分子生物學(xué)檢驗：小鼠肝臟組織總RNA的提取及RT-PCR

1、一 小鼠肝臟組織總RNA的提取（Trizol法提?。┠康模?.掌握組織細(xì)胞中總RNA提取的基本原理2.熟悉Trizol法提取總RNA的原理和操作原理:Trizol是一種新型總RNA抽提試劑，內(nèi)含異硫氰酸胍等物質(zhì)，能迅速破碎細(xì)胞，再加入氯仿后形成兩相，變形的DNA與蛋白質(zhì)位于兩相的交界面，RNA保留于上層水相Trizol適用于從多種組織和細(xì)胞中快速分離總RNA器材與試劑：EP管、加樣槍、離心機(jī)、振蕩器、勻漿器、Trizol Reagent 、氯仿、異丙醇、75%乙醇、DEPC水標(biāo)本：小鼠肝臟操作：1秤取組織：先剪碎小鼠肝臟組織，稱量100mg組織，加1.0ml的 Trizol，用勻漿器勻漿2.各

2、層相分離：室溫靜置5分鐘，12000轉(zhuǎn)/分，4離心10分鐘，將上清液轉(zhuǎn)移到另外一個EP管中3加入1/5體積的上清液量的氯仿，劇烈振蕩混勻30412000轉(zhuǎn)/分，室溫離心10分鐘 5將上清液小心轉(zhuǎn)移到RNase-free 1.5ml離心管里，加入與上清等體積的異丙醇，室溫下放置10min，【注意：不要吸取任何中間層物質(zhì)，否則會出現(xiàn)Genomic DNA污染】6.12000轉(zhuǎn)/分，4，離心10分鐘,離心后分層：酚-氯仿層、中間層、 無色水相層（RNA）7.小心移去上清液，防止沉淀丟失 8.用75%酒精（用DEPC水配置）洗滌，每次1ml，12000轉(zhuǎn)/分，4，離心5分鐘 9盡可能徹底地吸走上清，同

3、時防止丟失RNA沉淀 10. 室溫下干燥3-5分鐘使酒精充分揮發(fā) 11. 視沉淀物的多少用50ul DEPC-H2O溶解思考題：1.哪些原因可導(dǎo)致RNA被降解？2.如RNA得率比較低，最可能出現(xiàn)的原因是什么？二、 RNA的瓊脂糖電泳【試劑準(zhǔn)備】 所提取動物組織總RNA 10Loading Buffer Goldview瓊脂糖TBE緩沖液操作步驟：1、用電子分析天平稱取1g的瓊脂糖放入三角燒瓶2、將5TBE用去離子水稀釋到0.5TBE工作液3、用100ml量筒量取100ml 0.5TBE到三角燒瓶中4、將三角燒瓶的口用厚紙包嚴(yán)以防止揮發(fā)5、將三角燒瓶放在微波爐中加熱34分鐘到完全融化6、將三角燒

4、瓶放置于室溫冷卻到不燙手7、加入Goldview(EB替代品) 5L搖勻，倒入制膠模具中8、等瓊脂糖完全凝固后拔去梳子，連塑料托底一起放入電泳槽中9、取10L所提取的肝臟總RNA，用2L10Loading Buffer混合后加入膠孔中10、150V ，電泳15min，用凝膠成像儀器成像三、CDNA的合成RT-PCR 方法由從RNA 合成cDNA的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和對此cDNA 進(jìn)行擴(kuò)增的PCR 反應(yīng)組成PCR 中如果擴(kuò)增了錯誤的DNA 序列的話，將有可能損壞目的基因本來具有的機(jī)能的風(fēng)險操作逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：（1）制品內(nèi)容5 primscipt RT Master MixRNase Free dH2O5 p

5、rimscipt RT Master Mix中含有RT-PCR中含有的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)所需要的所有試劑（primscipt RTase , RNase inhibitor , random 6 mers, Oligo dT primer , dNTP Mixture , 反應(yīng)Buffer）, 加入模扳RNA和水就可迅速進(jìn)行反應(yīng)（2）逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：（3）反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件如下： 37 15min (反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)) 85 8sec （反轉(zhuǎn)錄酶的失活反應(yīng)） 4 （4）得到的CDNA可用于下一步的PCR反應(yīng)四、RT-PCR目的：1.掌握RT-PCR的基本原理；2.熟悉RT-PCR的反應(yīng)體系、操作及電泳分析原理：提取

6、組織或細(xì)胞中的RNA，采用oligo(DT)或隨機(jī)引物，利用反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄成CDNA，然后以CDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，從而獲得目的基因的表達(dá)。首先，RNA在反轉(zhuǎn)錄酶作用下反轉(zhuǎn)錄成CDNA第一鏈，在DNA聚合酶的作用下擴(kuò)增目的基因器材與試劑：凝膠電泳儀、PCR儀、凝膠成像儀、離心機(jī)、移液管、0.5TBE、Goldview、DL2000 Marker、滅菌雙蒸水標(biāo)本：小鼠肝臟1. 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：5PrimeSript RT Master Mix 8ulTotal RNA(Rnase Free dH20) 32ul反應(yīng)條件：37 15min85 5s42. RT-PCR:10PCR Buffer 3.0dNTP 2.0F 1.0R 1.0 rTaq 1.0CDNA 2.0DH20 20反應(yīng)條件