二代測(cè)序技術(shù)在非小細(xì)胞肺癌中的臨床應(yīng)用

1、NGS技術(shù)在非小細(xì)胞肺癌精準(zhǔn)治療中應(yīng)用第1頁目 錄123DNA測(cè)序技術(shù)介紹非小細(xì)胞肺癌精準(zhǔn)治療概述NGS檢測(cè)技術(shù)貫通非小細(xì)胞肺癌精準(zhǔn)治療全程第2頁DNA測(cè)序技術(shù)介紹PART 01第3頁DNA測(cè)序技術(shù)發(fā)展歷程一代測(cè)序技術(shù)二代測(cè)序技術(shù)(NGS)三代測(cè)序技術(shù)化學(xué)降解法雙脫氧鏈終止法（ Sanger法）熒光自動(dòng)測(cè)序技術(shù)雜交測(cè)序技術(shù)Roche企業(yè)454測(cè)序技術(shù)Illumina企業(yè)Solexa技術(shù)ABI企業(yè)SOLiD技術(shù)Life企業(yè)Ion Torrent技術(shù)Helicos企業(yè)Heliscope單分子測(cè)序儀Pacific Biosciences企業(yè)SMRT技術(shù)Oxford Nanopore Technolo

2、gies納米孔單分子測(cè)序技術(shù)孫海汐,王秀杰.DNA測(cè)序技術(shù)發(fā)展及其展望J.科研信息化技術(shù)與應(yīng)用,(03):18-29.20世紀(jì)中葉至20世紀(jì)末至今至今第4頁各大DNA測(cè)序技術(shù)比較技術(shù)代表技術(shù)通量時(shí)間優(yōu)勢(shì)劣勢(shì)第一代DNA測(cè)序Sanger（雙脫氧鏈終止法）為代表低1977年1）準(zhǔn)確率高2）讀長(zhǎng)較NGS長(zhǎng)1）通量低、成本高2）對(duì)樣本中腫瘤細(xì)胞含量和百分比要求較高3）靈敏度低第二代DNA測(cè)序（NGS）邊合成邊測(cè)序高1）大規(guī)模平行測(cè)序2）定量3）比 Sanger技術(shù)成本低廉4）靈敏度高，適適用于起始濃度很低樣本（液態(tài)活檢）1）錯(cuò)誤率較Sanger測(cè)序高2）樣本建庫流程繁瑣3）屢次PCR存在系統(tǒng)誤差，無法

3、經(jīng)過后續(xù)加深測(cè)序糾正4）數(shù)據(jù)量大，對(duì)后續(xù)數(shù)據(jù)拼接、生物信息學(xué)分析要求極高第三代DNA測(cè)序單分子測(cè)序中-高1）讀長(zhǎng)長(zhǎng)2）單分子測(cè)序，無需建庫、模板擴(kuò)增，保留樣本最原始信息。3）測(cè)序同時(shí)可檢測(cè)堿基修飾情況，如甲基化、乙?；?）能夠做全轉(zhuǎn)錄本測(cè)序，分析可變剪切1）因?yàn)榻◣鞜o需PCR，所以對(duì)于上機(jī)樣本濃度要求較高2）測(cè)序成本較NGS高3）當(dāng)前臨床應(yīng)用實(shí)例較少4）無法表示定量第5頁DNA二代測(cè)序技術(shù)（Next generation squencing，NGS）應(yīng)用ABDEC，NGS用于罕見遺傳病分子病因?qū)W研究和診療遺傳病首次報(bào)道NGS應(yīng)用于急性髓細(xì)胞性白血病，今后NGS被廣泛應(yīng)用于腫瘤領(lǐng)域；年，NGS

4、技術(shù)應(yīng)用于血漿ctDNA 檢測(cè)；2011月，F(xiàn)DA同意首個(gè)腫瘤多癌腫多基因檢測(cè)平臺(tái)MSK-IMPACT；2012月，F(xiàn)DA式同意了首個(gè)NGS體外診 斷（IVD）上市腫瘤，NGS應(yīng)用于人類胚胎細(xì)胞非整倍體篩查臨床前研究胚胎植入前遺傳學(xué)診療與篩查，華大基因嘗試用NGS檢測(cè)胎兒游離DNA 年，基于NGS無創(chuàng)產(chǎn)前篩查開始進(jìn)入臨床無創(chuàng)產(chǎn)前DNA檢測(cè)DNA二代測(cè)序技術(shù)應(yīng)用第6頁非小細(xì)胞肺癌精準(zhǔn)治療概述PART 02第7頁在中國，肺癌發(fā)病率及死亡率均居第一位陳萬青，等.中國惡性腫瘤發(fā)病和死亡分析J.中國腫瘤，26（1）：1-7第8頁肺癌從單病種組織分型分子分型演變肺癌分為非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)和小細(xì)胞肺

5、癌(SCLC)兩大類，NSCLC約占 85%，主要分為肺腺癌、肺鱗癌和大細(xì)胞癌等。肺腺癌約占NSCLC 40%-50%，肺鱗癌約20%-30%，大細(xì)胞癌約1.5%NSCLC不再是一個(gè)疾病，而是一組疾病，需要分類治療，分子分型是關(guān)鍵Xu Y et al.,Ther Clin Risk Manag. May 24;12:807-16 Shames et al., J Pathol. Jan;232(2):121 33Li T, et al. J Clin Oncol. Mar 10;31(8):1039-49.第9頁Herbst RS et al.,Nature. Jan 24;553(7689)

6、:446-454歐美人群與中國人群NSCLC分子特征有所不一樣Herbst RS等1月發(fā)表于Nature綜述中指出歐美人群中：肺腺癌中常見激活突變位于PI3K/AKT/mTOR和RAS/RAF兩大信號(hào)通路，包含癌基因EGFR、KRAS、 ERBB2/3、MET、ALK、RET、ROS、BRAF等。失活突變包含抑癌基因 TP53、KEAP1和NF1等肺鱗癌中常見激活突變包含癌基因FGFR1-3、PIK3CA、KRAS、AKT、BRAF 等，較少見EGFR擴(kuò)增。失活突變包含抑癌基因TP53、CDKN2A第10頁歐美人群與中國人群NSCLC分子特征有所不一樣Oncotarget. Jul 5;7(2

7、7):41691-41702.A.1770例中國NSCLC 患者測(cè)序結(jié)果顯示常見激活突變包含癌基因EGFR、KRAS、ALK、 ERBB2(HER2)、MET、RET、BRAF、ROS1等。其中EGFR突變百分比為 50.3%，占據(jù)NSCLC突變半壁江山，遠(yuǎn)高于歐美人群27%B.904例非吸煙肺腺癌患者測(cè)序結(jié)果顯示常見激活突變包含癌基因EGFR、 ALK、KRAS、ERBB2(HER2)、MET、RET、BRAF、ROS1等。其中 EGFR突變百分比高達(dá)74.5%，表明EGFR基因在中國肺腺癌患者中至關(guān)主要第11頁肺癌進(jìn)入精準(zhǔn)治療時(shí)代：依據(jù)分子分型決定治療方案Deborah B et al.,

8、JAMA Oncol Apr 01;4(4).第12頁NGS二代測(cè)序ddPCR數(shù)字PCRARMS-PCRFISH熒光原位雜交IHC免疫組化01.02.03.04.05.臨床慣用分子檢測(cè)診療技術(shù)用標(biāo)識(shí)特異性抗體對(duì)組織切片或細(xì)胞標(biāo)本中一些化學(xué)成份分布和含量進(jìn)行組織和細(xì)胞原位定性、定位或定量研究擴(kuò)增妨礙突變系統(tǒng)(ARMS) ，利用PCR引物3端末位堿基必須與其模板DNA互補(bǔ)才能有效擴(kuò)增原理，設(shè)計(jì)等位基因特異性 PCR擴(kuò)增引物；只有在引物3堿基與模板配對(duì)時(shí)才能出現(xiàn)PCR擴(kuò)增帶，野生型不擴(kuò)增經(jīng)過熒光標(biāo)識(shí)DNA探針與細(xì)胞核內(nèi)DNA靶序列雜交，并在熒光顯微鏡下觀察分析其結(jié)果一個(gè)分子細(xì)胞遺傳學(xué)技術(shù)經(jīng)過熒光標(biāo)識(shí)

9、DNA探針與細(xì)胞核內(nèi)DNA靶序列雜交，并在熒光顯微鏡下觀察分析其結(jié)果一個(gè)分子細(xì)胞遺傳學(xué)技術(shù)在Sanger測(cè)序方法基礎(chǔ)上，用不一樣顏色熒光標(biāo)識(shí)四種不一樣dNTP，當(dāng)DNA聚合酶合成互補(bǔ)鏈時(shí)，每添加一個(gè)dNTP就會(huì)釋放出不一樣熒光，依據(jù)捕捉熒光信號(hào)并經(jīng)過特定計(jì)算機(jī)軟件處理，從而取得待測(cè)DNA序列信息第13頁檢測(cè)方法優(yōu)勢(shì)劣勢(shì)可檢測(cè)變異形式AMRS-PCR1、靈敏度3%-10%2、擴(kuò)增和檢測(cè)同時(shí)進(jìn)行，封閉體系，降低污染可能性1、只能檢測(cè)已知突變2、假如檢測(cè)突變點(diǎn)或者類型較多，出現(xiàn)特異產(chǎn)物概率也增加3、當(dāng)檢測(cè)位點(diǎn)較多時(shí)，對(duì)DNA樣本需求增加4、無法測(cè)融合、大片段插入/缺失點(diǎn)突變、小片段插入/缺失熒光原位

10、雜交FISH1、靈敏度高、特異度高2、空間定位準(zhǔn)確，可同時(shí)分析分裂期和間期多個(gè)細(xì)胞，并進(jìn)行定量1、通量低、成本高2、對(duì)操作和判讀技術(shù)要求高，不一樣讀片者判讀差異較大拷貝數(shù)改變、大片段插入/缺失、融合/重排。擴(kuò)增金標(biāo)準(zhǔn)免疫組化IHC1、可對(duì)組織和細(xì)胞中對(duì)應(yīng)抗原進(jìn)行定性、定位及定量研究2、經(jīng)濟(jì)快捷1、抗體選擇2、檢測(cè)者組織固定3、觀察者解釋方面差異僅檢測(cè)蛋白表示水平ddPCR1、單位點(diǎn)精準(zhǔn)度非常高2、能夠進(jìn)行動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)1、多位點(diǎn)血檢匹配度不高，2、已知位點(diǎn)測(cè)序點(diǎn)突變、小片段插入/缺失二代測(cè)序NGS1、大規(guī)模、高通量2、能檢測(cè)各種變異形式3、靈敏度1%-3%1、成本較高2、引入PCR過程會(huì)在一定程度上

11、增加測(cè)序錯(cuò)誤率，而且含有系統(tǒng)偏向性，同時(shí)讀長(zhǎng)也比較短3、對(duì)數(shù)據(jù)注釋和匯報(bào)解讀要求高點(diǎn)突變擴(kuò)增融合/重排插入/缺失臨床慣用分子檢測(cè)診療技術(shù)優(yōu)劣勢(shì)比較第14頁CAP、IASLC及AMP三大權(quán)威機(jī)構(gòu)推薦由單基因檢測(cè)發(fā)展為多基因檢測(cè)J Mol Diagn. Jul;15(4):415-53.J Mol Diagn. Mar;20(2):129-159.第15頁近年NCCN指南均提議進(jìn)行廣泛基因檢測(cè)第16頁檢測(cè)方法樣本起源變異類型點(diǎn)突變新位點(diǎn)融合擴(kuò)增突變負(fù)荷MSIEGFR/BRAFMET-14 exon skipALK/ROS1/RETMET/HER2TMB-IHC組織有限（BRAF）否是是否是血液否否

12、否否否否FISH組織否否是是否否血液否否否否否否PCR（ARMS/ddPCR）組織是否是（已知類型）是否否血液是否是（已知類型）是否否NGS組織是是是（已知+未知）是是是血液是是是（已知+未知）是是是傳統(tǒng)分子檢測(cè)方法存在不足，NGS平臺(tái)能夠全方面滿足NSCLC現(xiàn)有分子檢測(cè)診療需求第17頁NGS檢測(cè)技術(shù)貫通非小細(xì)胞肺癌精準(zhǔn)治療全程PART 03第18頁NGS檢測(cè)貫通非小細(xì)胞肺癌精準(zhǔn)治療全程N(yùn)GS在非小細(xì)胞肺癌中的應(yīng)用腫瘤組織（蠟塊、切片、新鮮組織）液體（血液、尿液、胸腹水）早期發(fā)現(xiàn)分子分型用藥指導(dǎo)療效預(yù)測(cè)復(fù)發(fā)監(jiān)控預(yù)后評(píng)估第19頁NGS+ctDNA有利于腫瘤早期發(fā)覺Jillian Phallen

13、et al.,Sci Transl Med . Aug 16;9(403)Jillian利用基于NGS平臺(tái)目標(biāo)錯(cuò)誤校正測(cè)序(TEC-Seq)方法，對(duì)ctDNA序列改變進(jìn)行超靈敏直接評(píng)定發(fā)覺：健康人群中未檢出腫瘤特異性基因突變；以健康人作為對(duì)照， 乳腺癌、肺癌、卵巢癌、結(jié)直腸癌患者都檢測(cè)到了腫瘤特異性突變；早期腫瘤就能夠檢出腫瘤特異性基因突變； 檢測(cè)腫瘤特異性基因突變與癌癥臨床分期呈正比Jillian認(rèn)為基于NGS平臺(tái)TEC-Seq分析方法為早期腫瘤無創(chuàng)檢測(cè)提供了廣泛適用方法，可能對(duì)癌癥患者篩查和管理有用，提醒ctDNA用于常見癌種早期診療可能性。第20頁CSCO指南認(rèn)可NGS在非小細(xì)胞肺癌分子

14、分型作用中國臨床腫瘤學(xué)會(huì)指南工作委員會(huì)，中國臨床腫瘤學(xué)會(huì)原發(fā)性肺癌診療指南第21頁NGS有利于分析非小細(xì)胞肺癌分子分型演講，指導(dǎo)后續(xù)治療英國TRACERx肺癌研究計(jì)劃首個(gè)結(jié)果發(fā)表于新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志，其中提到：NSCLC腺癌 “進(jìn)化”早期： 諸如EGFR、 MET、BRAF 和TP53之類基因突變/ 擴(kuò)增往往發(fā)生在克隆水平；這些基因往往與NSCLC 形成相關(guān)，屬于驅(qū)動(dòng)基因NSCLC“進(jìn)化”晚期： 75%腫瘤出現(xiàn)了亞克隆水平各種變異，而且這些變異還位于腫瘤不一樣區(qū)域；是造成腫瘤內(nèi)部異質(zhì)性原因M. Jamal-Hanjani et al.,N Engl J Med . Jun 1;376(22):2

15、109-2121早期晚期第22頁NGS指導(dǎo)非小細(xì)胞肺癌個(gè)體化用藥及療效預(yù)測(cè)Tsao et al., J Thorac Oncology . Vol. 11 No. 5: 613 - 638Deborah B et al.,JAMA Oncol Apr 01;4(4).晚期非小細(xì)胞肺癌藥品治療靶向、免疫、化療三分天下，此時(shí)基于NGS平臺(tái)多基因檢測(cè)優(yōu)勢(shì)顯著第23頁NGS指導(dǎo)非小細(xì)胞肺癌個(gè)體化用藥及療效預(yù)測(cè)Rizvi N A, Hellmann M D, et al. Science, , 348(6230): 124 - 128Rizvi對(duì)非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)進(jìn)行全外顯子測(cè)序，發(fā)覺腫瘤中更高

16、非同義突變負(fù)荷(H-TMB)人群有更加好無進(jìn)展生存期(PFD) ， 而且對(duì)PD-1 單抗 (pembrolizumab)有持久反應(yīng)(DCB)第24頁NGS能夠幫助發(fā)覺非小細(xì)胞肺癌耐藥機(jī)制及判斷預(yù)后Ke EE等納入224名EGFR突變并取得EGFR-TKI耐藥晚期NSCLC患者，分析T790M突變、MET擴(kuò)增、組織學(xué)轉(zhuǎn)化、KRAS、PIK3CA突變、ALK融合等耐藥機(jī)制，其發(fā)覺：19-del 缺失組 T790M 突變（50.4%）顯著比L858R突變組（36.5%）高； T790M 突變患者中觀察到顯著OS益處，中位OS 36.0個(gè)月；在調(diào)整T790M基因型多變量分析中，EGFR突變亞型不再被認(rèn)

17、為是顯著；結(jié)果報(bào)道：EGFR T790M 高百分比突變對(duì)于 Exon19 缺失比 L858R突變患者有更加好存活率，預(yù)后更加好。Ke EE,et al.,J Thorac Oncol. Sep;12(9):1368-1375.第25頁NGS+ctDNA早期提醒腫瘤復(fù)發(fā)Chaudhuri AA，et al.,Cancer Discov. Dec;7(12):1394-1403.Chaudhuri AA等采取深度測(cè)序(CAPP-seq)循環(huán)腫瘤DNA (ctDNA)分析方法，對(duì)40例I-III期肺癌患者和54名健康成人255份樣本進(jìn)行了癌癥個(gè)性化監(jiān)測(cè)，其發(fā)覺：94%患者在治療后血液樣本中檢測(cè)到ct

18、DNA定時(shí)接收ctDNA監(jiān)測(cè)患者，在接收根治性治療后，第一次檢測(cè)到ctDNA時(shí)間，比CT明確提醒腫瘤復(fù)發(fā)， 平均提前了5.2個(gè)月ctDNA中對(duì)應(yīng)基因檢測(cè)，還能夠用來區(qū)分到底是疾病復(fù)發(fā)還是正常術(shù)后改變第26頁NGS正在以更高標(biāo)準(zhǔn)，快速進(jìn)入臨床服務(wù)患者FDA自年底至今已同意6款 NGS技術(shù)產(chǎn)品，以期降低NGS技術(shù) 產(chǎn)品潛在檢測(cè)錯(cuò)誤和解讀錯(cuò)誤風(fēng)險(xiǎn)，確保該類產(chǎn)品檢測(cè)安全性、 有效性.12.19 FoundationFocus CDx BRCA BRCA 1/2 晚期卵巢癌 Rucaparib.6.22 Oncomine Dx EGFR、ROS1、BRAF 非小細(xì)胞肺癌 吉非替尼、克唑替尼、 達(dá)拉菲尼、曲美替尼.6.29 Praxis Extended RAS Panel KRAS (exons 2, 3, 4) NRAS (exons 2, 3, 4) 轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌 帕尼單抗.11.15 MSK-IMPACTTM FFPE樣本46