真核細(xì)胞rna提取的實(shí)驗(yàn)報告范文

1、真核細(xì)胞 rna 提取的實(shí)驗(yàn)報告范文篇一：真核細(xì)胞RNA的提取一原理本方法利用鹽酸胍抑制 RNA酶，勻漿裂解細(xì)胞，采用有機(jī)溶劑 抽提去除蛋白質(zhì)。通過選擇性沉淀 RNA分子去除DNA。二方法樣品處理組織樣品處理：取新鮮的組織樣品稱重后，剪碎成約1cm2的組織塊直接加入勻漿液中進(jìn)行 RNA提取，或液氮中速凍-70C保存。貼壁培養(yǎng)細(xì)胞處理：用PBS洗細(xì)胞一次，吸干溶液后將培養(yǎng)板 快速移至液氮中冷凍后轉(zhuǎn)到-70C保存；或加入1ml勻漿至培養(yǎng)板中 直接裂解細(xì)胞，然后將粘稠的裂解液進(jìn)一步勻漿。懸浮培養(yǎng)細(xì)胞處理：離心收集細(xì)胞，用PHS懸浮漂洗再田心收 集，若不立即提取RNA,則可經(jīng)液氮速凍后轉(zhuǎn)至一 70C貯

2、存?zhèn)溆谩?加 l 倍體積鹽酸胍勻漿液 至準(zhǔn)備好的樣品細(xì)胞中，高速勻漿 1min。勻漿液5000g,室溫離心10min。4將上清移至一個干凈離心管中，加入 0.1 體積的 3molL 乙 酸鈉（PH5.2）,混勻，再加5體積預(yù)冷的乙醇，立即充分混勻，-20C 放置至少 2 小時。5000g 0C離心10分鐘沉淀核酸，棄上清液，室溫干燥。每個提取RNA的組織或細(xì)胞樣品中，加入1015min鹽酸胍勻漿液攪拌溶解 加入2.5體積預(yù)冷的乙醇，立即充分混勻，-20C至少放置2 小時。5000g 0C離心10分鐘沉淀核酸，去上清，室溫?fù)]發(fā)乙醇。 按每克組織細(xì)胞加 5min 的比例.分兩次加入 0.02mol

3、L EDTA(pH8.0)先加1/2體積EDTA振蕩I2分鐘，3000g離心2min.吸 出上清.再加另一個1/2體積的EDTA振蕩I 一 2分鐘.合并兩次核酸 溶解液。.用等體積氯仿正丁醇 (4：1)抽提核酸溶液， 5000g 室溫離 心I0min , 5000g室溫離心10min。吸出上清至另一個干凈離心管中。加3倍體積Imol/L乙酸鈉(PH7.0)混勻，-20C放置1h以 上，此時RNA將選擇地沉淀，而DNA仍為溶解狀況。5000g, 0C離心20min,沉于管底的是 RNA吸去上清，用4C預(yù)冷的lmol/L乙酸鈉(pH7. 0)漂洗RNA 沉淀。然后20C 5000g,離心20分鐘。

4、回收RNA。 盡量去除上清液。按每g組織細(xì)胞1m的比例加入RNA溶解 液(0.2% SDS0.5% mol/L EDTApH8.0)。注意：若有 SDS沉淀析出.滴 加 0.11mol/L NaOH調(diào)溶液 pH 至 7. 5。加入2倍體積冰預(yù)冷乙醇混勻，0 C放置至少2小時，5000g, 4C離心10分鐘，RNA沉淀用70%乙醇漂洗，短暫離心后，棄上清， 室溫干燥蒸發(fā)乙醇。用適當(dāng)小容積DEPC處理過的ddH2O溶解RNA沉淀，加入3倍體積乙醇，-70C保存RNA備用。用時.加入0.1體積的3mol/L乙酸鈉， 混勻，120 xxg, 4 C離心回收RNA。三.試劑鹽酸胍勻漿液I成分：8mol/

5、 L鹽酸胍（分子量為95.6）,O.1mol/L乙酸鈉（pH5.2）, 5mmolL 2巰基乙醇， 0.5十二烷基肌氨酸鈉配制方法：取191g鹽酸胍.加8.35m1 3mol /L乙酸鈉（pH5. 2） 和6. 25ml 0. 2mol/L 2-琉基乙醇溶液中，再加水至 237. 5ml，混 勻后加 12. 5ml 10十二烷基肌氨酸鈉 ,振蕩混勻溶解。鹽酸胍勻漿液H成 分 ： 8molL 鹽酸 胍（分 子 量 力 95.6）,0.1molL 乙 酸 鈉 （pH5. 2）,1mmolL 2琉基乙醇， 20mmolL EDTA（pH8.0）配制方法：取191g鹽酸胍，加日.35ml 3mol/1

6、。乙酸鈉（pH5. 2） 和 1 . 25ml 0. 2molL 2巰基乙醇溶液中，再加入 10ml 0.5molL EDTA（pH8.0。） 加水至 250ml 混勻。乙醇4.70乙醇5.氯仿一正丁醇（4: l,體積比）6.4mol /L 乙醇鈉，pH7.07.3mol /L 乙醇鈉，pH5.28.RNA溶解液成分：0. 2%SDS 0.05mol/L EDTA, pH8.0四、說明提取RNA時，要特別注意防止 RNase的污染，所用玻璃器皿均 應(yīng)用0.1%的二乙基焦碳酸鹽（diethyl pyrocarbonate, DEPC處理。塑 料器材均使用一次性用品，并高壓滅菌處理，必要時，也可用

7、 0.1%DEPC處理。篇二：真核細(xì)胞RNA的提取RNA是基因表達(dá)產(chǎn)物，由以下幾類分子組成，rRNA （占細(xì)胞總RNA的80%85%）、tRNA和核內(nèi)小分子 RNA （占1015%）、mRNA （占15%）。其中mRNA是分子生物學(xué)的主要研究對象，分離制備 mRNA是克隆基因，分析基因表達(dá)以及建立 cDNA文庫的首要步驟。真核細(xì)胞總 RNA 分離提取的目的是要獲得高純度的具有充分長 度的RNA分子，包括RNA的純度和完整性。RNA分離的關(guān)鍵是盡量 減少RNA酶的污染。RNA酶活性非常穩(wěn)定，分布廣泛，除細(xì)胞內(nèi)源 性的RNA酶外，環(huán)境中也存在 RNA酶。因此在提取RNA時，應(yīng)盡量 創(chuàng)造一個無RNA

8、酶的環(huán)境，包括去除外源性 RNA酶的污染和抑制內(nèi) 源性RNA酶活性。主要是采用RNA酶的阻抑蛋白RNasin和強(qiáng)力的蛋 白質(zhì)變性劑鹽酸胍或異硫氰酸胍抑制內(nèi)源性 RNA 酶,采用焦碳酸二 乙酯（DEPC去除外源性RNA酶。、RNA提取的關(guān)鍵真核細(xì)胞RNA的提取過程有四個關(guān)鍵點(diǎn)，即樣品(細(xì)胞或組 織)的有效破碎；有效地使核蛋白復(fù)合體變性；對內(nèi)源 RNA酶 的有效抑制；有效地將 RNA從DNA和蛋白混合物中分離；其中最 關(guān)鍵的是抑制RNA酶活性。提取的 RNA可以用于核酸雜交、cDNA 合成以及體外翻譯等。二、組織RNA提取的基本步驟儀器：勻漿器、低溫離心機(jī)、離心管。2試劑：氯仿、75%乙醇、異丙醇

9、、DEPC容液、1%甲醛變性膠、37%甲醛、 3%過氧化氫、甲酰胺、RNA上樣緩沖液。3.主要步驟(1)取組織50100mg,加0.8ml Trizol沖洗勻漿器，移入同一離心管，冰上靜置 5min。氯仿，充分震蕩混勻，靜置0.5ml 異丙醇，顛倒混勻。1ml 75%乙醇溶液，漂洗沉淀，10min。l DEPC溶液，充分溶解 RNARNA溶解液，按一定比例稀釋后，紫外分光光度計測值，計算 OD260/OD280OD260= 1時，RNA濃度約為)=OD260X稀釋倍數(shù)x 401%甲醛變性膠電泳觀察甲醛變性凝膠板：4.5卩l(xiāng) RNA 120 xxgXC靜置2h, 4C 1.72.0, 根據(jù)下述公

10、式計算x甲醛膠電泳緩沖液，離心。棄沉淀。x 10minx 5min離心。：1之間，說明RNA濃度：3%過氧化3.5卩I 37%甲(2) 加 0.2ml3min, 4C 15min(3)取上清，加入 204C, 120 xxg離心。(4) 棄上清，取沉淀，加入， 7500g( 5)棄上清，沉淀真空干燥( 6)加 40卩。4.結(jié)果鑒定(1)紫外分光光度計檢測：取定260nm、280nmOD 比值，如果比值在RNA純度可。 標(biāo)準(zhǔn)樣品當(dāng)40卩g/mlRNA濃度(卩 g/ml。(2)電泳檢測：RNA質(zhì)量，電泳槽及制膠板先用氫浸泡過夜；制 1%， 2ul 5醛，10ul甲酰胺，離心混勻，65C變性15mi

11、n后，迅速置冰浴中； 再加入2卩l(xiāng) RNA上樣緩沖液，離心混勻后上樣，6V/cm電壓，電泳1 2h;暗室內(nèi)紫外光下觀察，拍照；如果觀察到清晰的18S 28S RNA電泳帶，無大量小分子 RNA,說明RNA無明顯降解，樣品70C保 存?zhèn)溆?。三、注意事?、所有玻璃器皿160180C高溫干烤6h以上，非耐高溫器皿 經(jīng)0.1% DEP(液浸泡后，經(jīng)高溫(15磅，20min )處理滅活RNA酶， 所用試劑均用DEPC水配制，然后高壓處理。2、實(shí)驗(yàn)用水要經(jīng)DEPC處理，但含Tris的試劑不能用DEPC處理。3、 實(shí)驗(yàn)操作過程中要戴一次性手套，以避免RNA酶污染。藥大 0942605 篇三：真核細(xì)胞 rn

12、a 提取實(shí)驗(yàn)原理： 根據(jù)成熟雌蟾蜍體內(nèi)含大量卵細(xì)胞且可以方便獲取， 細(xì)胞內(nèi)含核 酸豐富，沒有其它組織器官等的干擾等優(yōu)點(diǎn)以確定蟾蜍卵細(xì)胞為實(shí)驗(yàn) 所需的真核細(xì)胞。通過 TRIZOL溶液中變性劑破碎真核細(xì)胞，然后經(jīng) 過氯仿等有機(jī)溶劑抽提RNA,再利用RNA不溶于異丙醇的性質(zhì)將自 身析出，達(dá)到分離提純的目的。TRIzo I的主要成分是苯酚。苯酚的主要作用是裂解細(xì)胞，使細(xì)胞 中的蛋白，核酸物質(zhì)解聚得到釋放。苯酚雖可有效地變性蛋白質(zhì)，但 不能完全抑制RNA酶活性，因此TRIzoI中還加入了 8羥基喹啉、異 硫氰酸胍、B -巰基乙醇等來抑制內(nèi)源和外源 RNase （RNA酶）。0.1% 的8-羥基喹啉可以抑

13、制RNase與氯仿聯(lián)合使用可增強(qiáng)抑制作用。 異硫氰酸胍屬于解偶劑， 是一類強(qiáng)力的蛋白質(zhì)變性劑， 可溶解蛋白質(zhì) 并使蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)消失， 導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)降解， 核蛋白迅速與核酸分 離。8 -巰基乙醇的主要作用是破壞 RNase蛋白質(zhì)中的二硫鍵。甲基綠吡羅紅為堿性染料，它分別能與細(xì)胞內(nèi)的DNA、 RNA結(jié)合呈現(xiàn)不同顏色。 當(dāng)甲基綠與吡羅紅作為混合染料時， 甲基綠與染 色質(zhì)中 DNA 選擇性結(jié)合顯示綠色或藍(lán)色；吡羅紅與核仁、細(xì)胞質(zhì)中 的 RNA 選擇性結(jié)合顯示紅色。其原因可能是兩種染料的混合染液中 有競爭作用，同時兩種核酸分子都是多聚體， 而其聚合程度有所不同。 甲基綠易與聚合程度高的 DNA 結(jié)合呈

14、現(xiàn)綠色。而吡羅紅則與聚合程 度較低的RNA結(jié)合呈現(xiàn)紅色（但解聚的 DNA也能和派洛寧結(jié)合呈現(xiàn) 紅色）。即RNA對派洛寧親和力大，被染成紅色，而DNA對甲基綠親 和力大，被染成綠色。 09419實(shí)驗(yàn)材料：（一）試劑1甲基綠一吡羅紅染料：染色劑 A液的兩種配制方法第一種方法：取吡羅紅甲基綠粉 1g,加入到100mL蒸餾水中溶 解，然后用濾紙過濾，將濾液放入棕色瓶中備用。第二種方法：取甲基綠 2g 溶于 98mL 蒸餾水中，取吡羅紅 G5g 溶于95mL蒸餾水中。取6mL甲基綠溶液和2mL吡羅紅溶液加入到 16mL蒸餾水中，即為A液，放入棕色瓶中備用。（注意：用于核酸染 色的是吡羅紅G,請不要錯買吡

15、羅紅B。）染色劑B液的配制方法B液是一種緩沖液，由乙酸鈉和乙酸混 合而成。先取乙酸鈉16.4g，用蒸餾水溶解至1000mL備用；再取乙 酸12mL,用蒸餾水稀釋至1000mL備用。取配好的乙酸鈉溶液 30mL 和稀釋的乙酸20mL，加蒸餾水50mL,配成pH為4.8的B液（緩沖 液）。染色劑的配制染色劑是由 A液、B液混合配制而成的。取A液 20mL和B液80mL混合，就是實(shí)驗(yàn)中所用的吡羅紅甲基綠染色劑。 應(yīng)該注意的是該試劑應(yīng)現(xiàn)配現(xiàn)用。TRIZO試劑（Invitrogen 公司購買）3.75%乙醇氯仿異丙醇Nacl（0.14m/l）（二）器材1.離心機(jī)（ 3000r.p.m）2.冰浴3研缽燒杯

16、量筒試管玻棒膠頭滴管 9離心管天平實(shí)驗(yàn)方法：制備勻漿：以班級為單位，稱取大概10g蟾蜍卵細(xì)胞（23C保存），于研缽 （可置于冰浴鍋上）中，根據(jù) 1030mg 組織細(xì)胞加 1mltrizol 試劑的 量加入其中，快速研磨，制備勻漿。實(shí)驗(yàn)二人合作為一組，每組取大 概 10ml 勻漿。RNA的提?。喝』貏驖{后，室溫靜置 10min ，使樣品充分裂解 離心(3000r.p.s)20min取上清液移至新的離心管加1/5TRIZ0L容液體積氯仿在手中反復(fù)振蕩搖勻，室溫靜置10min 。離心20mins取上清液一一在上清中加入等體積冰冷的異丙醇，室溫放 置10min。 充分混勻，靜置10minute 離心20min 沉淀用 75%乙醇洗滌兩次定性試驗(yàn)：取2支干凈