 證農(nóng)民收入國家給予大量經(jīng)濟補貼；另一方面，蔗糖生產(chǎn)企業(yè)處于嚴重虧損的境地，生產(chǎn)成本比市場售價平均每噸高2000元左右，國家為穩(wěn)定農(nóng)民收入、維持甘蔗的收購價，也給予蔗糖生產(chǎn) 企業(yè)大量補貼。這樣我國資源豐富的淀粉類農(nóng)產(chǎn)品深加工很不 夠，農(nóng)民的收入無法提高，而國家在玉米、蔗糖等農(nóng)產(chǎn)品上都要

15、給予許多補貼。為了從根本上改變這種局面，我國已開始大力發(fā)展葡萄糖異構(gòu)酶進行果葡糖漿的生產(chǎn)，以滿足食品、飲料加工企業(yè)的需要，加大農(nóng)產(chǎn)品深加工力度的同時，有效的減輕國家財政負擔(dān)。從美國的情況來看，2002年深加工消耗玉米4978.4萬噸， 果葡糖漿消耗玉米1955.8萬t，占39.28%，發(fā)酵酒精占深加工 玉米總量的38%，這兩個產(chǎn)品就占深加工玉米總量的77.28%，是美國玉米深加工的主導(dǎo)產(chǎn)品，而果葡糖漿消耗的玉米量占第一位。我國2002玉米深加工僅消耗1000萬噸，還不到玉米總產(chǎn) 量的10%，其中果葡糖漿消耗玉米 108萬噸，占玉米深加工消耗的10%。本項目產(chǎn)品基因重組葡萄糖異構(gòu)酶是生產(chǎn)果葡糖漿

16、所必需的酶制劑，項目的建設(shè)是進行農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)化，實現(xiàn)我國全面建設(shè)小康社會的需要。二、節(jié)約稀有的土地資源用淀粉生產(chǎn)果葡糖漿可以節(jié)省經(jīng)濟作物甘蔗用地，改種經(jīng)濟效益更好的農(nóng)作物，利于土地資源的有效利用。 生產(chǎn)1噸果葡 糖漿用玉米1.7噸或山芋干1.9噸，分別需耕地4畝或2畝；而 以甘蔗生產(chǎn)1噸蔗糖需耕地10畝。若年產(chǎn)200萬噸果葡糖漿， 以玉米計可節(jié)約耕地1200萬畝，以山芋干計可節(jié)約1600萬畝， 這對耕地面積日趨減少的我國來說，其意義更不可忽視。三、提高果葡糖漿生產(chǎn)廠家的能源和資源利用率，促進其環(huán)保效、人益本項目產(chǎn)品投入使用后，由于提高了酶促反應(yīng)溫度，使反 應(yīng)速度加快，增加反應(yīng)平衡過程中果糖的產(chǎn)量，

17、同時減少了副產(chǎn)物的生成，可以簡化果葡糖漿生產(chǎn)的后處理工藝，減少工業(yè)生產(chǎn)過程中廢物的產(chǎn)生和排放， 提高能源和資源利用率。另外葡萄糖 異構(gòu)酶可以重復(fù)使用，由于酶壽命的延長，降低了葡萄糖異構(gòu)酶 的使用量，從而可以節(jié)約國家資源，提高果葡糖漿生產(chǎn)的環(huán)保效、人益。四、為國家節(jié)省外匯資源目前我國已建成投產(chǎn)的果葡糖漿生產(chǎn)規(guī)模超過100萬噸，年消耗葡萄糖異構(gòu)酶約 300噸。目前國內(nèi)市場上銷售的同類產(chǎn)品 全部由丹麥諾維信公司所壟斷，其銷售價約為38萬元/噸，即每年需占用國家1億元外匯資源。本項目建成投產(chǎn)后，完全可以滿 足國內(nèi)市場需求量，每年可為國家節(jié)省1億元外匯資源。五、是促進我國食品工業(yè)發(fā)展的需要糖是我國食品工

18、業(yè)的重要原料，在糖類中，果葡糖漿具有 蔗糖不可比擬的優(yōu)勢：味甜、成本低、風(fēng)味醇厚、食用后不會引 起血糖升高、抑制體內(nèi)蛋白質(zhì)消耗等優(yōu)點。目前“果葡糖漿熱”已在全世界掀起。近幾年，世界上風(fēng) 行的運動飲料多以果葡糖漿為主要配方，許多國家正以果葡糖漿取代蔗糖。在我國，2002年果葡糖漿的實際產(chǎn)銷量僅為 120萬 噸，遠遠低于發(fā)達國家（美國2002年果葡糖漿產(chǎn)量為1084萬噸）的水平。除了消費意識落后、消費習(xí)慣、價格高、固定資產(chǎn) 投資大、產(chǎn)業(yè)的生產(chǎn)慣性等原因外，果葡糖漿生產(chǎn)技術(shù)、尤其是 酶制劑生產(chǎn)技術(shù)的落后是影響我國果葡糖漿產(chǎn)業(yè)發(fā)展的主要障 礙。優(yōu)勢明顯、風(fēng)味獨特的果葡糖漿將大力推進我國食品行業(yè) 的產(chǎn)品

19、創(chuàng)新，引領(lǐng)人民的生活質(zhì)量向更高的水平發(fā)展。趕超世界果葡糖漿生產(chǎn)和應(yīng)用水平是食品工業(yè)生產(chǎn)的重要任務(wù)之一，也是提升我國食品生產(chǎn)技術(shù)水平和發(fā)展工業(yè)經(jīng)濟的重要舉措之一。六、是提高群眾收入和保持社會繁榮穩(wěn)定的需要本項目建成后可直接為社會提供150個就業(yè)機會，工人進廠月工資及附加達到1000元以上，可大幅度提高當(dāng)?shù)厝罕娛杖胨?，帶動?dāng)?shù)厝罕娭赂?，推進區(qū)域經(jīng)濟的協(xié)調(diào)發(fā)展，有利于維 護地區(qū)穩(wěn)定、社會進步和經(jīng)濟繁榮。第三節(jié)產(chǎn)業(yè)關(guān)聯(lián)度分析安徽*生物技術(shù)有限公司“基因重組葡萄糖異構(gòu)酶工程產(chǎn) 業(yè)化項目”實施的影響面大，與相關(guān)產(chǎn)業(yè)關(guān)系緊密，不可分割。 項目建成后不但自身的經(jīng)濟效益顯著，并且會帶動相關(guān)行業(yè)迅速發(fā)展，獲得較

20、好的社會效益，促進經(jīng)濟發(fā)展。按產(chǎn)業(yè)關(guān)聯(lián)度的基 準定義內(nèi)容，即前向關(guān)聯(lián)、后向關(guān)聯(lián)和旁側(cè)關(guān)聯(lián)分別分析如下：一、牽動上游相關(guān)行業(yè)發(fā)展（前向關(guān)聯(lián)）：“基因重組葡萄糖異構(gòu)酶工程產(chǎn)業(yè)化項目”形成規(guī)模后，涉及 到所需的原輔材料及包裝材料（如各類農(nóng)副產(chǎn)品、包裝材料及其 他相關(guān)輔料等）全部在國內(nèi)采購，所需數(shù)量相當(dāng)可觀，牽動相關(guān) 原輔材料及包裝材料產(chǎn)業(yè)的發(fā)展壯大，并給這些行業(yè)增加經(jīng)濟效益，為國民經(jīng)濟增加了新的增長點；二、帶動下游產(chǎn)業(yè)發(fā)展（后向關(guān)聯(lián)）：生產(chǎn)本項目產(chǎn)品的發(fā)酵過程中產(chǎn)生的谷物糟渣可作為上佳 的畜禽養(yǎng)殖飼料，對推動當(dāng)?shù)匦笄蒺B(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展和提高農(nóng)民經(jīng)濟 收入具有很大的促進作用；三、旁側(cè)關(guān)聯(lián):生產(chǎn)基因重組葡萄糖

21、異構(gòu)酶的原料主要是各類農(nóng)副產(chǎn)品，其下游相關(guān)聯(lián)產(chǎn)品果葡糖漿的生產(chǎn)更需要消耗大量的農(nóng)副產(chǎn)品。農(nóng)副產(chǎn)品的特點是量大、笨重，需要較多的運力，因此該項目的建設(shè)能夠帶動運輸業(yè)及其他服務(wù)業(yè)的發(fā)展。圖1-1:產(chǎn)業(yè)關(guān)聯(lián)分析圖第四節(jié)市場分析葡萄糖異構(gòu)酶主要用于果葡糖漿的生產(chǎn)，依照目前的技術(shù) 水平，1公斤葡萄糖異構(gòu)酶可生產(chǎn)約 4噸果葡糖漿。由于目前國 內(nèi)對葡萄糖異構(gòu)酶市場沒有完備準確的調(diào)研報告可以參考，因此我們以果葡糖漿的市場情況來分析葡萄糖異構(gòu)酶的市場情況。一、我國果葡糖漿發(fā)展情況雖然我國果葡糖漿研究工作起步較早，早在上世紀60中期幾乎與日本和美國等發(fā)達國家同步開始，但由于條件不成熟，只有1976年安徽蚌埠果糖廠

22、年產(chǎn)1600噸果葡糖漿的生產(chǎn)線效果 較好。該廠生產(chǎn)的飲料“黃山可樂”也由于用果葡糖漿替代蔗糖 做甜味劑，在市場上占有一席之地。1981年該廠又引進美國道爾公司年產(chǎn)萬噸果葡糖漿的生產(chǎn)線，到1984年建成投產(chǎn)。國內(nèi)還有一些小規(guī)模生產(chǎn)廠，如北京通縣燕京果糖廠，北京房山果糖 廠、河北南和縣果糖廠等，主要是供應(yīng)周圍地區(qū)食品生產(chǎn)廠家使 用，由于發(fā)展緩慢，遠遠不能滿足當(dāng)前國內(nèi)市場日益增加的需求。近年來，隨著科技的進步，人們對果葡糖漿的優(yōu)越性的認 識正在提高，特別是糖尿病作為一種常見疾病正嚴重危害廣大群 眾的身體健康，食用果葡糖漿不會增加胰島素負擔(dān)這一優(yōu)點正逐 漸被大眾接受，果葡糖漿的應(yīng)用范圍也更加廣闊，市場

23、容量連年 增大。為適應(yīng)這種需要，僅 2000年以來，國內(nèi)就建成山東保齡寶生物技術(shù)公司、河北邢臺平安糖業(yè)公司等多家十萬噸級果葡糖 漿生產(chǎn)線。這些生產(chǎn)廠的新建和投產(chǎn)， 為推動我國食品和飲料生 產(chǎn)甜味劑的發(fā)展，與國際食品生產(chǎn)同步奠定了基礎(chǔ)，為我國果葡 糖漿生產(chǎn)趕超國際水平邁出了堅實的一步。二、果葡糖漿生產(chǎn)和消費的發(fā)展特點1、發(fā)展迅猛。自從1975年以來，世界果葡糖漿的產(chǎn)量猛 增了十八倍，從1975年的70萬噸，到2000年已增加到1334 萬噸，25年間的年遞增率達12.5 %。2、 美國果葡糖漿產(chǎn)量占世界總產(chǎn)量的 70%左右。1980年 美國的年產(chǎn)量約 250萬噸，2002年達1084萬噸，凈增8

24、34萬 噸。3、 美國果葡糖漿的消費量最多，占世界消費總量的64%。亞洲除日本和韓國以外， 其他國家和地區(qū)的消費較少。在果葡糖漿的消費中又以果糖濃度 55 %的第二代果葡糖漿最高，與第一 代的42型之間的消費比約為3:2。4、我國果葡糖漿科研生產(chǎn)和消費的情況可以概括為幾句話：起步早、發(fā)展緩慢、產(chǎn)量相對小。 2002年實際產(chǎn)量近120 萬噸，與世界先進國家比，差距甚大，需加快發(fā)展的步伐。世界范圍內(nèi)果葡糖漿迅猛發(fā)展的事實與我國發(fā)展緩慢、產(chǎn) 量小之間的差距，揭示了我國果葡糖漿巨大的發(fā)展空間。三、制約我國果葡糖漿發(fā)展的原因1、傳統(tǒng)生產(chǎn)企業(yè)生產(chǎn)成本高造成果葡糖漿銷售價格高，價 格因素是我國果葡糖漿生產(chǎn)和

25、應(yīng)用不能迅速發(fā)展的重要原因之 一。由于受原料價格較高、技術(shù)與管理水平落后、項目投入資金 量大等多種因素的制約， 果葡糖漿價格一直居高不下， 長期徘徊 在每噸4000多元，產(chǎn)品缺乏市場競爭力，嚴重制約了果葡糖漿 工業(yè)的發(fā)展。果葡糖漿與蔗糖成本比較單位：元/噸表1 4果葡糖漿價格蔗糖價格蔗糖成本美國3700國內(nèi)壟斷，高于果葡糖漿價格5550日本27272200左右1680中國42002200左右40002、對于食品廠而言，用果葡糖漿代替蔗糖還存在一些技術(shù) 改造上的困難，如現(xiàn)有工藝配方需適當(dāng)改變； 原材料庫存設(shè)備和 運輸工具也要投資改造；還有技術(shù)人員和操作工人尚需熟悉和摸 索新材料的特性及利用方法等

26、。我國加入 WTO以來，隨著國際市場的競爭加劇， 國內(nèi)玉米價格持續(xù)走低。其原因一是美國低價優(yōu)質(zhì)玉米大量涌入我國，2002年為585萬噸，關(guān)稅只有1% ;二是玉米出口由于取消每噸44美元的國家標貼，出口受阻；三是庫存暴滿，供大于求，這些對果葡糖漿行業(yè)的發(fā)展是非常有利的。近年來果葡糖漿技術(shù)水平提高，企業(yè)生產(chǎn)規(guī)模擴大，基建投資大幅下降，加上原料玉米價格的下降， 使果葡糖漿與蔗糖的 比價有了優(yōu)勢。玉米價 1000元/噸左右，淀粉成本約 1500元/ 噸，果葡糖漿生產(chǎn)成本僅為 3000元/噸，當(dāng)前正是果葡糖漿、葡 萄糖異構(gòu)酶等行業(yè)發(fā)展的有利時機。四、葡萄糖異構(gòu)酶的國內(nèi)外情況目前國內(nèi)近二十家酶制劑企業(yè)產(chǎn)品

27、中均無固相化葡萄糖異構(gòu)酶，國內(nèi)所使用的葡萄糖異構(gòu)酶全部為丹麥諾維信公司進口產(chǎn)品。根據(jù)中國輕工協(xié)會酶制劑分會提供資料，我國2000-2003年上半年果葡糖漿產(chǎn)量平均以 10%增長，預(yù)計到2005年果葡糖 漿產(chǎn)量為160萬噸，葡萄糖異構(gòu)酶需求量將達到 400噸。近年果葡糖漿、葡萄糖異構(gòu)酶銷售量、需求量及未來年度預(yù)測單位：萬噸 表1 52000 年2001 年2002 年2003 年2005 年預(yù)計2010 年計劃果葡糖漿90100120130160330葡萄糖異構(gòu)酶220250300320400800丹麥諾維信公司在中國投資成立的諾維信（中國）投資有限公司是中國生物技術(shù)領(lǐng)域較大的外商投資公司。諾維

28、信（中國）投資有限公司目前在中國擁有諾維信 （中國）生物技術(shù)有限公司和 諾維信（沈陽）生物加工有限公司兩家全資生產(chǎn)子公司及一家合資 公司。該公司的酶制劑產(chǎn)品廣泛應(yīng)用于淀粉、果蔬汁、啤酒、酒 精、功能食品等行業(yè)，其產(chǎn)品在中國工業(yè)酶制劑市場占有較大的 份額。丹麥諾維信公司酶制劑產(chǎn)品售價昂貴，一定程度上侵害了中國發(fā)酵生產(chǎn)企業(yè)的利益，其葡萄糖異構(gòu)酶目前壟斷國內(nèi)及亞洲 周邊市場，其銷售價約為 38萬元/噸。安徽*生物技術(shù)有限公司“基因重組葡萄糖異構(gòu)酶”產(chǎn)品 的市場優(yōu)勢主要體現(xiàn)在以下幾個方面：1、基因重組葡萄糖異構(gòu)酶的熱穩(wěn)定性高于目前市場上的同 類產(chǎn)品，降低了果葡糖漿生產(chǎn)廠家的生產(chǎn)成本；2、擁有中國科學(xué)技

29、術(shù)大學(xué)及國家“八六三”項目的雙重品牌 優(yōu)勢；3、產(chǎn)品具備高科技含量，擁有完整的自主知識產(chǎn)權(quán)；4、利用阜陽廉價的原材料及勞動力，產(chǎn)品具備價格優(yōu)勢。五、市場預(yù)測果葡糖漿的諸多優(yōu)點使其應(yīng)用前景十分廣闊，尤其是飲料、糕點等食品工業(yè)的理想用糖。國際市場方面，果葡糖漿在西方國家已被廣泛使用，可口可樂、百事可樂等跨國飲料公司在國外大都使用果葡糖漿替代蔗糖作為甜味劑。目前，美國果葡糖漿的消費量已超過蔗糖的消費 量，2002年果葡糖漿消耗量為1084萬噸，而同年蔗糖消耗量僅 為690萬噸；在西歐發(fā)達國家，果葡糖漿使用量已超過蔗糖使用 量的50% ;在亞洲，日本、臺灣和韓國果葡糖漿的生產(chǎn)和消費 也在以較快的速度增

30、加。據(jù)美國Miles公司統(tǒng)計，全世界果葡糖漿產(chǎn)量和葡萄糖異構(gòu) 酶的銷售額逐年上升，2002年葡萄糖異構(gòu)酶的銷售量約為 3000 噸，銷售額達到1億5千萬美元。我國食糖不足，每年要花數(shù)億美元進口。盡管這樣，人均 食糖僅8公斤，不及發(fā)達國家的1/8，僅為世界人均食糖1/4左 右（見表1-3 ）。在糖類中，果葡糖漿具有蔗糖不可比擬的優(yōu)勢： 味甜、成本低、風(fēng)味醇厚、食用后不會引起血糖升高、抑制體內(nèi) 蛋白質(zhì)消耗、低熱量、易吸收、好消化等優(yōu)點。目前我國制糖業(yè) 的落后嚴重影響著食品工業(yè)的發(fā)展，趕超世界果葡糖漿生產(chǎn)和應(yīng)用水平是食品工業(yè)生產(chǎn)的重要任務(wù)之一，也是提升我國食品生產(chǎn)技術(shù)水平和發(fā)展工業(yè)經(jīng)濟的重要舉措之一

31、。因此發(fā)展果葡糖漿生產(chǎn)已引起了國務(wù)院及輕工部的重視，計劃到2010年我國將要達到年產(chǎn)果葡糖漿330萬噸規(guī)模，這將為葡萄糖異構(gòu)酶的市場提供 廣闊的發(fā)展前景。2002韓、日、美、中淀粉糖消費情況表1 6國家淀粉糖果葡糖漿蔗糖產(chǎn)量萬噸人均消耗KG/ 人產(chǎn)量萬噸人均消耗KG/ 人人均消耗KG/ 人韓國9019481018日本22618110924美國14185110843920中國1601.41201.16.5果葡糖漿廣泛應(yīng)用于飲料、糕點、罐頭、乳品等食品行業(yè)， 其中飲料行業(yè)占有相當(dāng)大的比例，如美國達到70%。我國飲料工業(yè)起步較晚，但近年來發(fā)展十分迅速， 銷售額達400多億，全 國飲料總產(chǎn)量保持持續(xù)增

32、長，1980年不足30萬噸，1990年猛 增到330萬噸，到2000年為1491萬噸，20年增長50多倍， 平均年增長速度為 21.8%，進入2001年達到1669萬噸，比2000 增長11.94%，繼續(xù)保持兩位數(shù)的增長速度，是食品工業(yè)發(fā)展最 快的行業(yè)之一。依照國際慣例，稱之為果汁型飲料的飲品，其果糖含量必 須在11.7%以上，目前國內(nèi)以“農(nóng)夫果園” “健力寶”為代表的大型 飲料生產(chǎn)企業(yè)，均開始在飲料中添加果葡糖漿。近幾年國內(nèi)飲料實際產(chǎn)量及預(yù)測表1 780年90年2000 年2001 年2002 年2003 年2005 年預(yù)計軟飲料產(chǎn)量3033014911669242527883688其中:含

33、糖飲料1000121513971847由以上數(shù)據(jù)及分析可以看出，由于國內(nèi)果葡糖漿市場的迅猛成長，帶動葡萄糖異構(gòu)酶的銷量年年攀升，目前國內(nèi)葡萄糖異構(gòu)酶的年消耗量約在 300噸左右，并以每年10%的速度遞增，預(yù) 計到本項目建成投產(chǎn)時，市場年需求量將超過400噸。六、市場開發(fā)情況目前安徽*生物技術(shù)有限公司已與蚌埠明星果糖有限責(zé) 任公司（原蚌埠果糖廠）、安徽豐原集團有限公司等企業(yè)進行了 良好的溝通及合作，并初步達成基因重組葡萄糖異構(gòu)酶的購買及 使用意向（附件4-5 ）。同時，世界上最大的果葡糖漿生產(chǎn)廠家美國嘉吉（Gargill）公司也對*公司的基因重組葡萄糖異構(gòu)酶產(chǎn)品產(chǎn)生濃厚的興趣， 近期正與*公司接

34、洽，希望成為其合作伙伴及該產(chǎn)品在美國的銷 售總代理。七、結(jié)論由以上分析可見，基因重組葡萄糖異構(gòu)酶項目具有十分廣闊的市場前景。本項目建成投產(chǎn)后，可年產(chǎn)葡萄糖異構(gòu)酶 300噸， 基本可滿足國內(nèi)市場的需求量， 待產(chǎn)品市場逐步打開后，完全有 能力覆蓋亞洲周邊市場并出口歐美市場。第二章項目的技術(shù)基礎(chǔ)固定化葡萄糖異構(gòu)酶是生產(chǎn)果葡糖漿的生物催化劑。葡萄 糖異構(gòu)酶（GI）又稱木糖異構(gòu)酶（Xyl） （EC 531.5），能將D- 木糖、D-葡萄糖、D-核糖等醛糖轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的酮糖。因葡萄糖異 構(gòu)酶結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，是國際上公認的研究酶的催化機制及建立蛋白質(zhì) 工程技術(shù)的最好模型之一。 工業(yè)上，葡萄糖異構(gòu)酶是大規(guī)模從淀 粉制

35、備果葡糖漿的關(guān)鍵酶。 隨著我國食品工業(yè)的迅速發(fā)展，果葡糖漿在國內(nèi)的市場增長迅猛， 對葡萄糖異構(gòu)酶的需求也在不斷增 加。由于其重要的經(jīng)濟價值和理論研究意義，美國、日本、英國、法國、比利時、荷蘭等發(fā)達國家對該酶的性質(zhì)、固定化工藝、基 因工程、晶體學(xué)以及蛋白質(zhì)工程等進行了廣泛深入的研究。本項目主要技術(shù)原理為：利用基因工程技術(shù)改造已獲得的 7 號淀粉酶鏈霉菌 M1033的葡萄糖異構(gòu)酶結(jié)構(gòu)基因，通過基因突 變的方法改變葡萄糖異構(gòu)酶的熱穩(wěn)定性，采取基因敲除和基因置換的方法對7號淀粉酶鏈霉菌M1033的染色體進行改造引入優(yōu) 勢突變位點，獲得性能改良、穩(wěn)定遺傳的適于工業(yè)化生產(chǎn)的基因 工程菌株，從而應(yīng)用于葡萄糖

36、異構(gòu)酶的大規(guī)模生產(chǎn)。國內(nèi)自六十年代起已開展了葡萄糖異構(gòu)酶應(yīng)用于果葡糖漿 生產(chǎn)的研究，山東省食品發(fā)酵工業(yè)研究設(shè)計院通過誘變篩選獲得 的7號淀粉酶鏈霉菌M1033菌株，是國內(nèi)在這方面最具應(yīng)用價值的工業(yè)菌之一。目前國內(nèi)外主要是通過誘變篩選等手段來獲得 生產(chǎn)用菌株，中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院是國內(nèi)唯一開展葡 萄糖異構(gòu)酶的蛋白質(zhì)工程的研究單位，并對葡萄糖異構(gòu)酶的催化 機理及其蛋白質(zhì)工程進行了多年的研究和探索。經(jīng)十余年科技攻關(guān)目前已完成葡萄糖異構(gòu)酶的蛋白質(zhì)工程改造，獲得性質(zhì)改良的基因重組葡萄糖異構(gòu)酶；并利用基因工程方法構(gòu)建表達量極高的 基因重組鏈霉菌工業(yè)生產(chǎn)菌株，獲得了具有完整自主知識產(chǎn)權(quán)的 同源重組基

37、因工程菌 M1033WZ。所建立的葡萄糖異構(gòu)酶蛋白質(zhì) 工程研究系統(tǒng)在完整性和有效性上都達到國際先進水平，在國內(nèi)處于領(lǐng)先水平。在該課題的研究過程中，項目組在國內(nèi)外知名刊物發(fā)表學(xué) 術(shù)論文十余篇（附件 4-15，4-16），并獲得安徽省高等學(xué)校科學(xué) 技術(shù)進步獎及安徽省優(yōu)秀論文獎（附件4-17）。第一節(jié)成果來源及知識產(chǎn)權(quán)情況中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院獨立承擔(dān)國家“八六三”項目 “葡萄糖異構(gòu)酶的蛋白質(zhì)工程”（附件4-14），歷經(jīng)十余年聯(lián)合科技 攻關(guān)目，前已完成葡萄糖異構(gòu)酶的蛋白質(zhì)工程改造，獲得性質(zhì)改良的基因重組葡萄糖異構(gòu)酶； 并利用基因工程方法構(gòu)建高表達量 的基因重組鏈霉菌工業(yè)生產(chǎn)菌株， 獲得了具有自

38、主知識產(chǎn)權(quán)的同 源重組基因工程菌 M1033WZ。中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)根據(jù)學(xué)校知識 產(chǎn)權(quán)管理規(guī)定，經(jīng)慎重研究，決定將基因重組葡萄糖異構(gòu)酶技術(shù) 所有權(quán)作價175萬元人民幣作為學(xué)校投資投入中國科學(xué)技術(shù)大 學(xué)科技實業(yè)總公司。（見附件4-11）2003年2月28日，中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)科技實業(yè)總公司以合 資成立安徽*生物技術(shù)有限公司補充協(xié)議的形式，將基因重組 葡萄糖異構(gòu)酶技術(shù)以177萬元人民幣的價格向合資公司轉(zhuǎn)讓，其中50萬元按國家及學(xué)校有關(guān)政策獎勵給相關(guān)技術(shù)團隊成員。轉(zhuǎn) 讓后，基因重組葡萄糖異構(gòu)酶技術(shù)的所有權(quán)歸安徽*生物技術(shù)有限公司所有。（見附件4-12、附件4-13）第二節(jié)已完成研究開發(fā)工作及鑒定、中試情

39、況一、背景資料葡萄糖異構(gòu)酶（Glucose Isomerase，簡稱GI）結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，是國際上公認的研究酶的催化機制及建立蛋白質(zhì)工程技術(shù)的最 好模型之一。利用基因工程和蛋白質(zhì)工程的方法改造野生型葡萄 糖異構(gòu)酶不僅具有理論研究意義而且具有重要的經(jīng)濟價值，在異構(gòu)化反應(yīng)中，溫度提高，熱力學(xué)平衡趨向于果糖方面，因此提高 野生型葡萄糖異構(gòu)酶的熱穩(wěn)定性可以增加反應(yīng)平衡過程中果糖 的產(chǎn)量，從而降低投入酶量，簡化工藝流程，提高經(jīng)濟效益。基因的同源重組技術(shù)( homologous recomb in ati on )，又稱 基因打靶(gene targeting )，指外源DNA與受體細胞染色體 DNA 上的同源

40、序列之間發(fā)生重組并整合在預(yù)定位點上，從而改變細胞遺傳特性的方法。根據(jù)重組后靶基因的特征可以分為兩種類型：1、由于外源序列的引入或部分取代，靶基因原有結(jié)構(gòu)被破壞， 此即為基因破壞或剔除(gene disruption or knockout)； 2、靶 基因的全部序列為新的基因所取代，即基因置換(gene replacement)。這一新興技術(shù)已被證明為目前能精確的修飾基因 組的最有效方法，從理論上講它將使人類能按設(shè)計對極其復(fù)雜的 細胞基因組結(jié)構(gòu)進行定點、定量的改變，從而定向的改變細胞的遺傳結(jié)構(gòu)和特征。本項目在國內(nèi)首次將基因重組技術(shù)應(yīng)用于葡萄糖異構(gòu)酶的 研究和生產(chǎn)，其技術(shù)特性及所建立的葡萄糖異構(gòu)

41、酶蛋白質(zhì)工程研 究系統(tǒng)均達到國際先進水平，所獲得的基因重組葡萄糖異構(gòu)酶適用于果葡糖漿的大規(guī)模生產(chǎn)，將從根本上改變我國葡萄糖異構(gòu)酶生產(chǎn)的落后狀態(tài)。二、成果的專利情況目前項目共獲得 3項國家發(fā)明專利：SM33GI的突變酶 GIG138P 及一種提高GI熱穩(wěn)定性的突變方案”(專利號 ZL95112782.9 )、“一種葡萄糖異構(gòu)酶的 247位單突變體酶和 138，247位雙突變體酶及其構(gòu)建方法”(專利號ZL97119714.8 )、“表達M1033GI的突變酶 GIG138P的基因工程菌株 M1033WZ 及其構(gòu)建方法”（專利號：ZL02143031.4），其中“表達M1033GI 的突變酶GIG1

42、38P的基因工程菌株 M1033WZ及其構(gòu)建方法” 已獲得PCT國際專利受理。（見附件4-6、4-7、4-8、4-9、4-10、 4-11）二、成果鑒定及中試情況該項技術(shù)在2003年3月安徽省科技廳組織召開專項科學(xué)技 術(shù)成果鑒定會上通過專家評審，認為“該課題采用的技術(shù)方法先 進，技術(shù)路線正確，研究成果達到國內(nèi)領(lǐng)先水平。建議盡快實現(xiàn) 產(chǎn)業(yè)化?！蓖瑫r獲得安徽省科技廳頒發(fā)的科學(xué)技術(shù)成果鑒定證書（2003年第030號）以及高新技術(shù)成果認定證書（2003-001 號）。（見附件4-2、4-3）2002年10月28日至12月28日，中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)生命 科學(xué)學(xué)院委托蚌埠明星果糖有限責(zé)任公司（原蚌埠果糖廠）

43、進行固定化葡萄糖異構(gòu)酶大柱轉(zhuǎn)化實驗。經(jīng)實驗，在68 C轉(zhuǎn)化溫度及pH值7.5條件下，單柱一次投入成品固定化葡萄糖異構(gòu)酶93公斤（含水15.7% ），經(jīng)過60天轉(zhuǎn)化共計生產(chǎn)出成品果葡糖漿 408.3噸，平均轉(zhuǎn)化能力為4.39噸成品果葡糖漿/公斤酶，轉(zhuǎn)化 率為52%。產(chǎn)品的各項性能指標在國內(nèi)屬先進水平，可以用于 果葡糖漿的大規(guī)模生產(chǎn)。（見附件4-4 ）四、產(chǎn)品技術(shù)指標及與國內(nèi)外同類產(chǎn)品比較1、產(chǎn)品技術(shù)、質(zhì)量指標本項目產(chǎn)品將在滿足中華人民共和國國家標準食品添加劑-固定化葡萄糖異構(gòu)酶制劑(GB 8274-87 )的基礎(chǔ)上，全面提 高葡萄糖異構(gòu)酶各項性能指標，并逐步形成企業(yè)標準。產(chǎn)品的主要性能指標序號項

44、 目理化指標1酶活力(60 目)6000單位2形狀不規(guī)則桿狀，直徑1.2mm3色澤棕色4含水12-18%5比重0.45kg/l6膨脹率2.5倍7轉(zhuǎn)化能力4.2-4.5噸成品糖漿/公斤成品酶8保存性0-5 C下保藏3個月，酶活損失10%左右9最適pH7.510熱穩(wěn)定性最適反應(yīng)溫度68 C11金屬離子影響Cu2+、Fe2+、Ca2+對酶活力發(fā)揮不力；Mg2+、Co2+可促進轉(zhuǎn)化2、與國內(nèi)、外同類產(chǎn)品技術(shù)指標比較本項目產(chǎn)品系國內(nèi)首創(chuàng)，填補國內(nèi)空白，國內(nèi)目前無同類產(chǎn)品?，F(xiàn)將該成果技術(shù)參數(shù)與丹麥諾維信公司的同類產(chǎn)品Sweetzyme ?IT進行比較如下：序號指標名稱單位Sweetzyme ?IT基因重組

45、葡萄糖異構(gòu)酶1活力UGI350060002熱穩(wěn)定性55-60最適反應(yīng)溫度68 C3PH7.6-7.87.54轉(zhuǎn)化能力噸成品糖漿/公斤酶54.2-4.5第三節(jié)成果的創(chuàng)新之處本項目是國家“ 863 ”計劃項目“葡萄糖異構(gòu)酶的蛋白質(zhì)工程” 的重要成果之一，解決了提高葡萄糖異構(gòu)酶的熱穩(wěn)定性和酶活力 的難題，并為基因重組葡萄糖異構(gòu)酶的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)打下堅實基 礎(chǔ)，擁有多項我國自主的知識產(chǎn)權(quán)，創(chuàng)新性強，技術(shù)水平高，難 度大，許多成果在國際上居于領(lǐng)先地位。根據(jù)查新報告（見附件 4-1），本項目的主要創(chuàng)新點和技術(shù)難點如下：1、雙突變體酶 GI（ G138P-G247D的構(gòu)建技術(shù)雙突變體酶的構(gòu)建，使困擾葡萄糖異構(gòu)酶

46、研究和生產(chǎn)領(lǐng)域多 年的野生型菌株所產(chǎn)的葡萄糖異構(gòu)酶熱穩(wěn)定性和酶活力難以充 分滿足需要的難題得以解決， 為利用基因工程技術(shù)改造葡萄糖異 構(gòu)酶創(chuàng)造了條件。這一成就在國際上處于領(lǐng)先地位，并已申報國家發(fā)明專利。2、利用基因敲除和置換精確修飾鏈霉菌染色體技術(shù)本項目利用同源重組技術(shù)，把帶有篩選基因的質(zhì)粒片斷的堿 變性形式作為同源重組單元引入野生型M1033染色體DNA的特定片段上，敲除了原有的GI基因。再通過雙抗性負篩選的方法， 引入目的基因，并隨染色體 DNA的復(fù)制而穩(wěn)定復(fù)制。3、雙抗性負篩選(tsr + neo )方法的運用首先構(gòu)建帶有neo抗性的置換型同源重組質(zhì)粒，通過neo抗性的負篩選來解決鏈霉菌

47、基因置換時篩選工作量大的問題。由于同源片斷較小，同時又為了保證較高的轉(zhuǎn)化率， 直接將同源重組 質(zhì)粒的堿變性形式作為同源重組單元轉(zhuǎn)化缺陷型M1033原生質(zhì)體，獲得插入型同源重組的GI酶活恢復(fù)菌株，再以該菌株為出發(fā) 菌株，利用插入型同源重組質(zhì)粒在染色體上的不穩(wěn)定性，通過結(jié)合tsr抗性的負篩選最終獲得基因置換菌株。此新方法在鏈霉菌染色體研究領(lǐng)域中尚未見報導(dǎo)。4、 構(gòu)建具有自主知識產(chǎn)權(quán)的基因工程菌株M1033WZ經(jīng)過十余年的努力構(gòu)建出的具有完整自主知識產(chǎn)權(quán)的基因 工程菌株M1033WZ，現(xiàn)已被中國微生物菌種保藏管理委員會保藏，是我國利用蛋白質(zhì)工程改造葡萄糖異構(gòu)酶重要成果之一，標 志著我國在這個領(lǐng)域的研

48、究已經(jīng)跨入世界先進行列。表達M1033GI的突變酶 GIG138P的基因工程菌株 M1033WZ及其構(gòu) 建方法”已經(jīng)申請國家發(fā)明專利，并已獲得 PCT國際專利受理。5、 雙突變體的鏈霉菌基因工程菌株M1033XT的構(gòu)建運用同源重組單交換和雙抗性負篩選技術(shù)，構(gòu)建出具有雙突 變點的 GI( G138P-G247D )基因的 7號鏈霉菌基因工程菌株 M1033XT，使M1033XT所產(chǎn)的葡萄糖異構(gòu)酶的各項主要性能均 優(yōu)于野生型 M1033所產(chǎn)的葡萄糖異構(gòu)酶，為發(fā)展我國自己的基 因重組葡萄糖異構(gòu)酶產(chǎn)業(yè)，推動我國果葡糖漿產(chǎn)業(yè)的發(fā)展奠定了 基礎(chǔ)。該項成果正在申報國家發(fā)明專利。6、建立了 一套完整的蛋白質(zhì)工

49、程技術(shù)，提咼了我國蛋白質(zhì)工程的研究水平鏈霉菌中染色體的分子改造，利用單交換和雙交換模式獲得 兩組不同的M1033GI缺陷型菌株，再利用基因置換方法構(gòu)建突 變體基因工程菌株，將突變位點精確引入M1033染色體中，是葡萄糖異構(gòu)酶領(lǐng)域國際上首次利用基因敲除和置換精確修飾鏈 霉菌染色體構(gòu)建基因工程菌株的范例，建立了一套完整的蛋白質(zhì)工程技術(shù)，提高了我國蛋白質(zhì)工程的研究水平。第三章建設(shè)方案第一節(jié) 項目的產(chǎn)能規(guī)模及建設(shè)的主要內(nèi)容安徽*生物技術(shù)有限公司年產(chǎn) 300噸基因重組葡萄糖異 構(gòu)酶項目選址為阜陽市經(jīng)濟技術(shù)開發(fā)區(qū)，建設(shè)嚴格遵照工程優(yōu) 質(zhì)、布局合理、技術(shù)超前、生產(chǎn)環(huán)保的方針進行。具體建設(shè)內(nèi)容如下：1、新征土

50、地11782.7平方米；2、建設(shè)新型標準廠房 3000平方米（包括發(fā)酵車間、固定 化車間、分裝車間）；3、新建與生產(chǎn)相適應(yīng)的動力配套設(shè)施（空壓站、變電所）4、研發(fā)及品控中心樓 1500平方米，一方面實施新產(chǎn)品的 開發(fā)和新技術(shù)的應(yīng)用研究，另一方面加強對原料、半成品及終端 產(chǎn)品進行全質(zhì)量檢驗和控制；5、綜合辦公樓1500平方米（含經(jīng)營管理，廣告銷售部門， 企劃部門等）。第二節(jié)采用的工藝技術(shù)路線與技術(shù)特點一、工藝技術(shù)來源及先進性基因重組葡萄糖異構(gòu)酶的生產(chǎn)主要包括菌種的擴培、發(fā)酵、 絮凝、脫水、混合、成型、交聯(lián)、干燥、貯藏等過程，其工藝技 術(shù)及設(shè)備的先進性主要體現(xiàn)如下：1、因置換型鏈霉菌基因工程菌株

51、M1033WZ勺構(gòu)建，實現(xiàn)了基因重組葡萄糖異構(gòu)酶熱穩(wěn)定性的提高，從而在工藝上可提高反應(yīng)溫度10C左右，進而提高果葡糖漿的產(chǎn)量15%2、 適合工業(yè)化培養(yǎng)基篩選及中試規(guī)模發(fā)酵； 摸索出基因工 程菌株M1033W三級高密度發(fā)酵培養(yǎng)基配方， 可以在較大程度上 降低生產(chǎn)技術(shù)。3、固定化葡萄糖異構(gòu)酶的制備， 采取自行研制的高分子交聯(lián)劑和戊二醛結(jié)合，可提高固相化酶的通透性和固相化程度，從而進一步提高轉(zhuǎn)化能力。4、 目前選用的主體發(fā)酵及自動化控制設(shè)備先進合理，與三級高密度發(fā)酵工藝和固相化工藝緊密結(jié)合，可在最大程度上提高產(chǎn)品質(zhì)量和生產(chǎn)效益。二、生產(chǎn)工藝流程1、工藝流程生產(chǎn)過程將嚴格按照IS09000質(zhì)量管理體系

52、并參照 GMP生產(chǎn)管理體系進行生產(chǎn)。其生產(chǎn)工藝流程示意圖如下：菌種：基因工程菌株 M1033WZ ;平皿分離：37 C培養(yǎng)3天，菌落隆起，周邊白色， 中心鉛灰；茄子瓶培養(yǎng)：37 C培養(yǎng)2天，抱子長滿后置于冰箱 保藏備用； 3000升種子罐培養(yǎng)：培養(yǎng)基加堿液調(diào)至 pH7.2-7.5 , 滅菌冷卻后接入25個茄子瓶抱子懸浮液，通氣比 1:0.25-0.35 , 轉(zhuǎn)速250轉(zhuǎn)/分鐘，罐壓0.5Kg/cm 2, 37 C培養(yǎng)20-22小時，至 種子萌發(fā)正常，鏡檢無污染；30000升發(fā)酵罐培養(yǎng)：培養(yǎng)基加堿液調(diào)至 pH7.2-7.5 ,滅菌冷卻后移進種子液，通氣比1:0.35-0.45，轉(zhuǎn)速180轉(zhuǎn)/分鐘

53、，罐壓0.5Kg/cm 2, 37 C培養(yǎng)40-50小時，至鏡檢菌絲無明 顯斷裂或自溶；(6)熱處理：先向發(fā)酵罐中加入 600g CoCi 26H2O,然后 盤管進汽升溫至70 C,保溫10分鐘后，速冷卻至水溫；(7 )絮凝：用酸調(diào)發(fā)酵液的 pH至6.0，邊攪拌邊加入殼 聚糖溶液，至完全絮凝。在pH6.0時，殼聚糖中的氨基能與蛋白 質(zhì)上的羧基進行縮和而牢固地結(jié)合在一起迅速凝聚下來；脫水：用板框壓濾機壓濾 3小時后(含水約85%), 再用離心機甩干得含水 70 %左右的酶泥絮凝物；混合：按酶泥絮凝物：明膠溶化液=2:1混合，拌勻后 過篩板，再加少量戊二醛溶液作前交聯(lián)；(10 )成型交聯(lián)浸泡：目前

54、采用間歇筒式擠壓成型設(shè)備，篩板孔徑1.2mm，成型后的固定化酶在成型液中浸泡2小時。并用稀堿保持PH7.0-7.5 ； 洗滌：用自來水浸泡洗滌2小時，每隔20分鐘換 新水，并用稀堿保持PH7.0-7.5 ； 干燥：離心機將濕酶甩至含水約 60 %左右，置納倫 篩上于45 C下熱風(fēng)干燥，并不斷翻動，至含水 15 %左右，取出 并測酶活。 分裝貯藏：待產(chǎn)品固定化酶涼透后，裝入10公斤 塑料袋中，封入紙箱。0 4 C條件下貯藏。第三節(jié) 主要設(shè)備選型本項目設(shè)備選型原則為選用國內(nèi)先進生產(chǎn)設(shè)備，部分關(guān)鍵 生產(chǎn)設(shè)備和檢測設(shè)備選用進口先進設(shè)備。 選用的設(shè)備具有較高的 自動化水平，實現(xiàn)生產(chǎn)過程技術(shù)參數(shù)的程序化控

55、制，減少人為因素干擾。主要設(shè)備包括菌種培養(yǎng)及化驗部分、發(fā)酵系統(tǒng)、后提取系統(tǒng)、動力系統(tǒng)及其它配套設(shè)備。詳見下表。主要設(shè)備表序號名稱規(guī)格數(shù)量產(chǎn)地金額1.1超凈工作臺10000 級4臺上海智城分析儀器制造有限公司4.01.2恒溫震蕩器200-300rp4臺上海精密儀器儀表有限公司2.41.3火菌鍋50L2臺上海智城分析儀器制造有限公司0.81.4低溫冰箱-86 C1臺日本三洋科研醫(yī)療1.2一、菌種培養(yǎng)及化驗部分單位：萬元設(shè)備(北京)1.5恒溫培養(yǎng)箱6002 X7102臺上海精密儀器儀表有限公司1.21.6分光光度計722型1臺上海精密儀器儀表有限公司0.61.7旋光儀Wzz1臺上海精密儀器儀表有限公

56、司0.41.8恒溫干燥箱5002 X5502臺上海精密儀器儀表有限公司1.01.9恒溫水浴鍋4孔2臺上海精密儀器儀表有限公司0.61.10電子分析天平Fa1004-0.1mg2臺上海精密儀器儀表有限公司0.81.11PH計PHS-3C +2臺瑞士萬通(Metrohm)0.61.12普通顯微鏡BK10002臺上海精密儀器儀表有限公司0.6合計14.2二、發(fā)酵系統(tǒng)序號名稱規(guī)格數(shù)量產(chǎn)地金額2.1配料罐5m32臺七0二研究所二0工廠18.020m33臺七0二研究所二0工廠52.022水解罐5m34臺七0二研究所二0工廠32.020m34臺七0二研究所二0工廠76.02.3種子罐系統(tǒng)5m35臺七0二研究

57、所二0工廠65.02.4發(fā)酵罐系統(tǒng)30m310臺七0二研究所二0工廠850.0罐體1Cr18Ni12T尼.4*7.7* 別2攪拌1Cr18Ni1.2T機00，三層槳葉，一層消泡槳咼效冷卻管1Cr18Ni6組栢0，列管排列外冷卻夾套A3鋼3組30mm*1.2m2.5管路閥門系統(tǒng)若干七0三研究所三0工廠200.02.6減速機SEW15臺德國SEW60.02.7變頻儀總?cè)荩?00KVA15臺日本明電舍集團75.02.8PH儀PH:1 1420套瑞士萬通(Metrohm)32.02.9DO儀20套瑞士萬通(Metrohm)34.02.10溫度儀0150 C15套上海精密儀器儀表有限公司1.82.11空

58、氣流量計20 1000m315套上海精密儀器儀表有限公司5.02.12觸摸顯示器15臺臺灣宇崝企業(yè)有限公司5.62.13PLC15臺德國 SIMENSE3.82.14蒸汽過濾器Z15臺上海過濾器廠1.0Z310臺上海過濾器廠2.22.15空氣總過濾器GB-B1-704臺上海過濾器廠4.02.16空氣預(yù)過濾器GB-B2-7 2010臺上海過濾器廠6.0GB-B2-3 X105臺上海過濾器廠6.02.17空氣精過濾器GB-NB-7 2010臺上海過濾器廠10.0GB-NB-3 05臺上海過濾器廠8.0合計1547.4三、后提取系統(tǒng)序號名稱規(guī)格數(shù)量產(chǎn)地金額3.1絮凝罐30m35臺七0二研究所二0工廠

59、94.03.2板框過濾機70m210臺徐州強力過濾機械有限公司45.03.3離心機MDR-1505臺江蘇賽德力制藥機械制造有限公司32.03.4攪拌機0.5m 32臺江蘇賽德力制藥機械制造有限公司6.43.5造粒機2臺無錫堰橋化工染整設(shè)備廠1.23.6洗滌機2臺無錫堰橋化工染整設(shè)備廠1.53.7軸流干燥系統(tǒng)1套無錫堰橋化工染整設(shè)備廠15.03.8真空自動包裝機2臺上海創(chuàng)靈包裝機械制造有限公司10.23.9濾布洗滌機2臺無錫堰橋化工染整設(shè)備廠1.8合計207.1四、動力系統(tǒng)序號名稱規(guī)格數(shù)量產(chǎn)地金額4.1變壓器800KVA2臺江蘇華朋集團有限公司32.0100KVA1臺江蘇華朋集團有限公司8.04

60、.2空壓機40m33臺江西壓縮機有限責(zé)任公司45.020m31臺江西壓縮機有限責(zé)任公司10.010m31臺江西壓縮機有限責(zé)任公司8.04.3冷卻塔100m310臺江蘇天香集團有限公司50.04.4純水設(shè)備5T/h2臺濟南歐瑪環(huán)?？萍加邢薰?2.04.5冷水機組0 20 C2臺日本日立76.04.6空氣冷卻器50m22臺江西壓縮機廠7.64.7油水分離器600*25002臺江西壓縮機廠2.84.8空氣加熱器20m21臺江西壓縮機廠3.24.9電機132KW3臺江蘇長城電器集團股份有限公司5.475KW11臺江蘇長城電器集團股份有限公司11.022KW5臺江蘇長城電器集團股份有限公司1.515K