臨床免疫學(xué)和免疫檢驗(yàn)2017講義

1、第十一章 生物素-親和素放大技術(shù)生物素、親和素是一對(duì)具有高度親和力的物質(zhì)，它們的結(jié)合迅速、專一、穩(wěn)定并具有多級(jí)放大效應(yīng)。生物素-親和素系統(tǒng)（BAS）是一種以生物素和親和素具有的多級(jí)放大結(jié)合特性為基礎(chǔ)的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，它既能偶聯(lián)抗原抗體等大分子生物活性物質(zhì)，又可被熒光素、酶、放射性核素等材料標(biāo)記。第一節(jié) 生物素的理化性質(zhì)與標(biāo)記生物素（biotin，B）廣泛分布于動(dòng)、植物組織中含量較高的卵黃和肝組織中提取，分子量 244.31kD。一、活化生物素利用生物素的羧基加以化學(xué)修飾可制成各種活性基團(tuán)的衍生物，稱為活化生物素。（一）標(biāo)記蛋白質(zhì)氨基的活化生物素 此種活化生物素的方法是將生物素與 N-羥基酰胺在碳二亞

2、胺的作用下進(jìn)行縮和，生成生物素 N-羥基酰亞胺酯（biotinylN- hy-droxy-succinimide ester，BLAHS）。BLAHS 分子酯鍵中的-C=0 基團(tuán)可與蛋白質(zhì)分子中賴氨酸的氨基形成肽鍵，從而使蛋白質(zhì)標(biāo)記上生物素。長臂活化生物素（BCNHS）是在生物素和 N-羥基酰胺之間添加了兩個(gè) 6-氨基己糖分子基團(tuán)，形成連接臂，使其與抗體、酶等生物大分子結(jié)合后，不受位阻效應(yīng)的影響，更易發(fā)揮生物素的活性作用。（二）標(biāo)記蛋白質(zhì)醛基的活化生物素有兩種：生物素酰肼（BHZ）和肼化生物胞素（BGHZ）。（三）標(biāo)記蛋白質(zhì)巰基的活化生物素：3-（N-酰亞胺-丙酰）-生物胞素（MPB）。（四）

3、標(biāo)記核酸的活化生物素：生物素戊酸側(cè)鏈通過酰胺鍵與核酸分子相連，探針。1.光敏生物素：用于 DNA 或 RNA 的標(biāo)記。生物素標(biāo)記的核酸生物素脫氧核苷三磷酸：將生物素與某種脫氧核苷酸連接成活化生物素。用缺口移位法摻入到雙鏈 DNA 中。BNHS 和 BHZ：與核酸胞嘧啶分子中的 N-4 氨基交聯(lián)，使核酸分子生物素化。二、生物素標(biāo)記蛋白質(zhì)（一）生物素化蛋白質(zhì)衍生物的特性生物素通過噻吩環(huán)戊酸側(cè)鏈上的羧基與多種大分子偶聯(lián)活化后，可用于標(biāo)記各種蛋白質(zhì)形成生物素化蛋白質(zhì)衍生物。而且一個(gè)蛋白質(zhì)分子可連接多個(gè)生物素分子，從而使其具有較高的比活性，在與親和素的反應(yīng)中成為多價(jià)。生物素化大分子的多價(jià)性，是 BAS

4、多級(jí)放大作用的物質(zhì)基礎(chǔ)。生物素化蛋白質(zhì)衍生物有兩類，一種是生物素化的大分子活性物質(zhì)（如抗原、抗體），另一種是標(biāo)記材料（如酶）結(jié)合生物素后制成的標(biāo)記物。（二）標(biāo)記方法1.標(biāo)記抗體、抗原：由于一個(gè)抗體分子可連接多個(gè)生物素分子，因此一個(gè)生物素化的抗體分子在反應(yīng)時(shí)可與多個(gè)親和素分子結(jié)合。通常選用第二抗體進(jìn)行生物素標(biāo)記，2.標(biāo)記酶：如生物素標(biāo)記辣根過氧化物酶（HRP）。（三）標(biāo)記注意事項(xiàng)的標(biāo)記物具有通用性。應(yīng)根據(jù)抗原或抗體分子結(jié)構(gòu)中所帶可標(biāo)記基團(tuán)的種類（氨基、醛基或巰基）以及分子的理化性質(zhì)（酸性、中性或堿性），選擇相應(yīng)的活化生物素和反應(yīng)條件。標(biāo)記反應(yīng)時(shí)，活化生物素與待標(biāo)記抗原或抗體應(yīng)有適當(dāng)?shù)谋壤?，使每個(gè)

5、蛋白質(zhì)分子上標(biāo)記的生物素分子數(shù)量控制在一定范圍，以免影響標(biāo)記物的活性。為減少生物素標(biāo)記蛋白質(zhì)后，大分子物質(zhì)造成的空間位阻影響，有利于生物素與親和素的結(jié)合，可在生物素與被標(biāo)記物間加入交聯(lián)臂樣結(jié)構(gòu)。4.生物素與抗原、抗體等蛋白質(zhì)結(jié)合后，不影響后者的免疫活性；標(biāo)記酶時(shí)則結(jié)果有不同。第二節(jié) 親和素、鏈霉親和素的理化性質(zhì)與標(biāo)記親和素和鏈霉親和素是大分子蛋白，幾乎可以和任何用于標(biāo)記的物質(zhì)結(jié)合。一、親和素及其活性親和素（AV）耐熱并耐受多種蛋白水解酶的作用，尤其是與生物素結(jié)合后，穩(wěn)定性更好。每個(gè)親和素能結(jié)合 4 個(gè)分子的生物素，二者之間的親和力極強(qiáng)。二、鏈霉親和素及其活性鏈霉親和素（SA）是由鏈霉菌 str

6、eptomyavidi的一種蛋白質(zhì)，分子量為 65kD。鏈霉親和素（SA）分子中每條肽鏈都能結(jié)合一個(gè)生物素，因此一個(gè)鏈霉親和素分子也能結(jié)合 4 個(gè)生物素分子。三、親和素（或鏈霉親和素）的標(biāo)記用于標(biāo)記親和素或鏈霉親和素的小分子示蹤物有 125I、膠體金、熒光素和化學(xué)發(fā)光物，大分子物質(zhì)如酶、抗原或抗體、鐵蛋白和熒光蛋白等，其中最常用的是酶、異硫 酸熒光素（FITC）和膠體金。親和素或鏈霉親和素與酶的標(biāo)記結(jié)合物的中的生物素結(jié)合，間接地與酶形成結(jié)合物?？捎闷胀钢苯訕?biāo)記，還可以通過與生物素化酶復(fù)合物幾種親和素（或鏈霉親和素）與常用酶形成標(biāo)記結(jié)合物的方法：（一）親和素的標(biāo)記1.HRP-親和素結(jié)合物的改良

7、過碘酸鈉法戊二醛法親和素-生物素化 HRP 復(fù)合物的親和素-生物素化堿性磷酸酶（ABAP）復(fù)合物的（二）鏈霉親和素的標(biāo)記 鏈霉親和素（SA）因表面所帶正電荷少，且不含糖基，在實(shí)驗(yàn)中的非特異性結(jié)合遠(yuǎn)低于親和素，因此目前以鏈霉親和素標(biāo)記的酶結(jié)合物更為常用。1.HRP-SA 結(jié)合物的采用過碘酸鈉法直接標(biāo)記。2.SA-生物素化 HRP 復(fù)合物的。3.AP-SA 結(jié)合物的采用戊二醛二步法。第三節(jié) 生物素-親和素系統(tǒng)的特點(diǎn)生物素、親和素結(jié)合的多級(jí)放大作用，以及 BAS 既可偶聯(lián)生物大分子，又可連接標(biāo)記材料的特性，使BAS 不僅用于微量抗原、抗體及受體的定量、定性檢測及定位觀察研究，亦可制成親和介質(zhì)用于上述

8、各類反應(yīng)體系中反應(yīng)物的分離、純化。BAS 的優(yōu)越性：一、靈敏度：每個(gè)親和素分子有四個(gè)生物素結(jié)合部位，因此，BAS 具有多級(jí)放大作用，使其在應(yīng)用時(shí)可極大地提高檢測方法的靈敏度。二、特異性：親和素與生物素間的結(jié)合具有極高的親和力，其反應(yīng)呈高度專一性。而且，BAS 結(jié)合特性不會(huì)因反應(yīng)試劑的高度稀釋而受影響，使其在實(shí)際應(yīng)用中可最大限度地降低反應(yīng)試劑的非特異作用。三、穩(wěn)定性：親和素與生物素間的親和常數(shù)極高，結(jié)合形成的復(fù)合物的解離常數(shù)很小，呈不可逆反應(yīng)性；而且酸、堿、變性劑等均不影響其結(jié)合。四、適用性：生物素和親和素可與酶、熒光素和放射性核素等各類標(biāo)記技術(shù)結(jié)合，用于檢測體液、組織或細(xì)胞中的抗原-抗體、激素

9、-受體和核酸系統(tǒng)以及其他多種生物學(xué)反應(yīng)體系；而且也可制成親和介質(zhì)，用于分離提純上述各反應(yīng)體系中的反應(yīng)物。五、其他：BAS 可依據(jù)具體實(shí)驗(yàn)方法要求制成多種通用性試劑（如生物素化第二抗體等），適用于不同的反應(yīng)體系；而且都可高度稀釋，用量很少，實(shí)驗(yàn)成本低；尤其是 BAS 與成本高昂的抗原特異性第一抗體偶聯(lián)使用，可使后者的用量大幅度減少，節(jié)約實(shí)驗(yàn)費(fèi)用。此外，由于生物素與親和素的結(jié)合具高速、高效的特性，盡管 BAS 的反應(yīng)層次較多，但所需的溫育時(shí)間不長，實(shí)驗(yàn)往往只需數(shù)小時(shí)即可完成。第四節(jié) 生物素-親和素系統(tǒng)的應(yīng)用一、生物素-親和素系統(tǒng)基本類型及原理（一）以游離親和素為中間物，分別連接包含生物素化大分子的

10、待檢反應(yīng)體系和標(biāo)記生物素，稱為 BAB法；后又發(fā)展了親和素-生物素化酶復(fù)合物技術(shù)（ABC）。（二）直接用標(biāo)記親和素連接生物素化大分子反應(yīng)體系進(jìn)行檢測的 BA 法，或稱標(biāo)記親和素-生物素法（LAB）。BAB 法 BAB 法也稱為橋聯(lián)親和素-標(biāo)記生物素法（BRAB），是以游離的親和素（或鏈霉親和素）作為橋聯(lián)劑，利用親和素的多價(jià)性，將檢測反應(yīng)體系中抗原-生物素化抗體復(fù)合物與標(biāo)記生物素（如酶標(biāo)生物素）連接起來，達(dá)到檢測反應(yīng)分子的目的。ABC 法 ABC 法是在 BAB 法基礎(chǔ)上的改良，其原理是預(yù)先按一定比例將親和素（或鏈霉親和素）與酶標(biāo) 生物素結(jié)合，形成可溶性的親和素（或鏈霉親和素）-生物素-過氧化物

11、酶復(fù)合物（ABC 或 SABC）。當(dāng)其與 檢測反應(yīng)體系中的生物素化抗體（直接法）或生物素化第二抗體（間接法）相遇時(shí)，ABC（或 SABC）中未飽和的親和素（或鏈霉親和素）結(jié)合部位即可與抗體上的生物素結(jié)合，使抗原-抗體反應(yīng)體系與 ABC（或 SABC）標(biāo)記體系連成一體進(jìn)行檢測。BA 法 BA（或 LAB）法是以標(biāo)記親和素（或鏈霉親和素）直接與免疫復(fù)合物中的生物素化抗體連接進(jìn)行檢測。二、生物素-親和素系統(tǒng)在酶免疫測定中的應(yīng)用（一）將 BAS 與 ELISA 偶聯(lián)可提高 ELISA 的靈敏度：每個(gè)親和素可結(jié)合 4 個(gè)生物素，可使反應(yīng)明顯放大；親和素與生物素間極高的親和力，使反應(yīng)結(jié)合更牢固穩(wěn)定，而且特

12、異性高；用小分子生物素代替酶標(biāo)記抗體，可減少反應(yīng)中的空間位阻。（二）生物素-親和素系統(tǒng)可作為均相酶免疫測定中高效的酶活性調(diào)變系統(tǒng)。三、生物素-親和素系統(tǒng)在熒光免疫技術(shù)中的應(yīng)用通常采用 BA 法，即用熒光素直接標(biāo)記親和素（或鏈霉親和素）；也可采用游離親和素（或鏈霉親和素）搭橋，兩端分別連接生物素化抗體和熒光素標(biāo)記的生物素（BAB 法）或熒光標(biāo)記的抗親和素（或鏈霉親和素）抗體的夾心法。酶放大時(shí)間分辨熒光免疫分析（EATRFIA）則是在抗原與固相 McAb 和生物素化 McAb 反應(yīng)形成夾心復(fù)合物后，加入堿性磷酸酶（ALP）標(biāo)記的 SA（ALP-SA）繼續(xù)反應(yīng)，經(jīng)生物素和 SA 的高親和力結(jié)合，形成復(fù)合物：固相 McAb-Ag-（McAb-生物素化）-（SA-ALP）。ALP 再作用底物生成產(chǎn)物 5-氟水楊酸，后者在堿性條件下，可與 Tb3+-EDTA 形成熒光長且產(chǎn)額高的三元復(fù)合物用于檢測。四、生物素-親和素系統(tǒng)在放射免疫測定中的應(yīng)用BAS 主要與免疫放射分析（IRMA）檢測體系偶聯(lián)，用于對(duì)終反應(yīng)的放A 法）。此外，BAS 也可用于 IRMA 反應(yīng)后B，F(xiàn) 成分的分離。該法的優(yōu)點(diǎn)是克服了其他 IRMA 法需多次離心的麻煩，待測復(fù)合物與固相結(jié)合更牢固，操