發(fā)酵菌種的制備

1、發(fā)酵菌種的制備第1頁，共70頁，2022年，5月20日，4點52分，星期二發(fā)酵工程第一章 發(fā)酵工程總論第二章 發(fā)酵設(shè)備第三章 發(fā)酵工業(yè)原料及其處理第四章 發(fā)酵工業(yè)滅菌第五章 發(fā)酵菌種的制備第六章 發(fā)酵工業(yè)放大第七章 微生物發(fā)酵機制第八章 發(fā)酵動力學(xué)第九章 發(fā)酵過程工藝控制第十章 發(fā)酵染菌及防治第十一章 發(fā)酵工業(yè)廢物、廢水處理和資源化技術(shù)第十二章 展望 發(fā)酵工程第2頁，共70頁，2022年，5月20日，4點52分，星期二1 發(fā)酵工業(yè)微生物菌種的選育2 工業(yè)微生物種子的擴大培養(yǎng)3 種子培養(yǎng)基及其制備第五章 發(fā)酵菌種的制備2/jing/C76/zcr-1.htm 發(fā)酵工程第3頁，共70頁，2022年

2、，5月20日，4點52分，星期二1.1 工業(yè)微生物的特點1.2 發(fā)酵工業(yè)對菌種的要求1.3 工業(yè)生產(chǎn)常用的微生物菌種1.4 工業(yè)微生物菌種的分離1.5 發(fā)酵高產(chǎn)菌種的選育1.6 菌種的退化與保藏1 發(fā)酵工業(yè)微生物菌種的選育第五章 發(fā)酵菌種的制備第4頁，共70頁，2022年，5月20日，4點52分，星期二1.1 工業(yè)微生物的特點1 發(fā)酵工業(yè)微生物菌種的選育 一個現(xiàn)代化的發(fā)酵工業(yè)必須具有優(yōu)良的菌種、合適的工藝和先進的設(shè)備、嚴格的檢測與控制，其中菌種是主體,其他則是為了充分發(fā)揮菌種的優(yōu)良性能而考慮和設(shè)計的。 能用于發(fā)酵生產(chǎn)的微生物即為工業(yè)微生物，它們具有個體小、種類多、繁殖快、分布廣、代謝能力強、易

3、變異改造等特點。第5頁，共70頁，2022年，5月20日，4點52分，星期二1.2 發(fā)酵工業(yè)對菌種的要求1) 能在廉價原料制成的培養(yǎng)基上迅速生長，并生成所需要的代謝產(chǎn)物，且產(chǎn)量高；2）培養(yǎng)條件易于控制；3）生長速度快，發(fā)酵周期短；4）滿足代謝控制的要求；5）抗噬菌體和雜菌的能力強；6）遺傳性狀穩(wěn)定，菌種不易變異退化；7）在發(fā)酵過程中產(chǎn)生的氣泡要少，這對提高裝料系數(shù)、提高單罐產(chǎn)量、降低成本有重要意義；8）對需要添加的前體物質(zhì)有耐受能力，并且不能將這些前體作為一般碳源利用；9）不是病原菌，同時在系統(tǒng)發(fā)育上與病原菌無關(guān)，不產(chǎn)生任何有害的生物活性物質(zhì)和毒素，以保證安全。第6頁，共70頁，2022年，5

4、月20日，4點52分，星期二 地球上的微生物資源非常豐富，目前已發(fā)現(xiàn)的僅占其總數(shù)的1%5%，而在工業(yè)生產(chǎn)中被利用的僅有數(shù)百種，分屬于細菌、酵母菌、霉菌、放線菌、擔(dān)子菌、藻類。1.3 工業(yè)生產(chǎn)常用的微生物菌種 發(fā)酵工程第7頁，共70頁，2022年，5月20日，4點52分，星期二放線菌（鏈霉素四環(huán)素；紅霉素等） 真菌（青霉素、頭孢等）一些產(chǎn)芽孢的細菌植物或動物來源一、抗生素生產(chǎn)有關(guān)的微生物抗生素是次級代謝產(chǎn)物，需要生物體進行復(fù)雜的代謝，目前發(fā)現(xiàn)的生物來源如下：已工業(yè)化產(chǎn)品生產(chǎn)菌的介紹1.3 工業(yè)生產(chǎn)常用的微生物菌種第8頁，共70頁，2022年，5月20日，4點52分，星期二二、氨基酸生產(chǎn)有關(guān)的微生

5、物代謝控制發(fā)酵：用人工誘變的方法，有意識地改變微生物的代謝途徑，最大限度地積累產(chǎn)物，這種發(fā)酵形象地稱為代謝控制發(fā)酵，最早在氨基酸發(fā)酵中得到成功應(yīng)用。20世紀50-60年代以氨基酸發(fā)酵為代表的代謝控制發(fā)酵，是發(fā)酵工業(yè)發(fā)展歷史上的一個轉(zhuǎn)折點：1.3 工業(yè)生產(chǎn)常用的微生物菌種已工業(yè)化產(chǎn)品生產(chǎn)菌的介紹第9頁，共70頁，2022年，5月20日，4點52分，星期二HD:高絲氨酸脫氫酶黃色短桿菌中賴氨酸、蘇氨酸、蛋氨酸和異亮氨酸的合成調(diào)節(jié)機制 HT:高絲氨酸轉(zhuǎn)乙酰酶AK:天冬氨酸激酶1.3 工業(yè)生產(chǎn)常用的微生物菌種二、氨基酸生產(chǎn)有關(guān)的微生物第10頁，共70頁，2022年，5月20日，4點52分，星期二氨基酸

6、生產(chǎn)菌的要求：代謝途徑比較清楚，簡單谷氨酸發(fā)酵的菌種：其他氨基酸生產(chǎn)菌：棒桿菌屬，短桿菌屬、節(jié)桿菌屬或小桿菌屬的棒型細菌常規(guī)菌種一般也是以谷氨酸生產(chǎn)菌選育而成；工程菌，大腸桿菌，枯草芽孢桿菌1.3 工業(yè)生產(chǎn)常用的微生物菌種二、氨基酸生產(chǎn)有關(guān)的微生物第11頁，共70頁，2022年，5月20日，4點52分，星期二三、食品酶制劑生產(chǎn)有關(guān)的微生物 開發(fā)一個新酶，都要經(jīng)過一系列研究的毒理試驗。關(guān)于食品用酶，美國需要得到FDA的批準。目前已同意使用的僅僅少數(shù)微生物能用于生產(chǎn)食品用酶。淀粉酶：黑曲霉、米曲霉、米根酶、枯草牙孢桿菌和地衣牙孢桿菌1.3 工業(yè)生產(chǎn)常用的微生物菌種已工業(yè)化產(chǎn)品生產(chǎn)菌的介紹第12頁，

7、共70頁，2022年，5月20日，4點52分，星期二三、常用的基因表達系統(tǒng)(一)原核生物：大腸桿菌(1977年Boyer)、枯草牙胞桿菌 沙門氏菌 生長迅速、蛋白產(chǎn)量高; 表達蛋白的純化、分離及分析快速； 外源基因的導(dǎo)入相對容易； 已建立了整套表達理論及技術(shù)。已工業(yè)化產(chǎn)品生產(chǎn)菌的介紹1.3 工業(yè)生產(chǎn)常用的微生物菌種第13頁，共70頁，2022年，5月20日，4點52分，星期二(二) 真核細胞表達系統(tǒng) 酵母(既是微生物又是真核細胞) 生長迅速，營養(yǎng)要求不高，易培養(yǎng)； 安全性好； 比哺乳動物細胞操作簡單； 具有一定的修飾蛋白的能力。1.3 工業(yè)生產(chǎn)常用的微生物菌種已工業(yè)化產(chǎn)品生產(chǎn)菌的介紹第14頁，

8、共70頁，2022年，5月20日，4點52分，星期二 中國倉鼠卵巢細胞（CHO細胞）表達系統(tǒng) 具有準確的轉(zhuǎn)錄后修飾功能； 具有產(chǎn)物胞外分泌功能，便于下游產(chǎn)物分離純化； 具有重組基因的高效擴增和表達能力； 具有貼壁生長特性，也可進行懸浮生長； CHO很少分泌自身的內(nèi)源蛋白。1.3 工業(yè)生產(chǎn)常用的微生物菌種已工業(yè)化產(chǎn)品生產(chǎn)菌的介紹第15頁，共70頁，2022年，5月20日，4點52分，星期二微生物（包括動、植物細胞）幾乎可以生產(chǎn)我們所需的一切產(chǎn)品，但是涉及到工業(yè)化生產(chǎn)對于某一種特定的產(chǎn)品，只有特定的微生物才具有大量表達的潛力。問題：生產(chǎn)抗生素的微生物能不能用于生產(chǎn)氨基酸？禮來(Eli lilly)

9、,花了10年的時間從40萬株微生物中，發(fā)現(xiàn)了三種有潛力的新抗生素。例：1.3 工業(yè)生產(chǎn)常用的微生物菌種已工業(yè)化產(chǎn)品生產(chǎn)菌的介紹第16頁，共70頁，2022年，5月20日，4點52分，星期二一、菌種分離的一般過程樣品采集預(yù)處理 增殖培養(yǎng) 純培養(yǎng) 菌種的鑒定問題：如何使樣品中所含微生物的可能性大 如何在后續(xù)的操作中使這種可能性實現(xiàn)目的：高效地獲取一株高產(chǎn)目的產(chǎn)物的微生物1.4 工業(yè)微生物菌種的分離 生產(chǎn)性能測定復(fù)合酶系復(fù)合菌系第17頁，共70頁，2022年，5月20日，4點52分，星期二二、采樣時要注意的問題 氣候、水分、空氣 來源要廣 結(jié)合產(chǎn)品的特點 標簽：地點、時間、氣候等1.4 工業(yè)微生物菌

10、種的分離第18頁，共70頁，2022年，5月20日，4點52分，星期二富集的三種方案： 定向培養(yǎng):采用特定的有利于目的微生物富集的 條件，進行培養(yǎng)。三、目的微生物富集的一些基本方法富集的目的：讓目的微生物在種群中占優(yōu)勢，使篩選變得可能。 當(dāng)不可能采用定向培養(yǎng)時，則可設(shè)計在一個分 類學(xué)中考慮， 不能提供任何有助于篩選產(chǎn)生菌的信息，這 時只能通過隨機分離的辦法1.4 工業(yè)微生物菌種的分離第19頁，共70頁，2022年，5月20日，4點52分，星期二定向培養(yǎng)的方法物理方法：加熱、膜過濾等，但主要是通過培養(yǎng)的方法1.4 工業(yè)微生物菌種的分離三、目的微生物富集的一些基本方法2/jing/C76/zcr-

11、1.htm第20頁，共70頁，2022年，5月20日，4點52分，星期二定向培養(yǎng)的富集方法1、底物2、pH條件3、培養(yǎng)時間4、培養(yǎng)溫度等一切能提高目的微生物相對生長速度的手段，培養(yǎng)（固體、液體；分批、連續(xù)）后使目的微生物在種群中占優(yōu)勢。三、目的微生物富集的一些基本方法第21頁，共70頁，2022年，5月20日，4點52分，星期二四、菌落的選出 從產(chǎn)物角度出發(fā)在培養(yǎng)時以產(chǎn)物的形成有目的的設(shè)計培養(yǎng)基利用簡單、快速的鑒定方法，如抗生素 從形態(tài)的角度 菌落的外觀形態(tài)，是微生物的一個重要表征。如多糖產(chǎn)生菌在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基上生長，從具有粘液性的菌落外觀上就可以初步識別。1.4 工業(yè)微生物菌種的分離第22頁，

12、共70頁，2022年，5月20日，4點52分，星期二實例：堿性纖維素酶產(chǎn)生菌的篩選采樣（造紙廠）80 30 min處理文獻:產(chǎn)生菌為中性牙孢桿菌，嗜堿芽孢桿菌、放線菌及霉菌0.0075%曲利本藍1%CMC（羧甲基纖維素），pH10.5培養(yǎng)34 d，選擇有凹陷圈的菌落從285個土樣中獲得62株26株為組成型36株為誘導(dǎo)型1.4 工業(yè)微生物菌種的分離第23頁，共70頁，2022年，5月20日，4點52分，星期二實例：醛肟水解酶的篩選 -Journal of biotechnology 94(2002), 65-72培養(yǎng)基中含0.05% of Z-PAOx 每隔23 d移去一半培養(yǎng)物，補充新鮮培養(yǎng)基

13、不斷分析樣品，2-3個月后Z-PAOx降低后，稀釋分離菌落1.4 工業(yè)微生物菌種的分離第24頁，共70頁，2022年，5月20日，4點52分，星期二五、目的微生物富集方法的研究進展 分子生物學(xué)的實驗手段，在微生物鑒別及特定目標產(chǎn)物 的篩選方面發(fā)揮了著越來越重要的作用。如:16SRNA同 源性分析，基因序列分析及DNA/DNA雜交技術(shù)等 目前土壤中能夠培養(yǎng)的微生物不到總數(shù)的1%，微生物的 多樣性及資源的開發(fā)仍然是今后若干年的研究重點。 陳文新（科學(xué)院院士） ， 2002 In contrast to this traditional approach, modern molecular biol

14、ogy techniques allow for DNA library expression screening, which also enables access to enzymes of nonculturable organisms. By this strategy, for instance, the company Diversa (San Diego, CA, USA) identised 120 unique esterases/lipases from only 16% of the total DNA obtained from an alkaline soil sa

15、mple.FEMS Microbiology Reviews 26 (2002) 73811.4 工業(yè)微生物菌種的分離第25頁，共70頁，2022年，5月20日，4點52分，星期二目的 提高生產(chǎn)能力 提高產(chǎn)品質(zhì)量 開發(fā)新產(chǎn)品 解決生產(chǎn)實際問題 防止菌種退化1.5 發(fā)酵高產(chǎn)菌種的選育第26頁，共70頁，2022年，5月20日，4點52分，星期二方法基因突變：自然選育、誘變育種基因重組：雜交、原生質(zhì)體融合、基因工程基因的直接進化：點突變、易位PCR、同序法DNA Shuffling等1.5 發(fā)酵高產(chǎn)菌種的選育第27頁，共70頁，2022年，5月20日，4點52分，星期二自然狀態(tài)下，堿基對發(fā)生自然突

16、變的機率為10-810-9。自然突變有兩種情況：一種是我們生產(chǎn)上所不希望看到的，表現(xiàn)為菌株的衰退和生產(chǎn)質(zhì)量的下降，這種突變成為負突變。另一種是我們生產(chǎn)上希望看到的，對生產(chǎn)有利，這種突變成為正突變。一、自然選育1.5 發(fā)酵高產(chǎn)菌種的選育第28頁，共70頁，2022年，5月20日，4點52分，星期二自然選育在工業(yè)生產(chǎn)上的意義自然選育雖然突變率很低，但卻是工廠保證穩(wěn)產(chǎn)高產(chǎn)的重要措施?；貜?fù)突變：高產(chǎn)菌株在傳代的過程中，由于自然突變導(dǎo)致高產(chǎn)性狀的丟失，生產(chǎn)性能下降，這種情況我們稱為回復(fù)突變問題：高產(chǎn)菌株是正突變高，還是負突變高？1.5 發(fā)酵高產(chǎn)菌種的選育第29頁，共70頁，2022年，5月20日，4點5

17、2分，星期二自然選育操作步驟： 一般習(xí)慣上將自然選育稱為菌種的分離純化。單細胞(孢子)懸液的制備平板分離挑選單菌落發(fā)酵試驗1.5 發(fā)酵高產(chǎn)菌種的選育注意形態(tài)的觀察選擇性培養(yǎng)法隨機分離法平板劃線法平板稀釋法第30頁，共70頁，2022年，5月20日，4點52分，星期二二、誘變育種用各種物理、化學(xué)的因素人工誘發(fā)基因突變進行的篩選，稱為誘變育種。誘變劑：能夠提高生物體突變頻率的物質(zhì)稱為誘變劑（P103）誘變劑物理：紫外，快中子，射線，激光化學(xué)：硫酸二乙酯（DES），亞硝基胍（NTG）生物：噬菌體，轉(zhuǎn)座子1.5 發(fā)酵高產(chǎn)菌種的選育第31頁，共70頁，2022年，5月20日，4點52分，星期二（二）、誘

18、變劑處理過程中幾個有關(guān)的問題 化學(xué)誘變劑使用過程的安全性誘變劑量的選擇誘變劑的選擇出發(fā)菌株的選擇（一）、誘變育種的原理 誘變育種的理論基礎(chǔ)是基因突變，突變主要包括染色體畸變和基因突變兩大類。壓硝酸：0.07MNa2HPO4亞硝基胍：1MNaOH二、誘變育種第32頁，共70頁，2022年，5月20日，4點52分，星期二（三）、誘變育種的一般步驟 （P103）二、誘變育種誘變育種一般包括誘變和篩選兩個部分。誘變部分成功的關(guān)鍵包括出發(fā)菌株的選擇、誘變劑種類和劑量的選擇，以及合理的使用方法。篩選部分包括初篩和復(fù)篩來測定菌種的生產(chǎn)能力。誘變育種是誘變和篩選過程的不斷重復(fù)，直到達到高產(chǎn)菌株。第33頁，共7

19、0頁，2022年，5月20日，4點52分，星期二（三）、誘變育種的一般步驟二、誘變育種出發(fā)菌株的選擇制備菌懸液誘變處理突變菌株的篩選營養(yǎng)缺陷型突變菌株的篩選抗反饋阻礙和抗反饋抑制突變菌株的篩選組成型突變株的篩選抗性突變株的篩選自然界直接分離到的野生型菌株經(jīng)歷過生產(chǎn)條件考驗的菌株已經(jīng)歷多次育種處理的菌株隨機篩選形態(tài)理化性質(zhì)第34頁，共70頁，2022年，5月20日，4點52分，星期二HD:高絲氨酸脫氫酶黃色短桿菌中賴氨酸的合成調(diào)節(jié)機制 HT:高絲氨酸轉(zhuǎn)乙酰酶AK:天冬氨酸激酶結(jié)構(gòu)類似物抗性：Lys的類似物AEC, Thr的類似物AHV營養(yǎng)缺陷型：如Thr缺陷型第35頁，共70頁，2022年，5月

20、20日，4點52分，星期二黃色短桿菌F9-50的誘變譜系 Bervibacterium flavum As 1.495 (leu-) lys.HCl 2.1 g/lF6-16 (leu -, Thr -) 20.8 g/lF9-50 (leu -, Thr -, AEC r) 33.5 g/l第36頁，共70頁，2022年，5月20日，4點52分，星期二三、基因的直接進化(directed evolution) 突變 基因突變庫的建立 篩選 基因突變庫的篩選 基因復(fù)制與遺傳步驟： 在分子水平上，對目標基因直接處理，然后通過高通量的篩選方法，提高目標蛋白的性能。1.5 發(fā)酵高產(chǎn)菌種的選育第37頁

21、，共70頁，2022年，5月20日，4點52分，星期二主要應(yīng)用：酶活性能的提高: 生理環(huán)境工業(yè)催化環(huán)境 pH 溫度 有機溶劑 底物專一性第38頁，共70頁，2022年，5月20日，4點52分，星期二脂酶拆分2-甲基癸酸硝基苯酯例：PLAPLA光學(xué)拆分選擇性(%)2 31 57 75 81 905次錯位PCR 2次定點突變Reetz (1997) Liebeton(2000) 第39頁，共70頁，2022年，5月20日，4點52分，星期二定點突變第40頁，共70頁，2022年，5月20日，4點52分，星期二錯位PCR第41頁，共70頁，2022年，5月20日，4點52分，星期二DNA改組(DNA

22、 Shuffling): 指DNA分子的體外重排，是基因在分子水平上進行有性重組(Sexual Recombination)。DNA改組技術(shù)(1994)的發(fā)明人Stemmer博士，他以5項美國專利為技術(shù)支撐點，于1997年創(chuàng)立了專門從事DNA改組研究的公司Maxygen。公司剛剛建立，世界上幾家最大的公司紛紛與之洽談并建立了合作關(guān)系。這些公司包括最大的農(nóng)業(yè)公司 duPont公司、生產(chǎn)抗生素的世界巨頭 DSM公司和工業(yè)酶研究生產(chǎn)之最的Novo nordisk公司。此外，迄今為止，Maxygen公司還得到了來自美國國防高級研究計劃局(DARPA)和國家科學(xué)技術(shù)協(xié)會(NIST)的5項資助，共計210

23、0萬美元。從另一角度反映了DNA改組的重要性及美國政府及商家對DNA改組技術(shù)的重視程度。 第42頁，共70頁，2022年，5月20日，4點52分，星期二圖1有性PCR法改組DNA的基本程序DNA shuffling第43頁，共70頁，2022年，5月20日，4點52分，星期二 圖2交錯延伸法改組DNA的基本程序 DNA shuffling第44頁，共70頁，2022年，5月20日，4點52分，星期二X XXX X XX X XX X XXX X XX XX XXX XX X X XX X XXX XX XXX XX X X XX X XXX X XX X XX XXX XXX X X X X

24、X XX X Fragment Reassemble Select bestwith DNAseI fragments recombinantsRepeat for multiple cyclesDNA shuffling 發(fā)酵工程第45頁，共70頁，2022年，5月20日，4點52分，星期二項目進化速度進化對象進化周期影響對象突變效率常規(guī)定向進化緩慢進化整個基因組多年完整基因組低DNAShuffling快速進化特定基因/操縱子/病毒幾天部分基因組高DNA Shuffling與常規(guī)定向進化的比較 發(fā)酵工程第46頁，共70頁，2022年，5月20日，4點52分，星期二類 型示 例特 性活性增加倍

25、數(shù)潛在應(yīng)用領(lǐng)域抗 體人源抗體親和性400生物制藥酶天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶催化特異性10，000生物制藥 -內(nèi)酰胺酶抗生素抗性32，000抗生素枯草桿菌蛋白酶E耐熱性65耐熱時間17200工業(yè)酶細胞因子人類干擾素抗病毒285，000基因治療腫瘤抑制因子P5337半衰期12基因治療代謝途徑砷酸鹽代謝途徑砷酸鹽解毒40生物制藥汞代謝途徑汞解毒12生物制藥部分DNA Shuffling技術(shù)的研究成果第47頁，共70頁，2022年，5月20日，4點52分，星期二DNA改組(DNA Shuffling)技術(shù)的應(yīng)用領(lǐng)域分類用途進化DNA轉(zhuǎn)基因；疫苗載體；DNA疫苗；表達載體；基因轉(zhuǎn)移載體進化蛋白基因治療用酶；細胞因

26、子；生長因子；抗體；工業(yè)酶進化生物體植物；科研用生物體；化學(xué)及藥物加工；疫苗有機體；石油加工；除污生物第48頁，共70頁，2022年，5月20日，4點52分，星期二1）菌種的退化及原因菌種退化：指在較長時期傳代保藏后，菌株的一個或多個生理性狀和形態(tài)特征逐漸減退或消失的現(xiàn)象。 常見的菌種衷退在形態(tài)上表現(xiàn)為分生孢子的減少或菌落顏色的改變，與由于環(huán)境條件變化而引起菌落形態(tài)和生理上的變異是不同的 。1.6 菌種的退化與保藏菌種退化的原因：基因突變、變異菌株性狀分離、其他因素（溫度、濕度、培養(yǎng)基成分及各種培養(yǎng)條件）第49頁，共70頁，2022年，5月20日，4點52分，星期二1.6 菌種的退化與保藏狹義

27、的菌種復(fù)壯指在菌種已發(fā)生衰退的情況下，通過純種分離和測定生產(chǎn)性能等方法，從衰退的群體中找出少數(shù)尚未衰退的個體，從而達到恢復(fù)該菌原有典型性狀的目的。廣義的菌種復(fù)壯指在菌種的生產(chǎn)性能尚未衰退前，就經(jīng)常有意識地進行純種分離和生產(chǎn)性能測定工作，從而逐步提高菌種的生產(chǎn)特性。2）菌種的復(fù)壯第50頁，共70頁，2022年，5月20日，4點52分，星期二一、退化菌種的復(fù)壯1.6 菌種的退化與保藏 常用的方法是對已退化菌株用一定培養(yǎng)條件進行單細胞分離純化，從而限制退化菌株在數(shù)量上占優(yōu)勢，最后淘汰已退化菌落而使原菌株得以復(fù)壯。 純種分離的方法常用的有三種：稀釋分離法、平板劃線法和組織分離法（用于高等真菌）。2）菌

28、種的復(fù)壯第51頁，共70頁，2022年，5月20日，4點52分，星期二1.6 菌種的退化與保藏二、通過寄生進行復(fù)壯 寄生型微生物的退化可接種到相應(yīng)寄生體內(nèi)以提高菌株的活力。三、聯(lián)合復(fù)壯 對退化菌株還可用劑量的紫外線輻射和低劑量的亞硝基胍（NTC）聯(lián)合處理進行復(fù)壯。2）菌種的復(fù)壯第52頁，共70頁，2022年，5月20日，4點52分，星期二3）防止菌種退化的措施合理的育種選用合適的培養(yǎng)基創(chuàng)造良好的培養(yǎng)條件控制傳代次數(shù)利用不同類型的細胞進行移種傳代選擇有效的保藏方法1.6 菌種的退化與保藏第53頁，共70頁，2022年，5月20日，4點52分，星期二4）菌種保藏 菌種保藏的意義：是進行微生物學(xué)研究

29、和微生物育種工作的重要組成部分。其任務(wù)首先是菌種不死亡，同時還要盡可能設(shè)法把菌種的優(yōu)良特性保持下來而不致向壞的方面轉(zhuǎn)化。1.6 菌種的退化與保藏 菌種保藏的原理：根據(jù)菌種的生理生化特點，采用低溫、干燥、缺氧、缺乏營養(yǎng)、添加保護劑或酸中中和劑等方法，使使孢子或菌體的生長代謝活動盡量降低，以減少其變異。第54頁，共70頁，2022年，5月20日，4點52分，星期二4）菌種保藏1.6 菌種的退化與保藏 蒸餾水懸浮法 斜面低溫保藏 石蠟油封保藏 菌種保藏的方法 砂土管保藏 冷凍保藏 真空凍干保藏 寄主保藏（病毒、立克次氏體、螺旋體等不能人工培養(yǎng)） 基因工程菌的保藏普通冷凍冷凍保藏技術(shù)超低溫冷凍保藏技術(shù)

30、液氮冷凍保藏技術(shù)第55頁，共70頁，2022年，5月20日，4點52分，星期二小 結(jié) 涉及到工業(yè)化生產(chǎn)對于某一種特定的產(chǎn)品，只有 特定的微生物(動、植物)才具有大量表達的潛力； 傳統(tǒng)的誘變方法仍然是一種采用的方法，特別是 自然選育是工業(yè)發(fā)酵穩(wěn)產(chǎn)高產(chǎn)的重要保證； 目前土壤中已分離的微生物不到總數(shù)的1%，微生 物的多樣性仍然是以后若干年的研究重點； 基因重組、直接進化技術(shù)的應(yīng)用，大大加快了生 物產(chǎn)品開發(fā)的進程。1 發(fā)酵工業(yè)微生物菌種的選育第56頁，共70頁，2022年，5月20日，4點52分，星期二3.1 菌體組成和細胞外代謝產(chǎn)物3.2 種子培養(yǎng)的培養(yǎng)基選擇和配制原則3 種子培養(yǎng)基及其制備第二章

31、菌種的制備2/jing/C76/zcr-1.htm第57頁，共70頁，2022年，5月20日，4點52分，星期二3.1 菌體組成和細胞外代謝產(chǎn)物3 種子培養(yǎng)基及其制備1）菌體組成： ?2）胞外代謝產(chǎn)物 胞外產(chǎn)物多達37大類，根據(jù)微生物代謝產(chǎn)物和生長繁殖的關(guān)系不同，分為兩大類：一類是微生物自身生長繁殖所必需的代謝產(chǎn)物，稱為初級代謝產(chǎn)物，此類產(chǎn)物的生產(chǎn)菌種主要是細菌、酵母、霉菌等。另一類代謝產(chǎn)物與微生物生長繁殖無明確關(guān)系，稱為次級代謝產(chǎn)物，如抗生素、生物堿、色素等。發(fā)酵工業(yè)用來生產(chǎn)次級代謝產(chǎn)物的微生物僅有少數(shù)幾個類群，主要是絲狀放線菌、絲狀真菌等。 第58頁，共70頁，2022年，5月20日，4點

32、52分，星期二3.1 菌體組成和細胞外代謝產(chǎn)物3 種子培養(yǎng)基及其制備3）微生物的營養(yǎng)類型（nutritional types)碳源利用自養(yǎng)型（autotrophs） 異養(yǎng)型（heterotrophs） 能量來源光能營養(yǎng)型（Phototrophs） 化能營養(yǎng)型（chemotrophs） 光能無機自養(yǎng)型（Photo-Lithoautotrophy） 化能有機異養(yǎng)型（Photoorganoheterotrophy） 化能無機自養(yǎng)型（chemoLithoautotro-phy） 化能有機異養(yǎng)型（chemoorganoheterotrophy） 第59頁，共70頁，2022年，5月20日，4點52分，星

33、期二3.2 種子培養(yǎng)的培養(yǎng)基選擇和配制原則3 種子培養(yǎng)基及其制備1）培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分及來源 培養(yǎng)基（medium)是人們提供微生物生長繁殖和生物合成各種代謝產(chǎn)物所需要的按一定比例配制的多種營養(yǎng)物質(zhì)的混合物。包括：碳源(source of carbon) 氮源(source of nitrogen)無機鹽(inorganic salt)生長因子(growth factor) 水(water)第60頁，共70頁，2022年，5月20日，4點52分，星期二3.2 種子培養(yǎng)的培養(yǎng)基選擇和配制原則3 種子培養(yǎng)基及其制備2）培養(yǎng)基的類型和用途來源：天然培養(yǎng)基（complex medium；undefine

34、d medium） 合成培養(yǎng)基（synthetic medium； defined medium） 半合成培養(yǎng)基（semidefined medium） 外觀：固體培養(yǎng)基（solid medium） 液體培養(yǎng)基（liquid medium） 半固體培養(yǎng)基（semisolid medium） 功能：孢子培養(yǎng)基（sporemedium）和種子培養(yǎng)基。第61頁，共70頁，2022年，5月20日，4點52分，星期二3.2 種子培養(yǎng)的培養(yǎng)基選擇和配制原則3 種子培養(yǎng)基及其制備3）培養(yǎng)基的配制原則 選擇適宜的營養(yǎng)物質(zhì)、營養(yǎng)物質(zhì)濃度及配比合適、選擇合適的pH、氧化還原電勢、營養(yǎng)成分的加入順序（先加緩沖化合物

35、，溶解后加入主要物質(zhì)，然后加入維生素、氨基酸等生長素類的物質(zhì)）。2/jing/C76/zcr-1.htm第62頁，共70頁，2022年，5月20日，4點52分，星期二3.2 種子培養(yǎng)的培養(yǎng)基選擇和配制原則3 種子培養(yǎng)基及其制備4）培養(yǎng)基成分配比的選擇 種子和孢子培養(yǎng)的目的是獲得大量質(zhì)量良好的菌體或孢子，因此產(chǎn)量提高是選擇培養(yǎng)基的一個重要標準。 C/N比 來源豐富、價格便宜、取材方便 方法：單因子試驗、正交試驗、均勻試驗、影響面法第63頁，共70頁，2022年，5月20日，4點52分，星期二本章思考題1 工業(yè)用微生物的要求有哪些？試舉例說明微生物在工業(yè)中的應(yīng)用。2 簡述自然分離微生物的一般操作步

36、驟。3 簡述種子擴大培養(yǎng)的一般步驟。4 如何防止菌種衰退？菌種復(fù)壯的措施有哪些？5 影響種子質(zhì)量的因素有哪些？如何控制種子質(zhì)量？第64頁，共70頁，2022年，5月20日，4點52分，星期二 2008中國大學(xué)評價研究報告還發(fā)布了“2008中國最受媒體關(guān)注大學(xué)排行榜”，排行榜以2007年度高校網(wǎng)絡(luò)新聞搜索的數(shù)量統(tǒng)計得出，位居前十強的高校是北京大學(xué)、清華大學(xué)、中國人民大學(xué)、復(fù)旦大學(xué)、浙江大學(xué)、中山大學(xué)、北京師范大學(xué)、上海交通大學(xué)、武漢大學(xué)、同濟大學(xué)。 第65頁，共70頁，2022年，5月20日，4點52分，星期二中國一流大學(xué)名單校名 入選根據(jù) 清華大學(xué) 研究1型、工學(xué)第1名北京大學(xué) 研究1型、理學(xué)第1名浙江大學(xué) 研究1型、工學(xué)第2名