2-t淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)

1、2-t淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)2-t淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)第1頁(yè)T淋巴細(xì)胞增殖分化、DNA等大分 子物質(zhì)合成增加淋巴母細(xì)胞刺激物PHA體積變大胞漿增多、空泡核仁顯著核染色質(zhì)疏松基礎(chǔ)原理有絲分裂同位素法MTT法形態(tài)法2-t淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)第2頁(yè)檢測(cè)方法： 形態(tài)學(xué)計(jì)數(shù)法 MTT法 同位素法2-t淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)第3頁(yè)試驗(yàn)?zāi)繕?biāo)試驗(yàn)原理試劑與器材操作步驟結(jié)果判斷注意事項(xiàng)試驗(yàn)討論教學(xué)內(nèi)容：2-t淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)第4頁(yè)一、形態(tài)學(xué)計(jì)數(shù)法2-t淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)第5頁(yè)試驗(yàn)?zāi)繕?biāo)1.掌握T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)原理。2.熟悉淋巴母細(xì)胞形態(tài)特征及判定方法。2-t淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)第6頁(yè) T淋巴細(xì)胞在有絲分裂原PHA等刺激后，細(xì)胞形態(tài)和代謝

2、發(fā)生改變，發(fā)生一系列增殖反應(yīng)，如出現(xiàn)細(xì)胞體積增大、核染色質(zhì)疏松、蛋白質(zhì)和核酸合成增加，并轉(zhuǎn)化為淋巴母細(xì)胞。 試驗(yàn)原理2-t淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)第7頁(yè)1. RPMIl640 培養(yǎng)液 。包含： 小牛血清10%、青霉素 100u/m1 、鏈霉素 100ug/m1，用無(wú)菌3% NaHCO3 調(diào) pH 至 7.27.4。2. 植物血凝素（PHA）。用含10%小牛血清RPMI 培養(yǎng)液稀釋至5001000g/ml。 試劑與器材 2-t淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)第8頁(yè)3. 姬姆薩染液。4. 標(biāo)本 肝素抗凝人外周靜脈血。5器材 細(xì)胞培養(yǎng)瓶、CO2培養(yǎng)箱、超凈臺(tái)、高壓滅菌器、無(wú)菌過(guò)濾裝置、離心機(jī)、顯微鏡等。試劑與器材 2-t淋

3、巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)第9頁(yè)5%CO2 37 72h1500rpm 離心10min染色鏡檢觀察細(xì)胞形態(tài)PHA無(wú)PHA外周血0.2ml吸收白細(xì)胞層涂片操作步驟2-t淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)第10頁(yè) 1取肝素抗凝血0.2ml，注入預(yù)先加有1.8 ml RPMI 1640培養(yǎng)液培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，同時(shí)加入PHA(500g/ml )0.1 ml，對(duì)照瓶?jī)?nèi)不加PHA?；靹蚝笾?7C、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育72h，期間天天旋轉(zhuǎn)搖勻一次。2培養(yǎng)結(jié)束后，棄去上清，混勻細(xì)胞，加入離心管中，1500rpm 離心10min。操作步驟2-t淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)第11頁(yè) 3棄上清，吸收白細(xì)胞層制片，自然干燥。 4甲醇固定12min后，姬姆薩染色15

4、20min，水洗，干燥。 5油鏡下計(jì)數(shù)200個(gè)淋巴細(xì)胞，觀察淋巴細(xì)胞形態(tài)改變，計(jì)算淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率。操作步驟2-t淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)第12頁(yè)2-t淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)第13頁(yè)淋巴細(xì)胞標(biāo)志及功效檢測(cè) 龔道科 .4未轉(zhuǎn)化淋巴細(xì)胞淋巴母細(xì)胞結(jié)果判斷2-t淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)第14頁(yè) 未轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)化淋巴細(xì)胞形態(tài)特征轉(zhuǎn)化淋巴細(xì)胞未轉(zhuǎn)化淋巴細(xì)胞淋巴母細(xì)胞 過(guò)渡型細(xì)胞大小(直徑m)1220121668核大小、染色質(zhì)增大、疏松增大、疏松不增大、密集核仁清楚、14個(gè)有或無(wú)無(wú)有絲分裂有或無(wú)無(wú)無(wú)胞質(zhì)、著色增多、嗜堿增多、嗜堿極少、天青色漿內(nèi)空泡有或無(wú)有或無(wú)無(wú)偽足有或無(wú)有或無(wú)無(wú)2-t淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)第15頁(yè)四、結(jié)果觀察 能夠見到以

5、下幾個(gè)類型細(xì)胞(1) 成熟小淋巴細(xì)胞：與未經(jīng)培養(yǎng)小淋巴細(xì)胞一樣為 6 -8 um ，核染色致密，無(wú)核仁，核與胞漿百分比大，胞漿染色為輕度嗜堿性。 2-t淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)第16頁(yè)淋巴細(xì)胞標(biāo)志及功效檢測(cè) 龔道科 .42-t淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)第17頁(yè)(2) 淋巴母細(xì)胞： 細(xì)胞體積增大，約 20 - 30 um ，形態(tài)不整齊，常有小突出，核質(zhì)染色疏松，有核仁 l - 2 個(gè)，胞漿變寬，常出現(xiàn)胞漿空泡。2-t淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)第18頁(yè)2-t淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)第19頁(yè)淋巴細(xì)胞標(biāo)志及功效檢測(cè) 龔道科 .42-t淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)第20頁(yè)(3) 過(guò)渡型淋巴細(xì)胞： 比小淋巴細(xì)胞大，約 l0 - 20 u m ，核染色致

6、密，但出現(xiàn)核仁，此為與成熟小淋巴細(xì)胞判別關(guān)鍵點(diǎn)。2-t淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)第21頁(yè)結(jié)果判斷2-t淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)第22頁(yè)2-t淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)第23頁(yè)(4) 其它細(xì)胞： 如中性粒細(xì)胞在培養(yǎng) 72h 后，絕大個(gè)別衰變或死亡，呈碎片。 2-t淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)第24頁(yè)2 淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率計(jì)算：按上述分類檢驗(yàn)推片頭、體、尾三個(gè)別，分別計(jì)數(shù)淋巴母細(xì)胞、過(guò)渡型母細(xì)胞和核有絲分裂相細(xì)胞以及成熟小淋巴細(xì)胞，以前三者為轉(zhuǎn)化細(xì)胞，每份標(biāo)本計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞，按以下公式計(jì)算轉(zhuǎn)化率：2-t淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)第25頁(yè)2-t淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)第26頁(yè)在正常情況下， PHA 誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率為 60 一 80 ，如為 50 一 60

7、 則偏低， 50 以下則為降低。2-t淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)第27頁(yè) 1 培養(yǎng)基成份對(duì)轉(zhuǎn)化率影響較大，注意其使用期。 2 小牛血清用前需滅活。 3 培養(yǎng)時(shí)要確保有足夠氣體，確保無(wú)菌。 4 PHA 劑量過(guò)大對(duì)細(xì)胞有毒性，PHA 轉(zhuǎn)化反應(yīng)劑量普通 10m1，培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)液體總量不要超出 2m1 ，太小不足以刺激淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化，試驗(yàn)前應(yīng)先測(cè)定。 注意事項(xiàng)2-t淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)第28頁(yè)二、MTT比色法2-t淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)第29頁(yè)試驗(yàn)?zāi)繕?biāo) 熟悉MTT比色法進(jìn)行淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)原理及其操作方法。 2-t淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)第30頁(yè)一、原理 T淋巴細(xì)胞受到PHA作用后發(fā)生活化增殖，其胞內(nèi)線粒體琥珀酸脫氫酶活性對(duì)應(yīng)升高，四

8、甲基噻唑藍(lán)（MTT）作為其底物參加反應(yīng)，被催化形成藍(lán)紫色結(jié)晶甲臢(fomazan) ，經(jīng)鹽酸異丙醇或溶解后為藍(lán)色溶液。甲臢形成量與細(xì)胞增殖活化程度呈正相關(guān)。 試驗(yàn)原理2-t淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)第31頁(yè)1. RPMIl640 培養(yǎng)液 。2. 植物血凝素（PHA）。3. 標(biāo)本 肝素抗凝人外周靜脈血。4. 器材 超凈臺(tái)、96孔細(xì)胞培養(yǎng)板、 CO2培養(yǎng)箱、高壓滅菌器、無(wú)菌過(guò)濾裝置、振蕩器、酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀等。 試劑與器材 2-t淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)第32頁(yè)5%CO2 37 68h1500rpm 離心10min酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀A570nm鹽酸異丙醇 100l/孔 操作步驟分離外周血單個(gè)核細(xì)胞1106/ ml 培養(yǎng)板

9、（含PHA） 培養(yǎng)板 （無(wú)PHA）加入MTT 20l/孔 4h100l/孔 2-t淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)第33頁(yè) 1.先采取密度梯度離心法分離外周血單個(gè)核細(xì) 胞，并用含10%小牛血清RPMI 1640培養(yǎng)液調(diào) 整細(xì)胞濃度至1106/ ml。2將細(xì)胞懸液加入96孔培養(yǎng)板中，100l/孔， 每個(gè)樣品三個(gè)復(fù)孔，并設(shè)對(duì)應(yīng)對(duì)照孔。試驗(yàn)孔 加含50g/mlPHA(終濃度5g/ml) 100l， 對(duì)照孔加不含PHA1640培養(yǎng)液100l， 3混勻后置37C、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)68h。操作步驟2-t淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)第34頁(yè)4將培養(yǎng)板1500 rpm離心10min，吸棄上清 液，每孔加MTT20l，混勻，繼續(xù)培

10、養(yǎng)4h 后，每孔加100l鹽酸異丙醇，低速振蕩10 min。5充分溶解后，采取酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀雙波長(zhǎng) 570nm/630nm測(cè)定各孔A值，測(cè)定值為A570nm 減去A630nm最終止果。 操作步驟2-t淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)第35頁(yè)結(jié)果判斷以刺激指數(shù)(SI)判斷淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化程度：2-t淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)第36頁(yè)1.試驗(yàn)過(guò)程注意無(wú)菌操作。因?yàn)楸驹囼?yàn)需要培養(yǎng)3 天才能觀察結(jié)果。所以，在操作時(shí)應(yīng)防止細(xì)菌 污染造成試驗(yàn)失敗。2淋巴細(xì)胞要新鮮制備, 普通在采血后2h內(nèi)進(jìn)行 試驗(yàn)。操作時(shí)動(dòng)作要輕柔、快速，以免細(xì)胞損 傷而影響試驗(yàn)結(jié)果。注意事項(xiàng)2-t淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)第37頁(yè)3加入MTT比色法鹽酸異丙醇后要在30 mi

11、n內(nèi)進(jìn) 行測(cè)定，若要求時(shí)間內(nèi)來(lái)不及測(cè)定，可將未加 鹽酸異丙醇培養(yǎng)板置4C保留。測(cè)定前取 出，室溫靜置10min后再加鹽酸異丙醇。注意事項(xiàng)2-t淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)第38頁(yè)1.試討論MTT比色法淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)優(yōu)缺點(diǎn)？2. MTT比色法輕易因細(xì)菌污染造成試驗(yàn)失敗，應(yīng)采取哪些辦法可降低試驗(yàn)誤差，使結(jié)果可信？試驗(yàn)討論2-t淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)第39頁(yè)三、3H-TdR摻入法2-t淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)第40頁(yè)試驗(yàn)?zāi)繕?biāo) 熟悉3H-TdR摻入法進(jìn)行淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)原理及其操作方法。2-t淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)第41頁(yè)一、原理 T淋巴細(xì)胞受PHA或特異性抗原刺激后，發(fā)生淋巴母細(xì)胞轉(zhuǎn)化，此過(guò)程中DNA合成顯著增加。此時(shí)把氚標(biāo)識(shí)胸

12、腺嘧啶核苷（3H-Thymidine riboside，3H-TdR）加入細(xì)胞培養(yǎng)液中，可被細(xì)胞攝取而摻入到新合成DNA中。 測(cè)定淋巴細(xì)胞內(nèi)放射量，即可判定淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化程度。 試驗(yàn)原理2-t淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)第42頁(yè)1. RPMIl640 培養(yǎng)液 。2. 植物血凝素（PHA）。3. 標(biāo)本 肝素抗凝人外周靜脈血。4. 3H-TdR工作液 以生理鹽水稀釋成100ci/ml，于4 保留備用。5閃爍液 避光保留。6器材 96孔細(xì)胞培養(yǎng)板、CO2培養(yǎng)箱、49型玻璃纖維濾 紙、多頭細(xì)胞搜集器、-液體閃爍計(jì)數(shù)儀、閃爍測(cè)量 杯。試劑與器材 2-t淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)第43頁(yè)5%CO2 37 56h液體閃爍器計(jì)數(shù)cpm搜集培養(yǎng)細(xì)胞于濾膜上操作步驟分離外周血單個(gè)核細(xì)胞1106/ ml 培養(yǎng)板（含PHA） 培養(yǎng)板 （無(wú)PHA）加入3H-TdR 10l/孔 100l/孔 5%CO2 37 16h2-t淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)第44頁(yè)結(jié)果判斷以刺激指數(shù)(SI)判斷淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化程