分子熒光分析法

1、分子熒光分析法第1頁，共31頁，2022年，5月20日，10點6分，星期一1575：西班牙植物學家N.Monardes觀察到熒光現(xiàn)象1852：Stokes 研究熒光，提出作為一種分析手段1867：Goppelsroder首次應用方法1880：提出熒與化學結構關系的經驗法則1928：Jette和West 第一臺光電熒光計1952：第一臺商品化的熒光分光光度計特點：1)靈敏度高（1-100 ppb)：有的可達0.01ppb；2)選擇性強；3)方法簡單快速，用樣量少; 4)提供比較多的物理參數(shù)。3.1 熒光分析的基本原理第2頁，共31頁，2022年，5月20日，10點6分，星期一3.1 熒光分析的基

2、本原理分子發(fā)光：處于基態(tài)的分子吸收能量（電、熱、化學和光能 等）被激發(fā)至激發(fā)態(tài)，然后從不穩(wěn)定的激發(fā)態(tài)返回至基態(tài)并發(fā)射出光子，此種現(xiàn)象稱為發(fā)光。熒光和磷光: 當紫外光照射某些物質時，由于這些物質結構的特殊性，會發(fā)出比吸收波長更長的不同波長的可見光，當紫外光照射停止時, 隨之消失的光叫做熒光，不立即消失的光叫磷光。第3頁，共31頁，2022年，5月20日，10點6分，星期一3.1 熒光分析的基本原理分子能級=電子能級(Ee)+振動能級(Ev)+轉動能級(Er)。電子激發(fā)的多重度：M=2s+1Pauli不相容原理：分子中同一軌道所占據(jù)的兩個電子必須具有相反的自旋方向，即自旋配對。單重態(tài): 如果分子中

3、全部軌道里的電子都是自旋配對的, s=0, M=1三重態(tài)：電子在躍遷過程中還伴隨著自旋方向的改變，s=1,M=3S0S1S2T1T2分子發(fā)光的產生 第4頁，共31頁，2022年，5月20日，10點6分，星期一去活化發(fā)射光子非輻射躍遷化學反應熒光磷光振動馳豫系間跨越內轉換外轉換激發(fā)光去除后，熒光立即消失激發(fā)光去除后，磷光不會立即消失熄滅或猝滅3.1 熒光分析的基本原理分子發(fā)光的產生第5頁，共31頁，2022年，5月20日，10點6分，星期一3.1.2 激發(fā)光譜和發(fā)射光譜 激發(fā)光譜:固定測量波長(選最大發(fā)射波長),化合物發(fā)射的熒光(磷光)強度與照射光波長的關系曲線 （圖中曲線I ） 激發(fā)光譜形狀與

4、吸收光譜形狀完全相似，經校正后二者完全相同！ 發(fā)射光譜：固定激發(fā)光波長(選最大激發(fā)波長), 化合物發(fā)射的熒光(或磷光強度)與發(fā)射光波長關系曲線(圖中曲線II或III)。熒光(磷光)：光致發(fā)光，照射光波長如何選擇？吸收池光源檢測器單色器信號顯示系統(tǒng)單色器第6頁，共31頁，2022年，5月20日，10點6分，星期一熒光激發(fā)光譜與發(fā)射光譜的特征a.Stokes位移 在溶液中，分子熒光的發(fā)射相對于吸收位移到較長的波長，稱為Stokes位移。這是由于受激分子通過振動弛豫而失去轉動能，也由于溶液中溶劑分子與受激分子的碰撞，也會有能量的損失。因此，在激發(fā)和發(fā)射之間產生了能量損失。b.發(fā)射光譜的形狀與激發(fā)波長

5、無關 分子被激發(fā)到高于S1的電子態(tài)的更高振動能級，然而由于內轉換和振動弛豫的速率很快，很快損失多余的能量而衰變到S1電子態(tài)的最低振動能級 盡管分子受激到達不同能級的激發(fā)態(tài)，不管激發(fā)波長如何，電子都是從第一電子激發(fā)態(tài)的最低振動能層躍遷到基態(tài)的各個振動能層，而與熒光體被激發(fā)至哪一個電子態(tài)無關。無論激發(fā)波長是1還是2，熒光的波長都是23.1.2 激發(fā)光譜和發(fā)射光譜 激發(fā)光譜的形狀與發(fā)射波長也無關第7頁，共31頁，2022年，5月20日，10點6分，星期一ex =290nm (MAX)固定em=620nm(MAX)固定ex=290nm (MAX)em= 620nm(MAX)S04321S143211

6、41 31 2111 41 41 21 1c. 鏡像規(guī)則 通常熒光發(fā)射光譜與它的吸收光譜（與激發(fā)光譜形狀一樣）成鏡像對稱關系。 基態(tài)上的各振動能級分布與第一激發(fā)態(tài)上的各振動能級分布類似；基態(tài)上的零振動能級與第一激發(fā)態(tài)的各振動能級之間的躍遷和反躍遷幾率相等第8頁，共31頁，2022年，5月20日，10點6分，星期一200250300350400450500熒光激發(fā)光譜熒光發(fā)射光譜nm蒽的激發(fā)光譜和熒光光譜第9頁，共31頁，2022年，5月20日，10點6分，星期一3.1.3 熒光與分子結構的關系分子熒光產生的必備條件分子必須能夠吸收激發(fā)光分子必須具有一定的熒光量子產率影響因素：熒光產生過程中，

7、輻射和無輻射過程； 與每一過程的速率常數(shù)有關； kf 分子結構決定（內因）； 主要取決于化學結構和化學環(huán)境和結構共同決定。第10頁，共31頁，2022年，5月20日，10點6分，星期一n振動弛豫激發(fā) n熒光（1）躍遷類型：具有電子躍遷類型的結構 躍遷是產生熒光的主要躍遷類型較大的摩爾吸光系數(shù)較短的激發(fā)態(tài)壽命10-710-9s串越至三重態(tài)幾率小第11頁，共31頁，2022年，5月20日，10點6分，星期一（2）具有大的共軛鍵結構共軛度越大，熒光越強。原因 ：共軛體系越大，離域大鍵的電子越容易激發(fā)，熒光與磷光越容易產生。化合物苯萘蒽丁 省戊 省exmax(nm)205286365390580emm

8、ax (nm)278321400480640F0.110.290.460.600.52第12頁，共31頁，2022年，5月20日，10點6分，星期一（3）具在剛性平面結構 0.9210.18第13頁，共31頁，2022年，5月20日，10點6分，星期一1）給電子取代劑加強熒光（4）取代基效應HN2， NHR ， NR2， OH， OR ， CN產生 p 共軛二苯甲酮：弱熒光、強磷光S1 T1的系間竄躍產率接近1化合物苯苯酚苯胺苯基氰苯甲醚 emmax (nm)278310285365310405280390285345相對熒光強度10182020202）吸電子取代基減弱熒光、加強磷光C=0，

9、COOH ， NO2不產生 p 共軛硝基苯：不產生熒光、弱磷光第14頁，共31頁，2022年，5月20日，10點6分，星期一空間位阻對熒光發(fā)射的影響3）取代基的位置反式二苯乙烯強熒光物質F=0.75F=0.03立體異構體對熒光發(fā)射的影響順式二苯乙烯非熒光物質第15頁，共31頁，2022年，5月20日，10點6分，星期一含有重原子的溶劑，由于重原子效應熒光減弱、磷光增強。（5）重原子取代基效應Cl， Br ， IS1 T1的系間竄躍由于重原子的存在增強第16頁，共31頁，2022年，5月20日，10點6分，星期一第17頁，共31頁，2022年，5月20日，10點6分，星期一3.1.4 溶液的熒光

10、強度1 熒光強度與溶液濃度的關系當lc0.05第18頁，共31頁，2022年，5月20日，10點6分，星期一2 影響熒光強度的環(huán)境因素1）溶劑對熒光強度的影響一般溶劑效應介電常數(shù)、折射率特殊溶劑效應溶劑與熒光物質間的特殊作用溶劑相對介電常數(shù)熒光峰/nm熒光效率乙腈38.84100.064丙酮21.54050.055氯仿5.23980.041四氯化碳2.243900.002巰基喹啉在不同溶劑中的熒光峰和熒光效率極性增加，熒光效率增加；粘度增加，熒光效率增加第19頁，共31頁，2022年，5月20日，10點6分，星期一2 影響熒光強度的因素2）溫度對熒光強度的影響隨著溫度的增高，熒光物質溶液的熒光

11、量子產率及熒光強度將降低 不同溫度下鄰菲啰啉的熒光光譜（在鄰二苯中） 碰撞幾率增大粘度降低第20頁，共31頁，2022年，5月20日，10點6分，星期一3）介質酸度的影響 2 影響熒光強度的因素具酸或堿性基團的有機物質，在不同pH值時，熒光體的存在型體不同，不同的型體(分子與其離子)在電子構型上有所不同，而且基態(tài)和激發(fā)態(tài)所表現(xiàn)出來的酸、堿性也有所差別 苯胺：弱的有機堿 在堿性溶液pH712中以分子形式存在，藍色強熒光在酸性pH13以離子形式存在，熒光弱。第21頁，共31頁，2022年，5月20日，10點6分，星期一3 溶液熒光的猝滅熒光物質分子其它物質分子相互作用引起熒光強度降低的現(xiàn)象1） 碰

12、撞猝滅：熒光分子與淬滅劑分子碰撞2）靜態(tài)猝滅：熒光分子與淬滅劑分子生成非熒 光配合物3） 轉入三重態(tài)猝滅：引入溴、碘、溶解氧4） 發(fā)生電荷轉移反應的猝滅：甲基藍與Fe2+5）熒光物質自猝滅第22頁，共31頁，2022年，5月20日，10點6分，星期一3.2 熒光光譜儀吸收池光源檢測器單色器信號顯示系統(tǒng)3.2.1 熒光光譜儀基本結構單色器與紫外-可見光譜儀的不同第23頁，共31頁，2022年，5月20日，10點6分，星期一光源1. 光源的要求：發(fā)射強度足夠且穩(wěn)定的連續(xù)光譜光輻射強度隨波長的變化小有足夠長的使用壽命2.氙燈光源常用氣體放電燈類型： 氙燈光源 高壓汞光源波長范圍：2001000nm工

13、作壓力：520 atm啟動電壓：2040KV使用壽命：10002000h最廣泛應用的連續(xù)光源： 發(fā)射波長范圍寬 發(fā)射光強度大第24頁，共31頁，2022年，5月20日，10點6分，星期一單色器第一單色器：在光源與樣品池之間，濾去不需要的光，得到所需要的激發(fā)光。第二單色器：在樣品池與檢測器之間，濾去溶劑、容器表面散射光，瑞利和拉曼光以及雜質發(fā)出的散射光等，獲得待測物質發(fā)射的熒光。 光源樣品池激發(fā)單色器檢測器數(shù)據(jù)處理儀器控制發(fā)射單色器問題：熒光分光光度計與紫外-可見分光光度計有何異同點？第25頁，共31頁，2022年，5月20日，10點6分，星期一檢測器光電倍增管 放大倍數(shù)：2n5n;n=10,1

14、03107， 最大108109樣品池：液池、熒光池1.樣品池的材料：與紫外-可見分光光度計的吸收池一樣2. 吸收池的形狀：紫外-可見分光光度計的吸收池兩面透光 熒光分光光度計的樣品池四面透光波長范圍3. 使用注意事項容易破碎問題：紫外-可見分光光度計的吸收池與熒光分光光度計的樣品池有什么區(qū)別？沾污問題第26頁，共31頁，2022年，5月20日，10點6分，星期一3.3 分子熒光分析法的應用3.3.1 熒光分析法分類一、直接熒光法問題：基體干擾較為嚴重芳香族有機化合物分析二、間接熒光法（衍生化法和熒光探針法）衍生化法或熒光探針法待測物與衍生化試劑發(fā)生化學反應3.3.2 熒光定性分析與標準品的激發(fā)

15、和發(fā)射光譜譜圖進行對照三、熒光分析法特點1)靈敏度高（1-100 ppb)：有的可達0.01ppb；2)選擇性強；3)方法簡單快速，用樣量少; 4)提供比較多的物理參數(shù)。 第27頁，共31頁，2022年，5月20日，10點6分，星期一3.3.3 熒光定量分析定量依據(jù)1. 標準曲線法（校準曲線法）2. 單點校正法（標準對比法）c1c2c3c4c5cxcscxA sA xcs和cx應很接近第28頁，共31頁，2022年，5月20日，10點6分，星期一3.3.4 熒光分析法的應用1 無機化合物的熒光分析衍生化法：與熒光試劑形成熒光配合物第29頁，共31頁，2022年，5月20日，10點6分，星期一3

16、.3.4 熒光分析法的應用2 有機化合物的熒光分析3 生物大分子的熒光分析直接法：可測定的化合物很少衍生化法：與熒光試劑形成共價化合物待測物試劑 exmaxemmax測定范圍 ppm丙三醇苯胺紫外藍色0.12糠醛蒽酮4655051.515氨基酸氧化酶3154250.0150維生素A無水乙醇345490020蛋白質曙紅丫紫外5400.066腎上腺素乙二胺4205250.0010.02 青霉素-甲氧基-氯-(-氨乙基)-氨基氮雜蒽4205000.06250.625玻璃酸梅3-乙酰氧基吲哚3954700.0010.033胍基丁胺鄰苯二醛3654700.055四氧嘧啶苯二胺36548510-4第30頁，共31頁，2022年，5月20日，10點6分，星期一一、什么是分子發(fā)光？分子發(fā)光有哪幾類？二、分子熒光或磷光是如何產生的？三、什么是熒光激發(fā)光譜？什么是熒光發(fā)射光譜？各有何特點和作用？四、為什么熒光發(fā)射光譜與激發(fā)光波長無關？五、何謂Stokes位移？Stokes位移是如何產生的？六、分子產生熒光的必備條件是什么？七、什么是應光量子產率？什么樣結構的化合物分