乙肝表面抗原測定

1、乙肝外表抗原測定組員:王安娜、李婷玉、羅夢嬌、翁博文第一頁，共三十五頁。綜述乙型肝炎病毒：機體感染HBV后血清中首先出現(xiàn)的標志物，可作為乙肝的早期診斷和普查HBsAg無傳染源性而有免疫原性，可刺激機體產(chǎn)生抗-HBs通過血液檢測是唯一檢測是否感染乙肝病毒的唯一途徑乙肝病毒是通過血液傳播，主要通過母嬰，血液和性傳播。日常生活和工作接觸不會傳播乙肝病毒。如果HBsAg、HBeAg和抗HBc三項陽性即為大三陽，其血液就有高度傳染性第二頁，共三十五頁。凝集反響第三頁，共三十五頁。2.間接凝集反響：反向間接凝集 根本原理： 將抗體致敏的紅細胞與樣本中相應(yīng)抗原作血凝試驗，觀察紅細胞凝集現(xiàn)象，用以判斷樣本中相

2、應(yīng)抗原的有無及其效價。 凝集反響第四頁，共三十五頁。3.協(xié)同凝集反響根本原理：以金黃色葡萄球菌為載體；將特特異性抗體先結(jié)合至金黃色葡萄球菌外表；其Fab段游離與菌體外表，遇到相應(yīng)抗原時與之結(jié)合；即可導致金黃色葡萄球菌凝集成塊，稱為協(xié)同凝集試驗。 凝集反響第五頁，共三十五頁。沉淀反響第六頁，共三十五頁。沉淀反響 可溶性抗原如細菌浸出液、細胞裂解上清液及血清蛋白等與相應(yīng)抗體特異性結(jié)合，在電解質(zhì)存在的條件下，出現(xiàn)肉眼可見的沉淀物，稱為沉淀反響。參與沉淀反響的抗原稱為：沉淀原參與沉淀反響的抗體稱為：沉淀素 沉淀反響第七頁，共三十五頁。凝膠沉淀試驗單向瓊脂擴散試驗： 抗原或抗體這兩種成分中只有一種擴散，

3、將能看出抗體與瓊脂混合，將抗原置于凝膠孔中，抗原那么呈輻射狀擴散，在孔的周圍與抗體結(jié)合，在比例適宜的地方形成肉眼可見的沉淀環(huán)。當抗體的濃度一定時，抗原的濃度與形成沉淀環(huán)的直徑成正比。雙向瓊脂擴散試驗： 雙向免疫擴散是指抗原和抗體在同一凝膠內(nèi)部擴散，彼此相遇后形成特 異性的沉淀線。該反響是將抗原和抗體參加同一凝膠中兩個相隔一定間距的小孔內(nèi)，使兩者進行相互擴散。當抗原和抗體濃度之比相適宜時，彼此相遇形成一白色弧型沉淀線。 沉淀反響第八頁，共三十五頁。免疫電泳技術(shù)對流免疫電泳：雙向瓊脂擴散試驗+電泳火箭免疫電泳：單向瓊脂擴散試驗+電泳免疫電泳：雙向瓊脂擴散試驗+區(qū)帶電泳 沉淀反響第九頁，共三十五頁。

4、酶標記免疫測定技術(shù)第十頁，共三十五頁。酶聯(lián)免疫吸附劑測定法簡稱酶聯(lián)免疫法，或者ELISA法。是固相酶免儀測定中最具代表性的一種既可檢測抗原又可檢測抗體3種必要的試劑：固相的抗原或抗體酶標記的抗原或抗體酶作用的底物第十一頁，共三十五頁。雙抗體夾心法酶聯(lián)免疫吸附劑測定法根本原理： 將能看出抗體包被到固相載體上，使待測標本中的相應(yīng)抗原與抗體結(jié)合，然后再與酶標抗體結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標抗體復(fù)合物，洗去多余未結(jié)和成分，加底物后的顯色，根據(jù)顯色反響的強度確定待檢抗原的含量。第十二頁，共三十五頁。2.雙位點一步法 根本原理： 在雙抗體夾心法根底上使用針對抗原分子上兩個不同抗原決定簇的單克隆抗體，分別作為

5、固相抗體和酶標抗體。測定時將待檢標本和酶標抗體同時參加進行反響，形成抗體-抗原-酶標抗體復(fù)合物，洗滌后，即可參加底物，顯色后進行抗原的定性或定量測定。酶聯(lián)免疫吸附劑測定法第十三頁，共三十五頁。3.競爭法根本原理： 酶標抗原和待檢抗原對固相抗體具有相同的結(jié)合力，在同一反響體系中兩者競爭結(jié)合固相抗體。 假設(shè)將固相抗體和酶標抗原固定限量，且前者的結(jié)合位點少于酶標和非酶標抗原的分子數(shù)量和，免疫反響后，結(jié)合與固相酶標抗原量與標本中待檢抗原含量成反比。酶聯(lián)免疫吸附劑測定法第十四頁，共三十五頁。熒光免疫分析技術(shù)第十五頁，共三十五頁。熒光免疫顯微技術(shù)用熒光素標記抗體；與特異性抗原作用；除去游離的熒光抗體，借助

6、顯微鏡觀察；檢測固定組織上的相遇抗原或者血清中的相應(yīng)抗體。第十六頁，共三十五頁。1.直接法根本原理： 將特異性熒光抗體直接滴加于待檢抗原標本上，直接與相應(yīng)抗原反響，檢測未知抗原。熒光免疫顯微技術(shù)第十七頁，共三十五頁。2.間接法根本原理：用熒光素標記抗球蛋白抗體，鑒定未知抗原或未知抗體；先是未標記抗體一抗與標本中的抗原反響；再用已標記的二抗與一抗反響；通過觀察熒光現(xiàn)象，從而到達檢測未知抗原或抗體的目的。熒光免疫顯微技術(shù)第十八頁，共三十五頁。3.補體結(jié)合法根本原理：利用補體結(jié)合反響的原理，用熒光素標記抗補體的抗體，測定未知抗原或抗體先是標本中的抗原與抗體反響形成抗原-抗體復(fù)合物后，參加補體與之結(jié)合

7、。再加上抗補體的熒光素標記抗體，通過熒光現(xiàn)象檢測抗原或抗體熒光免疫顯微技術(shù)第十九頁，共三十五頁。放射免疫技術(shù)第二十頁，共三十五頁。放射免疫根本原理： 標記抗原Ag*和非標記抗原Ag對特異性抗體Ab的競爭結(jié)合反響第二十一頁，共三十五頁。免疫放射根本原理：以過量的放射性核素標記抗體與待測抗原進行的非競爭性結(jié)合反響；待充分反響后，除去游離的標記抗體；Ag-Ab*復(fù)合物的放射性強度與待測抗原呈正比關(guān)系。第二十二頁，共三十五頁。免疫放射技術(shù)類型1、單位點IRMA 過量標記抗體與待測抗原反響，形成抗原-標記抗體復(fù)合體 反響平衡后別離剩余的標記抗體 測定上清液的放射量放射強度與待測抗原的量呈正比關(guān)系2、雙位

8、點IRMA雙抗原夾心法 固相抗體與待測抗原結(jié)合， 形成固相抗體-待測抗原-標記抗體復(fù)合物 別離游離的標記抗體，測定固相上的放射性強度第二十三頁，共三十五頁。金標記免疫技術(shù)第二十四頁，共三十五頁。斑點免疫金層析試驗免疫金測試區(qū)：特異抗體參照區(qū)：抗免疫金抗體第二十五頁，共三十五頁。發(fā)光免疫技術(shù)第二十六頁，共三十五頁?；瘜W發(fā)光酶免疫測定根本原理用參與催化某一化學發(fā)光反響的酶來標記抗原或抗體與固相化的抗體或抗原試劑反響形成固相包被抗體-待測抗原-酶標記抗體復(fù)合物洗滌后參加發(fā)光底物，酶催化和分解底物發(fā)光傳送至計算機數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)計算出測定物的濃度 發(fā)光免疫技術(shù)第二十七頁，共三十五頁。化學發(fā)光酶免疫測定 發(fā)

9、光免疫技術(shù)第二十八頁，共三十五頁?；瘜W發(fā)光免疫測定根本原理用化學發(fā)光劑直接標記抗原或抗體化學發(fā)光劑標記物；與待測標本中相應(yīng)抗體或抗原、磁顆粒性的抗原或抗體反響；通過磁場把結(jié)合狀態(tài)沉淀局部和游離狀態(tài)的化學發(fā)光劑 標記物別離開來；參加發(fā)光促進劑進行發(fā)光反響；通過對發(fā)光強度的檢測進行定量或定性檢測。 發(fā)光免疫技術(shù)第二十九頁，共三十五頁。電化學發(fā)光免疫測定 是電化學發(fā)光和免疫測定相結(jié)合的產(chǎn)物。 發(fā)光免疫技術(shù)第三十頁，共三十五頁。新 技 術(shù)第三十一頁，共三十五頁。實時熒光定量PCRFQ-PCR FQ-PCR是一種實時定量檢測技術(shù),融匯了PCR的靈敏性、DNA雜交的特異性和光譜技術(shù)的精確定量等優(yōu)點。根本原

10、理是利用TaqDNA聚合酶的5-3外切核酸酶活性,在擴增的同時降解雜交于擴增區(qū)域內(nèi)的探針,使連接于雜交探針的熒光淬滅基團和熒光發(fā)射基團別離而產(chǎn)生熒光,因此熒光強度的變化能反映擴增產(chǎn)物量的變化。 第三十二頁，共三十五頁?；蛐酒?基因芯片是近幾年生命科學研究領(lǐng)域的一項新檢測技術(shù)，它是指固定基質(zhì)上集成各種可以作為受體的生物信息，利用受體與連接物間的反響來進行生物學的檢測。主要包括蛋白芯片和基因芯片。蛋白芯片是將位置和結(jié)構(gòu)能看出的大量蛋白、多肽分子、酶、抗原、抗體按預(yù)先設(shè)計好的方式固定于滴定板、濾膜和載玻片等各種載體上組成密集的分子排列，當熒光、免疫金等標記的靶分子與芯片上的探針分子結(jié)合后，通過一些定量檢測方法對標記信號的強度進行檢測，從而判斷樣品中的靶分子的數(shù)量，到達一次實驗同時檢測多種生物樣品的目的。第三十三頁，共三十五頁。微粒子酶免疫分析(MEIA) MEIA檢測HBsAg是目前世界上檢測乙型肝炎病毒標志物的金標準，采用順磁性微粒作為固相載體，用穩(wěn)定的4-甲基磷酸傘型酮(MUP)測出熒光發(fā)光的強度來檢測被測物的濃度，對HBsAg檢測的靈敏度達0.170.2ng/ml。它不但靈敏度高且抗干擾能力強，重復(fù)性好，并可單份檢測，可檢出人群中低濃度和自然感染獲得的乙型肝炎病毒核心抗體. 因此認為MEI法對血清HBV標志物的檢出陽性率高于ELISA法,MEIA比EL