復方五仁醇膠囊保肝作用的血清藥理學研究

1、復方五仁醇膠囊保肝作用的血清藥理學研究【摘要】目的：建立復方五仁醇膠囊血清藥理學研究方法。方法：建立l4誘導的原代培養(yǎng)大鼠肝細胞損傷模型，大鼠為含藥血清供體，以含藥血清對損傷肝細胞增殖TT法及丙氨酸氨基轉移酶ALT泄漏的影響兩個指標，結合含藥血清中五味子乙素的含量測定，分別采用單因素考察、多因素的正交試驗，優(yōu)選含藥血清的制備方法，并確定體系中血清添加量。結果：每天以成人等效劑量10倍的甲醇提取物間隔8h分兩次給正常大鼠灌胃給藥，連續(xù)3天，末次給藥后2h采血制備含藥血清比擬合理，體系中參加10%該條件下制備的含藥血清能明顯進步損傷肝細胞的增殖才能、降低細胞ALT泄漏。結論：適宜條件下制備的復方五

2、仁醇膠囊含藥血清對肝細胞損傷具有明顯的保護作用，血清藥理學研究方法可以用于該制劑的藥效評價?！娟P鍵詞】復方五仁醇膠囊；保肝作用；含藥血清；血清藥理學Abstratbjetive：Testablishaserupharalgytestingethdfrpundurenhunapsules().ethds：delfl4-induedinjuryfpriaryulturehepatyteasestablishedandratasusedasthednrtprepareseruntaining.ithhepatyteinreent(TT),alanineaintransferase(ALT)inell

3、ultureediuandthententfshisandrininseruasindies,single-fatrinvestigatinandultiple-fatrrthgnalexperienterearriedut,usingserurplasa,andseruntainingdruginulturesystefdifferentnentratinnpharalgialeffetandtsreenfthepreparativeethdfseruntainingdruganditssuitablenentratininulturesyste.Results：Nralratsasthed

4、natrfseru,usingethanliextratf,10tiesequivalentdsefradultseveryday,intragastriadinistratintieadayf8-hurinterval,keepingn3days,hespasiaafter2hursfthelastadinistratinasthebetterpreparativeethdftheseruntainingdrug.Adding10%fthisserutulturesysteuldelevatehepatyteinreentanddepressALTinellultureediusignifi

5、antly.nlusin：Seruntainingpreparedbysuitableethdpssessesanbviusprtetiveeffetninjuredhepatyteandserupharalgyanbeappliedtevaluatedthepharalgialeffetf.Keyrdspundurenhunapsules();Liverprtetin;Seruntainingdrug;Serupharalgy中藥“血清藥理學是指在動物經(jīng)口服給藥一段時間后采血別離血清，用此含藥血清進展體外藥理實驗的一種實驗方法，該方法作為中藥研究的新思路和新方法而倍受推崇。復方五仁醇膠囊是我

6、院研制的以五味子為君藥的治療慢性肝炎的科研制劑，我們對該制劑進展了“血清藥理學研究的方法學討論。1材料與方法1.1材料1.1.1動物SD大鼠，SPF級，體重23019.8g，雌雄不拘，由南通大學實驗動物中心提供。1.1.2試劑與試藥羥乙基哌嗪乙磺酸香港FAR公司；乙二醇雙(2-氨基乙醚)四乙酸美國ARES公司分裝；膠原酶IV美國Siga公司分裝；胰蛋白酶美國Siga公司分裝；DE培養(yǎng)基美國GIB公司；新西蘭新生小牛血清美國Hylne公司；四氯化碳宜興市第二化學試劑廠；溴化3-(4,5-二甲基噻唑)-2,5-二苯基四氮唑藍TT，ARES公司；五味子乙素中藥固體制劑制造技術國家工程研究中心；復方五

7、仁醇膠囊本院自制。1.1.3儀器HERAell2培養(yǎng)箱德國GbH公司；BI-TEK340酶標儀美國Siga公司；日立7170全自動生化分析儀日本日立公司；Agilent1100Series高效液相色譜儀美國Agilent公司。1.2方法1.2.1大鼠灌胃用藥物的處理取復方五仁醇膠囊內(nèi)容物，加0.5%-Na制成混懸液。另取復方五仁醇膠囊內(nèi)容物，甲醇回流提取，加0.5%-Na制成混懸液。1.2.2肝細胞的別離與培養(yǎng)按文獻1方法別離大鼠肝細胞，并以1105/2接種于96孔及48孔培養(yǎng)板中，置2培養(yǎng)箱5237培養(yǎng)。1.2.3含藥血清制備方法考察給藥形式及劑量考察取SD大鼠20只，隨機分成5組制劑原形組

8、，提取物小劑量、中劑量、大劑量組和空白組，每組4只，禁食12h。制劑原組組每天按照成人臨床等效劑量的10倍分兩次灌胃制劑混懸液，提取物小劑量、中劑量和大劑量組同法分別灌胃5、10和20的提取物混懸液，連續(xù)給藥3天，末次給藥后1h頸總動脈取血，4過夜，別離血清，空白組每天0.5%-Na灌胃，同法制備空白血清。取培養(yǎng)24小時的肝細胞，吸棄上清液，隨機分成6組正常對照組，模型對照組，制劑原形組，提取物小劑量、中劑量、大劑量組，每組設6個復孔。除正常對照組外，每孔參加含l4的DE及相應含藥血清模型對照組為空白血清，l4和血清的終濃度分別為10l/L和10，正常組相應參加DE培養(yǎng)液和空白血清。作用24h

9、后，搜集48孔板中培養(yǎng)上清液檢測ALT。96孔板中每孔參加5g/l的TT液20l，繼續(xù)孵育4h，每孔再參加DS200l，振蕩后，用酶標儀于波長570n測吸光值A。1.2.4含藥血清制備方法考察其他條件的正交試驗考察以動物是否造模、給藥間隔時間、取血時間、取血成分為考察因素，每個因素設2個程度見表1，選用L8(27)正交表安排試驗。取SD大鼠32只，隨機分成8組，每組4只，其中肝損傷模型大鼠給藥前24h腹腔注射l41.0l/kg。各組每天按照成人臨床等效劑量的10倍分兩次灌胃提取物混懸液，末次頸總動脈取血，血漿組血液立即離心別離血漿，血清組血液4過夜，別離血清。取培養(yǎng)24h的肝細胞，吸棄上清液，

10、隨機分成8組，分別用以上制得的含藥血清血漿按1.2.3相應方法處理，測定ALT及吸光值A。按文獻方法2制備對照品及含藥血清血漿供試品溶液，注入液相色譜儀，測定五味子乙素含量。1.2.5體系中含藥血清添加量考察取培養(yǎng)24h的肝細胞，棄上清液，隨機分成6組正常對照組，模型對照組，5%、10%、20%、40%含藥血清組，每組設6個復孔。模型對照組和各含藥血清組更換為參加l410l/L的DE培養(yǎng)液，正常對照組相應參加DE培養(yǎng)基，正常對照組和模型對照組參加終濃度為10的空白血清，各含藥血清分別組參加按1.2.4中正交試驗1號方案制備的含藥血清，使終濃度分別為5%、10%、20%和40%。作用24h后，按

11、1.2.3相應方法處理，測定ALT及吸光值A。轉貼于論文聯(lián)盟.ll.1.2.6統(tǒng)計學方法使用Stata7.0統(tǒng)計軟件包進展數(shù)據(jù)處理。數(shù)據(jù)以xs表示，用方差分析處理數(shù)據(jù)。2結果2.1含藥血清制備方法考察：給藥形式及劑量考察與正常對照組相比，模型對照組TT值顯著下降P0.01、ALT顯著升高P0.01，說明造模獲得成功；與模型對照組比擬，除提取物小劑量組TT值無顯著差異外P0.05，其余各試驗組TT值均明顯升高P0.01或P0.05，ALT明顯下降P0.01或P0.05；與提取物中劑量組比擬，等劑量灌胃制備的制劑原形組TT值及ALT差異均無統(tǒng)計學意義P0.05。結果提示，制劑的甲醇提取物與制劑原形

12、具有等效性，且3個劑量組不存在明顯的量效關系。故確定以成人臨床等效劑量10倍的甲醇提取物給大鼠灌胃制備含藥血清。見表2。2.2含藥血清制備方法考察：其他條件的正交試驗考察將各試驗組3個指標的測定結果分別按百分制轉換成積分TT、五味子乙素以最高為100，ALT以倒數(shù)計算，最高為100，綜合加權評分TT、ALT、五味子乙素分別占35%、35%和30%后進展統(tǒng)計分析。結果見表3。方差分析結果顯示，因素取血時間對結果有極顯著影響P0.01，B因素給藥間隔時間有顯著影響P0.05，且兩者之間存在交互作用B之P0.05，交互作用分析顯示最正確組合為B11，血漿的影響優(yōu)于血清，但無統(tǒng)計學意義P0.05，而動

13、物是否造模幾乎沒有影響見表4。因此，含藥血清制備方法可定為A1B11D1，即每天間隔8h給正常大鼠灌胃給藥2次，連續(xù)3天，末次給藥后2h取血別離血清。2.3體系中含藥血清添加量考察與模型對照組比擬，各濃度含藥血清組TT值均明顯升高P0.01或P0.05，ALT均顯著下降P0.01；與10%含藥血清組比擬，20%、40%含藥血清組TT值明顯下降P0.01或P0.05，5%含藥血清組無顯著差異P0.05，5%、20%、40%含藥血清組ALT均明顯升高P0.01或P0.05。提示體系中參加10%的含藥血清效果最正確見表5。3討論目前含藥血清的制備多數(shù)采用藥效指標考察，少數(shù)考慮化學指標，且無視了各影響

14、因素的交互作用。本課題采用藥理和化學指標相結合加權評分的正交試驗，發(fā)現(xiàn)存在交互作用。理論上講，宜采用病理狀態(tài)下的動物制備含藥血清3，但是，本研究結果顯示，動物是否造模幾乎對結果沒有影響，與文獻報道一致4。有學者提出“血漿藥理學優(yōu)于“血清藥理學5，本研究結果顯示，血漿與血清對結果的影響雖然沒有統(tǒng)計學差異，但直觀分析前者優(yōu)于后者，與先期發(fā)現(xiàn)的血漿中藥效成分含量高于血清的結果2一致，后續(xù)研究應該注意。研究結果顯示，含藥血清濃度超過一定范圍藥效反而降低，這可能是由于血清濃度過高會產(chǎn)生一定的細胞毒性6?！緟⒖嘉墨I】1徐淑云.藥理實驗方法學.第3版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2002：581-583.2羅琳，竇志華，丁安偉，等大鼠灌胃復方五仁醇膠囊后血清和血漿中五味子醇甲和五味子乙素的比擬J中草藥，2022，3710：1486-1489.3張聲鵬，施旭光，桂蜀華關于中藥血清藥理學中血清供體