免疫化學技術

1、免疫化學技術第1頁，共75頁，2022年，5月20日，5點20分，星期一免疫標記技術放射物標記技術酶標技術免疫熒光技術其他標記技術酶聯(lián)免疫吸附技術酶免疫組化技術雙抗體夾心法競 爭 法雙抗原夾心法間 接 法雙位一點法第2頁，共75頁，2022年，5月20日，5點20分，星期一 什么是 酶聯(lián)免疫分析技術 ELISA的基本原理和方法 ELISA的種類和變化 ELISA的特點 ELISA的應用實例第3頁，共75頁，2022年，5月20日，5點20分，星期一一、基本原理 是利用抗原抗體進行的檢測技術。即利用制備好的特異抗原或抗體作為試劑，以檢測標本中的相應抗體或抗原。在這種測定方法中有3種必要的試劑：固

2、相的抗原或抗體（免疫吸附劑）酶標記的抗原或抗體（標記物）酶作用的底物（顯色劑）第4頁，共75頁，2022年，5月20日，5點20分，星期一ELISA原理使抗原或抗體結合到某種固相載體表面，并保持其免疫活性 使抗原或抗體與某種酶連接成酶標抗原或抗體，這種酶標抗原或抗體既保留其免疫活性，又保留酶的活性結合在固相載體上的酶量與標本中受檢物質的量成一定的比例。加入酶反應的底物后，底物被酶催化變?yōu)橛猩a物，產物的量與標本中受檢物質的量直接相關 第5頁，共75頁，2022年，5月20日，5點20分，星期一 其所生成的顏色深淺與欲測的抗原（抗體）含量成正比。 這種有色產物可用肉眼、光學顯微鏡、電子顯微鏡觀察

3、，也可以用分光光度計（酶標儀）加以測定。 其方法簡單，方便訊速，特異性強。第6頁，共75頁，2022年，5月20日，5點20分，星期一二、酶及其底物 酶結合物是酶與抗體或抗原, 半抗原在交聯(lián)劑作用下聯(lián)結的產物。是ELISA成敗的關鍵試劑，它不僅具有抗體抗原特異的免疫反應，還具有酶促反應，顯示出生物放大作用，但不同的酶選用不同的底物 ，將得到不同的顏色反應.第7頁，共75頁，2022年，5月20日，5點20分，星期一酶 底 物顯色反應 測定波長 辣根過氧化物酶 鄰苯二胺四甲替聯(lián)苯胺氨基水楊酸鄰聯(lián)苯甲胺2,2-連胺基-2(3-乙基-并噻唑啉磺酸-6)銨鹽 橘紅色黃色棕色蘭色藍綠色492460449

4、425642堿性磷酸酯酶 4-硝基酚磷酸鹽(PNP)萘酚-AS-Mx磷酸鹽+重氮鹽 黃色紅色 400500 葡萄糖氧化酶 ABTS+HRP+葡萄糖葡萄糖+甲硫酚嗪+噻唑蘭 黃色深藍色 405420 -半乳糖苷酶 甲基傘酮基半乳糖苷(4MuG)硝基酚半乳糖苷(ONPG) 熒光黃色 360,450420 第8頁，共75頁，2022年，5月20日，5點20分，星期一ELISA的種類和變化 （一）雙抗體夾心法（二）間接法（三）競爭法 （四）雙位點一步法（五）捕獲法測IgM抗體（六）應用親和素和生物素的ELISA 第9頁，共75頁，2022年，5月20日，5點20分，星期一（一）雙抗體夾心法此法適用于檢

5、驗各種蛋白質等大分子抗原第10頁，共75頁，2022年，5月20日，5點20分，星期一第11頁，共75頁，2022年，5月20日，5點20分，星期一雙抗體夾心法（HBsAg、HBeAg等）示意圖固相載體抗體抗原酶抗體酶標記抗體1.將抗體包被在固相載體上。2.如樣品中含有抗原，則結合為抗原抗體復合物。3.再加入酶標記抗體，則結合為抗體-抗原-酶標記抗體復合物。4.酶催化底物并顯色。第12頁，共75頁，2022年，5月20日，5點20分，星期一獲得待分析物的未標定抗體將特異性抗體與固相載體連接形成固相抗體 洗滌除去未結合的抗體及雜質 加入封閉蛋白溶液以封閉載體表面殘留的蛋白結合位點洗滌并除去未結合

6、的封閉蛋白加受檢標本（抗原）形成固相抗體抗原復合物 洗滌除去其他未結合的物質 加酶標抗體生成抗體待測抗原酶標記抗體的復合物 徹底洗滌未結合的 酶標抗體 加底物進行酶催化反應 根據(jù)顏色反應的程度進行該抗原的定性或定量測定第13頁，共75頁，2022年，5月20日，5點20分，星期一雙抗體夾心法測抗原此法適用于檢驗各種蛋白質等大分子抗原，例如HBsAg、HBeAg、AFP等。只要獲得針對受檢抗原的異性抗體，就可用于包被固相載體和制備酶結合物而建立此法。第14頁，共75頁，2022年，5月20日，5點20分，星期一（1）雙抗體夾心法測定抗原A. 將抗體吸附于固相表面; B. 加抗原，形成抗原-抗體復

7、合物; C. 加酶標抗體; E. 加底物。底物的降解量抗原量。 第15頁，共75頁，2022年，5月20日，5點20分，星期一雙抗原夾心法（抗-HBs等）示意圖1.將抗原包被在固相載體上。2.如樣品中含有抗體，則結合為抗原抗體復合物。3.再加入酶標記抗原，則結合為抗原-抗體-酶標記抗原復合物。4.酶催化底物并顯色。酶抗原酶標記 抗原抗體抗原固相載體第16頁，共75頁，2022年，5月20日，5點20分，星期一雙抗原夾心法測抗體 用特異性抗原進行包被和制備酶結合物。此法中受檢標本不需稀釋，可直接用于測定，因此其敏感度相對高于間接法。乙肝標志物中抗HBsAg的檢測常采用本法。本法關鍵在于酶標抗原的

8、制備，應根據(jù)抗原結構的不同，尋找合適的標記方法。第17頁，共75頁，2022年，5月20日，5點20分，星期一 間接法是檢測抗體最常用的方法，其原理為利用酶標記的抗抗體以檢測已與固相結合的受檢抗體，故稱為間接法。（二）間接法第18頁，共75頁，2022年，5月20日，5點20分，星期一酶抗抗體酶標記抗抗體抗體抗原固相載體1.將抗原包被在固相載體上。2.如樣品中含有抗體，則結合為抗原抗體復合物。3.再加入酶標記抗抗體，則結合為抗原-抗體-酶標記抗抗體復合物。4.酶催化底物并顯色。間接法（抗-HCV等）示意圖第19頁，共75頁，2022年，5月20日，5點20分，星期一間接法測抗體 傳染病的診斷。

9、間接法的優(yōu)點是只要變換包被抗原就可利用同一酶標抗抗體建立檢測相應抗體的方法。第20頁，共75頁，2022年，5月20日，5點20分，星期一包被固相載體: 用已知抗原包被固相載體 加待檢標本: 使相應抗體與固相抗原結合洗滌，除去無關的物質 加酶標抗抗體:與固相載體上抗原抗體復合物結合；洗滌，除去未結合的酶標抗抗體 加底物顯色 根據(jù)顏色反應的程度進行該抗原的定性或定量測定第21頁，共75頁，2022年，5月20日，5點20分，星期一（三）競爭法 此法可用于抗原和半抗原的定量測定，也可用于測定抗體 。第22頁，共75頁，2022年，5月20日，5點20分，星期一用已知特異性抗體包被固相載體 測定管加

10、待測抗原和一定量的酶標抗原使二者與固相抗體競爭結合 對照管只加一定量酶標抗原與固相抗體直接結合 分別洗滌除去未結合的成分 加底物顯色分別測定兩管的吸光度值，根據(jù)對照管與測定管吸光度值之比， 計算標本中待測抗原含量第23頁，共75頁，2022年，5月20日，5點20分，星期一 （3）競爭法測定抗原A. 將抗體吸附在固相載體表面; B. 加入酶標抗原和待測抗原，競爭結合抗體； 對照只加入酶標抗原； C. 加底物。對照孔與樣品孔底物降解量的差未知抗原量。第24頁，共75頁，2022年，5月20日，5點20分，星期一 對照管由于只加酶標抗原，與固相抗體充分結合，故分解底物顯色深；測定管的顯色程度則隨待

11、測抗原和酶標抗原與固相抗體競爭結合的結果而異。如待測抗原量多，競爭性地抑制酶標抗原與固相抗體結合，使固相上結合的酶標抗原量減少。因此，加入底物后顯色反應較弱。 第25頁，共75頁，2022年，5月20日，5點20分，星期一放射免疫測定法(Radioimmunoassaly,RIA) 應用同位素標記技術來檢測抗原抗體反應的高靈敏度方法。此法兼有放射性同位素標記物所顯示的高靈敏度（可達到 ng和pg水平）和血清學反應的高特異性優(yōu)點。第26頁，共75頁，2022年，5月20日，5點20分，星期一發(fā)光免疫測定法(Luminescent immunoassay)將化學發(fā)光反應與免疫測定法結合起來的新型技

12、術。常用的發(fā)光試劑有魯米諾（luminol)和光澤精(lucigenin)。第27頁，共75頁，2022年，5月20日，5點20分，星期一一：靈敏性 該測定法的靈敏度來自作為報告集團的酶。眾所周知, 酶是一種有機催化劑，很少量的酶即可誘導大量的催化反應 ，產生可供觀察的顯色反應現(xiàn)象。因此該體系常被稱為酶放大體系。 ELISA實現(xiàn)了在細胞或亞細胞水平上示蹤抗原或抗體的所在部位，或在微克、甚至納克水平上對其進行定量。 例如，在測定血清中某一物質的含量時，化學比色法的敏感度為mg/ml水平，酶反應測定法的敏感度約為510g/ml 。 ELISA的特點第28頁，共75頁，2022年，5月20日，5點2

13、0分，星期一二：特異性 其特異性來自抗體或抗原的選擇性?？乖贵w的結合實質上只發(fā)生在抗原的抗原決定簇與抗體的抗原結合位點之間。由于兩者在化學結構和空間構型上呈互補關系，所以抗原抗體反應具有高度的特異性。 第29頁，共75頁，2022年，5月20日，5點20分，星期一ELISA的試劑(A、B、C三部分)ELISA中有三個必要的試劑：免疫吸附劑、結合物和酶的底物。（1）已包被抗原或抗體的固相載體（免疫吸附劑）；（2）酶標記的抗原或抗體（結合物）；（3）酶的底物；（4）陰性對照品和陽性對照品，參考標準品；（5）結合物及標本的稀釋液；（6）洗滌液；（7）酶反應終止液第30頁，共75頁，2022年，5月

14、20日，5點20分，星期一ELISA的試劑準備A 固相載體 聚苯乙烯具有較強的吸附蛋白質的性能，抗體或蛋白質抗原吸附其上后仍保留原來的免疫學活性。 聚氯乙烯。聚氯乙烯對蛋白質的吸附性能比聚苯乙烯高，但空白值也略高。 良好的ELISA板應該是吸附性能好，空白值低，孔底透明度高，各板之間、同一板各孔之間、同一板各孔之間性能相近。第31頁，共75頁，2022年，5月20日，5點20分，星期一包被的方式 將抗原或抗體固定在過程稱為包被(coating)。 蛋白質與聚苯乙烯固相載體是通過物理吸附結合的，靠的是蛋白質分子結構上的疏水基團與固相載體表面的疏水基團間的作用。這種物理吸附是非特異性的，受蛋白質的

15、分子量、等電點、濃度等的影響。大分子蛋白質較小分子蛋白質通常含有更多的疏水基團，故更易吸附到固相載體表面。第32頁，共75頁，2022年，5月20日，5點20分，星期一不易吸附的非蛋白質抗原可用間接包被的抗原經固相抗體的親和層析作用，包被在固相上的抗原純度大大提高，因此含雜質較多的抗原也可采用捕獲包被法。親和素生物素 即用親和素先包被載體，加入生物素化的DNA，這種包被方法均勻、牢固，已擴大應用于各種抗原物質的定量測定。脂類物質無法與固相載體結合，可將其在有機溶劑（例如乙醇）中溶解后加入ELISA板孔中，開蓋置冰箱過夜或冷風吹干，待酒精揮發(fā)后，讓脂質自然干固在固相表面。 優(yōu)點：試驗的特異性、敏

16、感性均由此得以改善，重復性亦佳?？乖昧可?，僅為直接包被的1/10乃至于/100。第33頁，共75頁，2022年，5月20日，5點20分，星期一包被用抗原：天然抗原、重組抗原和合成多肽抗原三大類。合成多肽抗原是抗原決定簇的氨基酸序列人工合成的多肽片段。一般只含有一個抗原決定簇，純度高，特異性也高，但由于分子量太小，往往難于直接吸附于固相上。借助于偶聯(lián)物與固相載體的吸附，間接地結合到固相載體表面。第34頁，共75頁，2022年，5月20日，5點20分，星期一包被用抗體IgG對聚苯乙烯有強吸附力，其聯(lián)結發(fā)生在Fc段上，抗體結合點暴露于外。取材于抗血清或含單克隆抗體的培養(yǎng)液.須除去雜抗體后才能用于E

17、LISA，以保證試驗的特異性。腹水中單抗的濃度較高，特異性亦較強，因此不需要作吸收層析處理，直接包被。在某些情況下，用多種單抗混合包被，可取得更好的效果。第35頁，共75頁，2022年，5月20日，5點20分，星期一包被的條件pH9.6碳酸鹽緩沖液pH7.2的磷酸鹽緩沖液pH7-8的Tris-HCL緩沖液。 加入包被液后，在4-8冰箱中放置過夜，37中保溫2小時。包被濃度隨載體和包被物的性質可有很大的變化，每批材料需通過實驗與酶結合物的濃度協(xié)調選定。一般蛋白質的包被濃度為10ng/ml-20ug/ml。第36頁，共75頁，2022年，5月20日，5點20分，星期一封 閉封閉(blocking)

18、是繼包被之后用高濃度的無關蛋白質溶液再包被的過程。封閉就是讓大量不相關的蛋白質充填這些空隙，從而排斥ELISA后的步驟中干擾物質的再吸附。常用封閉劑：0.05%-0.5%的BSA; 10%的小牛血清或1%明膠;脫脂奶粉,比較價廉，可以高濃度使用（5%）。 所有的ELISA固相均需封閉？第37頁，共75頁，2022年，5月20日，5點20分，星期一洗滌液在板式ELISA中，常用的稀釋液為含0.05%吐溫20磷酸鹽緩沖液。第38頁，共75頁，2022年，5月20日，5點20分，星期一ELISA的試劑準備B 結合物 即酶標記的抗體（或抗原）是ELISA中關鍵的試劑 1 酶的催化活性 2 抗體（或抗原

19、）的免疫活性 3 含有或少含有游離的抗體（或抗原） 4 結合物尚要有良好的穩(wěn)定性。第39頁，共75頁，2022年，5月20日，5點20分，星期一 結合物用的抗原和抗體 制備結合物時所用純度較高的IgG，以免在與酶聯(lián)結時其他雜蛋白的干擾。最好用層析純化的抗體，這樣全部酶結合物均具有特異的免疫活性，可以在高稀釋度進行反應，實驗結果本底淺淡。在ELISA中用酶標抗原的模式不多，總的要求是抗原必須是高純度的。第40頁，共75頁，2022年，5月20日，5點20分，星期一 酶純度高，催化反應的轉化率高，專一性強，性質穩(wěn)定，來源豐富，價格不貴，受檢標本中不存在相同的酶。酶結合物保留活性部分和催化能力，底物

20、易于制備和保存，價格低廉，有色產物易于測定等。在ELISA中，HRP，AP，葡萄糖氧化酶，-D-半乳糖苷酶和脲酶等。HRP是一種糖蛋白，含糖量約為18%，分子量為44000，是一種復合酶，由主酶（酶蛋白）和輔基（亞鐵血紅素）結合而成，是一種卟啉蛋白質。第41頁，共75頁，2022年，5月20日，5點20分，星期一 結合物的制備酶標記抗體的制備方法主要有兩種，即戊二醛交聯(lián)法和過碘酸鹽氧化法。（1）戊二醛交聯(lián)法：戊二醛是一種雙功能團試劑，可使酶與蛋白質的氨基通過它而聯(lián)結。有效（結合率達60%-70%）和重復性好。 交聯(lián)反應是隨機的，結合物的大小也不均一，酶與酶，抗體與抗體之間也有可能交聯(lián)，影響效果

21、。（2）過碘酸氧化法：適用含糖量較高的酶。過碘酸鈉將HRP分子表面的多糖氧化為醛基很活潑，可與蛋白質上的氨基形成chiff氏堿而 結合。簡便有效.第42頁，共75頁，2022年，5月20日，5點20分，星期一 結合物中混有的游離酶一般不影響ELISA中最后的酶活性測定。但游離的抗體則會與酶標抗體競爭相應的固相抗原，因此制備的酶結合物應予純化，去除游離的酶和抗體后用于檢測，效果更好。 制得結合物，最適的工作濃度就是指結合物稀釋至這一濃度時，能維護一個低的本底，并獲得測定的最佳靈敏度，達到最合適的測定條件和測定費用的節(jié)省。第43頁，共75頁，2022年，5月20日，5點20分，星期一結合物的保存

22、酶和抗體均為生物活性物質，易失活。高濃度較為穩(wěn)定，凍干后可在普通冰箱中保存一年左右。結合物溶液中加入等體積的甘油，加入蛋白保護劑。另外再加入抗生素（例如慶大霉素）和防腐劑（HRP結合物加硫柳泵，AP結合物可加疊氮鈉）。第44頁，共75頁，2022年，5月20日，5點20分，星期一 結合物的稀釋液 用于稀釋高濃度的結合物以配成工作液。為避免結合物在反應中直接吸附在固相載體上：0.1%牛血清白蛋白， 0.05%吐溫20 。試劑盒均已用合適的緩沖液配成工作液，使用時不需再行稀釋，在4-8保存期可達6個月。第45頁，共75頁，2022年，5月20日，5點20分，星期一試劑準備 C 酶的底物第46頁，共

23、75頁，2022年，5月20日，5點20分，星期一酶的底物HRP的底物OPD氧化后的產物呈橙紅色，用酸終止酶反應后，在492nm處有最高吸收峰，靈敏度高，比色方便，是HRP結合物最常用的底物。 DH2+ H2O2 D+ 2H2O 上式中， DH2為供氧體， H2O2為受氫體。DH2一般為無色化合物，經酶作用后成為有色的產物。DH2如：鄰苯二胺(OPD)、四甲基聯(lián)苯胺(TMB)和ABTS 。E第47頁，共75頁，2022年，5月20日，5點20分，星期一TMB經HRP作用后共產物顯藍色。TMB性質較穩(wěn)定，可配成溶液試劑，只需與H2O2溶液混和即成應用液。酶反應終止后，TMB產物由藍色呈黃色，可在

24、比色計中定量，最適吸收波長為450nm。ABTS雖不如OPD和TMB敏感，但空白值極低，也為一些試劑盒所采用。HRP對氫受體的專一性很高，僅作用于H2O2、小分醇的過氧化物和尿素過氧化物(urea peroxide)。 第48頁，共75頁，2022年，5月20日，5點20分，星期一AP的底物為磷酸酯酶，一般采用對硝基苯磷酸酯作為底物。產物為黃色的對硝基酚，在405nm波長處有吸收峰。用NaOH終止酶反應后，黃色可穩(wěn)定一時間。AP也有發(fā)熒光底物（磷酸4-甲基傘酮），可用于ELISA作熒光測定，敏感度較高于用顯色底物的比色法。第49頁，共75頁，2022年，5月20日，5點20分，星期一酶反應終止

25、液常用的HRP反應終止液為硫酸，其濃度按加量及比色液的最終體積而異，在板式ELISA中一般采用2mol/L。第50頁，共75頁，2022年，5月20日，5點20分，星期一對照設定 陽性對照品(positive control)和陰性對照品(negative control)是檢驗試驗有效性的控制品，同時也作為判斷結果的對照。陽性對照品的基本組成應盡量與檢測標本的組成相一致，多以含蛋白保護劑的緩沖液為基質。加入的量應與試劑的敏感度相稱；在測定中得到的吸光值與受檢標本吸光值比較，可以估計標本物質的量。第51頁，共75頁，2022年，5月20日，5點20分，星期一參考標準品 定量測定（如甲胎蛋白質，

26、癌胚抗原測定等）應含有制作標準曲線用的參考標準品，應包括覆蓋可檢測范圍的4-5個濃度，一般均配入含蛋白保護劑及防腐劑的緩沖液中.陰性對照品須先行檢測確定不含待測物質。例如HBsAg檢測的陰性對照品中不可含HBsAg，最好抗HBs也是陰性。第52頁，共75頁，2022年，5月20日，5點20分，星期一5 標本的采取和保存 體液、分泌物和排泄物等均可作標本以測定其中某種抗體或抗原成份。以血清標本為例：血漿中除尚含有纖維蛋白原和抗凝劑外，其他成份同血清。血漿和血清可同等應用。血清標本應避免溶血：紅細胞溶解時會釋放出具有過氧化物酶活性的物質，以HRP為標記的ELISA測定中，可能會增加非特異性顯色。第

27、53頁，共75頁，2022年，5月20日，5點20分，星期一加樣: 在ELISA中一般有3次加樣步聚，即加標本，加酶結合物，加底物。加樣時應將所加物加在LEISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可濺出，不可產生氣泡?；静僮髯⒁馐马椀?4頁，共75頁，2022年，5月20日，5點20分，星期一保溫抗原抗體完成反應的保溫過程稱為溫育(incubation)。ELISA屬固相免疫測定，抗原、抗體的結合只在固相表面上發(fā)生。為什么ELISA反應總是需要一定時間的溫育？溫育常采用的溫度有43、37、室溫和4（冰箱溫度）等。37是實驗室中常用的保溫溫度，也是大多數(shù)抗原抗體結合的合適溫度。第55頁，共

28、75頁，2022年，5月20日，5點20分，星期一保溫方式：ELISA儀器附有特制的電熱塊，水浴。若用保溫箱：ELISA板放在濕盒內，在盒底墊濕的紗布，最后將ELISA板放在濕紗布上。反應板均不宜疊放，以保證各板的溫度都能迅速平衡。室溫溫育的反應，操作時的室溫應嚴格限制在規(guī)定的范圍內，標準室溫溫度是指20-25，但具體操作時可根據(jù)說明書的要求控制溫育。應注意溫育的溫度和時間應按規(guī)定力求準確。為保證這一點，一個人操作時，一次不宜多于兩塊板同時測定。第56頁，共75頁，2022年，5月20日，5點20分，星期一洗滌洗滌在ELISA過程中雖不是一個反應步驟，但卻也決定著實驗的成敗。ELSIA洗滌：達

29、到分離游離的和結合的酶標記物的目的。清除殘留在板孔中游離的物質，以及非特異性地吸附的干擾物質。聚苯乙烯等塑料對蛋白質的吸附是普遍性的，而在洗滌時又應把這種非特異性吸附的干擾物質洗滌下來。可以說在ELISA操作中，洗滌是最主要的關鍵技術。洗滌的方式除某些ELISA儀器配有特殊的自動洗滌儀外，手工操作有流水沖洗式和浸泡式兩種：第57頁，共75頁，2022年，5月20日，5點20分，星期一（1）流水沖洗式 流水沖洗法最初用于小珠載體的洗滌，洗滌液為蒸餾水，自來水。洗滌效果更為徹底，且也簡便、快速。已有實驗表明，流水沖洗式同樣適用于微量滴定板的洗滌。讓水流沖擊板孔表面，洗滌效果更佳。 （2）浸泡式 微

30、量滴定板多采用。洗滌液為非離子型洗滌劑的中性緩沖液。聚苯乙烯載體與蛋白質的結合是疏水性的，非離子型洗滌劑既含疏水基團，也含親水基團，使蛋白質回復到水溶液狀態(tài)，從而脫離固相載體。第58頁，共75頁，2022年，5月20日，5點20分，星期一顯色顯色是酶催化無色的底物生成有色產物的溫育反應。反應的溫度和時間仍是影響顯色的因素。在一定時間內，陰性孔可保持無色，而陽性孔則隨時間的延長而呈色加強。適當提高溫度有助于加速顯色進行。TMB受光照的影響不大，可在室溫中置于操作臺上，邊反應觀察結果。但為保證實驗結果的穩(wěn)定性，宜在規(guī)定的適當時間閱讀結果。TMB經HRP作用后，約40分鐘顯色達頂峰，隨即逐漸減弱，至

31、2小時后即可完全消退至無色。第59頁，共75頁，2022年，5月20日，5點20分，星期一比色拭干板底附著的液體，然后將板正確放入酶標比色儀中。 以蒸餾水校零點，測讀底物孔（未經任何反應僅加底物液的孔）和空白孔（以生理鹽水或稀釋液代替標本作全過程的孔），以記錄本次試驗的試劑狀況。其后可用空白孔以蒸餾水校零點，以上各孔的吸光度需減去空白孔的吸光度，然后進行計算。結果以光密度（oplical density，OD），現(xiàn)按規(guī)定用吸光度（absorbence，A），兩者含義相同。通常的表示方法是，將吸收波長寫于A字母的右下角，如OPD的吸收波長為492nm，表示方法為A492nm或OD492nm。第6

32、0頁，共75頁，2022年，5月20日，5點20分，星期一酶標比色儀酶標比色儀簡稱酶標儀，通常指測讀ELISA光度計。針對固相載體形式的不同，各有特制的適用于板、珠和小試管的設計。酶標儀的主要性能指標有：測讀速度、讀數(shù)的準確性、重復性、精確度和可測范圍、線性等等。優(yōu)良的酶標儀的讀數(shù)一般可精確到0.001，準確性為1%，重復性達0.5%。操作時室溫宜在15-30，使用前先預熱儀器15-30分鐘，測讀結果更穩(wěn)定。測讀A值時，要選用產物的敏感吸收峰，如OPD用492nm波長。有的酶標儀可用雙波長式測讀。各種酶標儀性能有所不同，使用中應詳細閱讀說明書。第61頁，共75頁，2022年，5月20日，5點2

33、0分，星期一6 結果判斷 6.1 定性測定定性測定的結果判斷作出“有”或“無”的回答，分別用“陽性”、“陰性”表示。在這種半定量測定中，將標本作一系列稀釋后進行試驗，呈陽性反應的最高稀釋度即為滴度。根據(jù)滴度的高低，可以判斷標本反應性的強弱，這比觀察不稀釋標本呈色的深淺判斷為強陽性、弱陽性更具定量意義。在間接法和夾心法ELSIA中，陽性孔呈色深于陰性孔。在競爭法ELISA中則相反，陰性孔呈色深于陽性孔。兩類反應的結果判斷方法不同，分述于下。第62頁，共75頁，2022年，5月20日，5點20分，星期一A.陽性判定值： （cut-off value）一般為陰性對照A值加上一個特定的常數(shù)(0.05)，以此作為判斷結果陽性或陰性的標準。B.標本/陰性對照比值：在實驗條件（包括試劑）較難保證恒定的情況下，這種判斷法較為合適。在得出標本（S）和陰性對照（N）的A值后，計算S/N值。間接法和夾心法第63頁，共75頁，2022年，5月20日，5點20分，星期一（2）競爭法因肉眼很難辨別弱陽性反應與陰性對照的顯色差異，一般均用比色計測定，讀出S、P和