分子熒光分光光度法實(shí)驗(yàn)技術(shù)

1、分子熒光分光光度法實(shí)驗(yàn)技術(shù)2022/9/3第1頁(yè)，共52頁(yè)，2022年，5月20日，10點(diǎn)6分，星期一分子發(fā)光分析法分子發(fā)光分析包括: 熒光分析（fluorescence analysis） 磷光分析（phosphorescence analysis） 化學(xué)發(fā)光分析（chemiluminescence analysis） 該類分析方法與吸收分光光度法有密切關(guān)系。2022/9/3第2頁(yè)，共52頁(yè)，2022年，5月20日，10點(diǎn)6分，星期一分子發(fā)光分析法 若分子吸收了光能而被激發(fā)支較高能態(tài)，在返回基態(tài)時(shí)，發(fā)射出與吸收光波長(zhǎng)相等或不等的輻射，這種現(xiàn)象稱為光致發(fā)光，熒光分析和磷光分析是基于這類光致發(fā)光

2、現(xiàn)象而建交起來的分析方法。 2022/9/3第3頁(yè)，共52頁(yè)，2022年，5月20日，10點(diǎn)6分，星期一分子發(fā)光分析法 該類分析方法與吸收分光光度法有密切關(guān)系。 當(dāng)物質(zhì)分子吸收輻射能而被激發(fā)到較高電子能態(tài)之后，在返回基態(tài)的過程中，要釋放出部分能量。2022/9/3第4頁(yè)，共52頁(yè)，2022年，5月20日，10點(diǎn)6分，星期一一、熒光分析法 物質(zhì)的基態(tài)分子受一激發(fā)光源的照射，被激發(fā)至激發(fā)態(tài)后，在返回基態(tài)時(shí)，發(fā)射出與吸收光波長(zhǎng)相等或較長(zhǎng)的熒光。若物質(zhì)分子用X射線或紅外光激發(fā)，則分別產(chǎn)生X射線熒光或外光熒光。2022/9/3第5頁(yè)，共52頁(yè)，2022年，5月20日，10點(diǎn)6分，星期一一、熒光分析法 通

3、常所指的分子熒光是指紫外-可見光熒光，即利用某些物質(zhì)受到紫外光照射后，發(fā)射出比吸收的紫外光波長(zhǎng)相等或更長(zhǎng)的紫外熒光或可見熒光，通過測(cè)定物質(zhì)分子產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度進(jìn)行分析的方法稱為熒光分析。2022/9/3第6頁(yè)，共52頁(yè)，2022年，5月20日，10點(diǎn)6分，星期一二、熒光分析法的應(yīng)用 熒光分析可應(yīng)用于物質(zhì)的定性檢測(cè)及定量分析。由于物質(zhì)結(jié)構(gòu)不同，所能吸收的紫外光波長(zhǎng)不同，在返回基態(tài)時(shí)，所發(fā)射的熒光波長(zhǎng)也不同，利用這個(gè)性質(zhì)可以鑒別物質(zhì)。對(duì)于同種物質(zhì)的稀溶液，其產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度與濃度呈線性關(guān)系，利用這個(gè)性質(zhì)可進(jìn)行定量分析。2022/9/3第7頁(yè)，共52頁(yè)，2022年，5月20日，10點(diǎn)6分，星期一二、熒光

4、分析法的應(yīng)用 熒光法主要應(yīng)用在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)、生物醫(yī)學(xué)、藥物、環(huán)境監(jiān)測(cè)、食品分析等方面，尤其對(duì)體內(nèi)活性物質(zhì)及藥物代謝物的測(cè)定更為重要。2022/9/3第8頁(yè)，共52頁(yè)，2022年，5月20日，10點(diǎn)6分，星期一三、熒光分析法的特點(diǎn) 熒光法的主要特點(diǎn)： 1）靈敏度高，檢出限為10-7-10-9g/ml，比紫外可見分光光度法高101000倍。 2）熒光法的選擇性強(qiáng)，能吸收光的物質(zhì)并不一定能產(chǎn)生熒光，且不同物質(zhì)由于結(jié)構(gòu)不同，雖吸收同一波長(zhǎng)，產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度也不同。 3）它還有用樣量少、操作簡(jiǎn)便等的優(yōu)點(diǎn)。 熒光法的缺點(diǎn)是，由于許多物質(zhì)不發(fā)射熒光，因此使它的應(yīng)用范圍受到限制。2022/9/3第9頁(yè)，共52頁(yè)，2

5、022年，5月20日，10點(diǎn)6分，星期一四、熒光法的基本原理 1）激發(fā)光譜和熒光光譜2）激發(fā)光譜和熒光光譜的的形狀及其關(guān)系3）物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)和熒光的關(guān)系4）環(huán)境對(duì)熒光的影響 2022/9/3第10頁(yè)，共52頁(yè)，2022年，5月20日，10點(diǎn)6分，星期一1）激發(fā)光譜和熒光光譜 任何發(fā)射熒光的物質(zhì)都具有兩個(gè)特征光譜，即發(fā)射光譜（excitation spectrum）和熒光光譜(fluorescence spectrum)。它們是熒光分析中定性和定量的基礎(chǔ)。 熒光物質(zhì)的最大激發(fā)波長(zhǎng)（ex）和最大熒光波長(zhǎng)（em）是鑒別物質(zhì)的根據(jù)，也是定量測(cè)定時(shí)的最靈敏的條件。2022/9/3第11頁(yè)，共52頁(yè)，20

6、22年，5月20日，10點(diǎn)6分，星期一1）激發(fā)光譜和熒光光譜激發(fā)光譜 ： 如果將激發(fā)光的光源用單色器分光，測(cè)定不同波長(zhǎng)的激發(fā)光的照射下，熒光最強(qiáng)處熒光強(qiáng)度的變化，以激發(fā)波長(zhǎng)（）為橫坐標(biāo)，熒光強(qiáng)度（IF）為縱坐標(biāo)作圖，便可得到熒光物質(zhì)的激發(fā)光譜。 2022/9/3第12頁(yè)，共52頁(yè)，2022年，5月20日，10點(diǎn)6分，星期一1）激發(fā)光譜和熒光光譜熒光光譜 ：固定激發(fā)光波長(zhǎng)和強(qiáng)度，而讓物質(zhì)發(fā)射的熒光通過單色器分光，以測(cè)定不同波長(zhǎng)的熒光強(qiáng)度。以熒光波長(zhǎng)（）為橫坐標(biāo)，熒光強(qiáng)度（IF）為縱坐標(biāo)作 圖，便可得到熒光物質(zhì)的熒光光譜。 2022/9/3第13頁(yè)，共52頁(yè)，2022年，5月20日，10點(diǎn)6分，星

7、期一 2）激發(fā)光譜和熒光光譜的的形狀及其關(guān)系 熒光物質(zhì)的激發(fā)光譜和熒光光譜形狀相似。這是因?yàn)槲镔|(zhì)分子吸收了一定波長(zhǎng)的紫外光后，才能發(fā)射出熒光。吸收越多，發(fā)射的熒光強(qiáng)度也越強(qiáng)。 一般把激發(fā)光譜看作是熒光物質(zhì)的表觀吸收光譜。激發(fā)光譜和熒光光譜呈現(xiàn)大致的鏡像對(duì)稱關(guān)系。 2022/9/3第14頁(yè)，共52頁(yè)，2022年，5月20日，10點(diǎn)6分，星期一3）物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)和熒光的關(guān)系 了解熒光和物質(zhì)分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系，可以幫助我們考慮如何將非熒光物質(zhì)轉(zhuǎn)化為熒光物質(zhì)或?qū)晒鈴?qiáng)度不大或選擇性不高的物質(zhì)轉(zhuǎn)化為熒光強(qiáng)度大及選擇性高的熒光物質(zhì)，以提高分析的效果。2022/9/3第15頁(yè)，共52頁(yè)，2022年，5月20日，

8、10點(diǎn)6分，星期一3）物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)和熒光的關(guān)系 物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)與熒光的發(fā)生及熒光強(qiáng)度的大小緊密相關(guān)。 分子產(chǎn)生熒光必須具備2個(gè)條件： （1）物質(zhì)分子必須具有能吸收一定頻率紫外光的特定結(jié)構(gòu) （2）物質(zhì)分子吸收了特征頻率的輻射能之后，必須具有較高的熒光效率。熒光效率大，在相同的濃度下，熒光的發(fā)射強(qiáng)度也大。 2022/9/3第16頁(yè)，共52頁(yè)，2022年，5月20日，10點(diǎn)6分，星期一3）物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)和熒光的關(guān)系1、具有共軛雙鍵體系的分子。共軛程度越大，分子的熒光效率越大。 2、具有剛性平面結(jié)構(gòu)的分子。剛性的不飽和的平面結(jié)構(gòu)具有較高的熒光效率，分子剛性及共平面性越大，熒光效率越高。 3、苯環(huán)上取

9、代基的類型。給電子基團(tuán)常使熒光增強(qiáng)，吸電子基團(tuán)及鹵素會(huì)減弱甚至破壞熒光。 2022/9/3第17頁(yè)，共52頁(yè)，2022年，5月20日，10點(diǎn)6分，星期一4）環(huán)境對(duì)熒光的影響 分子所處的環(huán)境，如溫度、溶劑、PH值等都會(huì)影響分子結(jié)構(gòu)和立體構(gòu)像，從而影響熒光強(qiáng)度 。 （1）溫度：一般說來，大多數(shù)熒光物質(zhì)的溶液隨著溫度的降低，熒光效率和熒光強(qiáng)度將增加；相反，溫度升高熒光效率將下降 。 （2）溶劑：同一種熒光物質(zhì)溶于不同的溶劑，其熒光光譜的位置和強(qiáng)度可能有明顯的不同。一般情況下，隨著溶劑的極性增加，熒光強(qiáng)度將增強(qiáng)。 2022/9/3第18頁(yè)，共52頁(yè)，2022年，5月20日，10點(diǎn)6分，星期一4）環(huán)境對(duì)

10、熒光的影響（ 3）溶劑PH值的影響，當(dāng)熒光物質(zhì)是弱酸或弱堿時(shí)，溶劑PH值對(duì)熒光強(qiáng)度有較大影響。（4）猝滅劑的影響，熒光猝滅是指熒光物質(zhì)與溶劑子或其他溶質(zhì)分子相互作用，引起熒光強(qiáng)度降低、消失或熒光強(qiáng)度與濃度不呈線性的關(guān)系的現(xiàn)象。引起熒光猝滅的物質(zhì)稱為猝滅劑（quencher）。常見的猝滅劑有鹵素離子、重金屬離子、氧分子、以及硝基化合物、重氮化合物、羰基化合物等。2022/9/3第19頁(yè)，共52頁(yè)，2022年，5月20日，10點(diǎn)6分，星期一五、熒光分光光度計(jì)的結(jié)構(gòu)發(fā)光源：采用高壓氙燈。試樣池：熒光分析用的試樣池需用低熒光材料，常用石英池，形狀為四面透光的方形。檢測(cè)器：熒光的強(qiáng)度比較弱，因此要求檢測(cè)

11、器有較高的靈敏度，常用光電倍增管。單色器：采用光柵作為單色器。2022/9/3第20頁(yè)，共52頁(yè)，2022年，5月20日，10點(diǎn)6分，星期一六、熒光的定量分析 1、熒光測(cè)定的線性范圍一般在10-5100g/ml。當(dāng)濃度較高時(shí)，吸光度（A）0.05時(shí)，由于自猝滅和自吸收等原因，熒光強(qiáng)度與濃度不呈線性關(guān)系，熒光強(qiáng)度同濃度的線性關(guān)系將向濃度軸偏離，發(fā)生負(fù)偏差。2、與紫外-可見分光光度法相同，也可采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法和標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照法。2022/9/3第21頁(yè)，共52頁(yè)，2022年，5月20日，10點(diǎn)6分，星期一六、熒光的定量分析 3、測(cè)量條件的選擇 選擇線性范圍：當(dāng)熒光物質(zhì)溶液的吸光度A0.05時(shí)，熒光強(qiáng)度與濃

12、度才呈線性關(guān)系。 選擇合適的激發(fā)光和熒光波長(zhǎng)：一般選擇激發(fā)光譜中能產(chǎn)生最強(qiáng)熒光的入射光波長(zhǎng)作為激發(fā)光，熒光光譜選擇最強(qiáng)熒光的波長(zhǎng)作為熒光測(cè)定的波長(zhǎng)。2022/9/3第22頁(yè)，共52頁(yè)，2022年，5月20日，10點(diǎn)6分，星期一七、熒光分光度計(jì)的性能可檢測(cè)熒光、磷光及生物發(fā)光掃描速度快，可達(dá)24000 nm/分，數(shù)據(jù)采集速率達(dá)80次/秒波長(zhǎng)范圍：190-1100 nm光譜帶寬：1.5、2.5、5、10和20 nm五檔切換具有液體池和固體池，并具有自動(dòng)控溫設(shè)備。2022/9/3第23頁(yè)，共52頁(yè)，2022年，5月20日，10點(diǎn)6分，星期一八、熒光分光度計(jì)的使用 1、開啟計(jì)算機(jī)，鍵入用戶名和密碼，打

13、開分光光度計(jì)主機(jī)，運(yùn)行Cary Eclipse軟件。2、按樣品的測(cè)定要求進(jìn)入相應(yīng)的測(cè)定模塊。3、設(shè)定測(cè)定參數(shù)，按操作流程測(cè)試樣品，測(cè)定結(jié)果保存或打印。4、測(cè)試完畢后，在系統(tǒng)指定的出口退出系統(tǒng)；先關(guān)閉分光光度計(jì)主機(jī)電源，再關(guān)閉電腦，切斷總電源。5、罩上儀器罩，打掃室內(nèi)衛(wèi)生，并在儀器使用登記本上填寫使用記錄。2022/9/3第24頁(yè)，共52頁(yè)，2022年，5月20日，10點(diǎn)6分，星期一操作軟件包2022/9/3第25頁(yè)，共52頁(yè)，2022年，5月20日，10點(diǎn)6分，星期一定性分析操作2022/9/3第26頁(yè)，共52頁(yè)，2022年，5月20日，10點(diǎn)6分，星期一預(yù)掃描2022/9/3第27頁(yè)，共52

14、頁(yè)，2022年，5月20日，10點(diǎn)6分，星期一2022/9/3第28頁(yè)，共52頁(yè)，2022年，5月20日，10點(diǎn)6分，星期一移除譜圖2022/9/3第29頁(yè)，共52頁(yè)，2022年，5月20日，10點(diǎn)6分，星期一定性掃描參數(shù)設(shè)置2022/9/3第30頁(yè)，共52頁(yè)，2022年，5月20日，10點(diǎn)6分，星期一設(shè)置錯(cuò)誤2022/9/3第31頁(yè)，共52頁(yè)，2022年，5月20日，10點(diǎn)6分，星期一2022/9/3第32頁(yè)，共52頁(yè)，2022年，5月20日，10點(diǎn)6分，星期一2022/9/3第33頁(yè)，共52頁(yè)，2022年，5月20日，10點(diǎn)6分，星期一2022/9/3第34頁(yè)，共52頁(yè)，2022年，5月2

15、0日，10點(diǎn)6分，星期一2022/9/3第35頁(yè)，共52頁(yè)，2022年，5月20日，10點(diǎn)6分，星期一譜圖存貯2022/9/3第36頁(yè)，共52頁(yè)，2022年，5月20日，10點(diǎn)6分，星期一圖譜格式-FBSW2022/9/3第37頁(yè)，共52頁(yè)，2022年，5月20日，10點(diǎn)6分，星期一數(shù)據(jù)格式-CSV2022/9/3第38頁(yè)，共52頁(yè)，2022年，5月20日，10點(diǎn)6分，星期一定量分析操作2022/9/3第39頁(yè)，共52頁(yè)，2022年，5月20日，10點(diǎn)6分，星期一2022/9/3第40頁(yè)，共52頁(yè)，2022年，5月20日，10點(diǎn)6分，星期一參數(shù)設(shè)置2022/9/3第41頁(yè)，共52頁(yè)，2022年

16、，5月20日，10點(diǎn)6分，星期一2022/9/3第42頁(yè)，共52頁(yè)，2022年，5月20日，10點(diǎn)6分，星期一標(biāo)準(zhǔn)樣品設(shè)置2022/9/3第43頁(yè)，共52頁(yè)，2022年，5月20日，10點(diǎn)6分，星期一待測(cè)樣品設(shè)置2022/9/3第44頁(yè)，共52頁(yè)，2022年，5月20日，10點(diǎn)6分，星期一空白校零2022/9/3第45頁(yè)，共52頁(yè)，2022年，5月20日，10點(diǎn)6分，星期一開始測(cè)定2022/9/3第46頁(yè)，共52頁(yè)，2022年，5月20日，10點(diǎn)6分，星期一2022/9/3第47頁(yè)，共52頁(yè)，2022年，5月20日，10點(diǎn)6分，星期一2022/9/3第48頁(yè)，共52頁(yè)，2022年，5月20日，10點(diǎn)6分，星期一重新計(jì)算2022/9/3第49頁(yè)，共52頁(yè)，2022年，5月20日，10點(diǎn)6分，星期一2022/9/3第5