堿性磷酸酶的顯示實(shí)驗(yàn)原理及步驟

1、 實(shí)驗(yàn)八 堿性磷酸酶的顯示 一、試驗(yàn)原理：本試驗(yàn)是一個(gè)酶組織化學(xué)試驗(yàn)，酶組織化學(xué)是在不破壞組織細(xì)胞的條件下，檢測酶的存在，定位與活性的學(xué)科，即在酶的存在，分布及其用在顯微鏡下變成可見的。生命是有序的，包括時(shí)間的有序及其空間的有序。其中美的空間有序性在于其細(xì)胞組織結(jié)構(gòu)的精確位置，各種酶的自己的位置保證了化學(xué)活動(dòng)的有效進(jìn)行。 酶的定位方法必須準(zhǔn)確，其顯示方法必須具有高度的特異性，使酶本身具有可見性，這是一種直接的方法，目前主要有免疫熒光化學(xué)法，該法敏感性高，速度快，但成本高。如果有相同的抗原決定簇時(shí)，則會有交叉反應(yīng)。 方法成熟，使用廣泛的還是經(jīng)典的組織化學(xué)方法。下面以堿性磷酸酶的顯示方法來學(xué)習(xí)經(jīng)典

2、酶組織化學(xué)的理論及操作。 經(jīng)典酶組織化學(xué)不是顯示酶本身，常采用的方法是：在一定條件下，使細(xì)胞中的酶作用于酶的底物，使其產(chǎn)物在原地進(jìn)行捕捉、沉淀轉(zhuǎn)化為有色產(chǎn)物。堿性磷酸酶（AKP）的顯示方法最早由Gomeri（1939）提出，現(xiàn)在這種方法稱為Gomeri法。堿性磷酸酶是指磷酸單酯酶，它能在pH8.610.0的最適條件下分解磷酸單酯，對于與磷酸相接的醇基沒有特異性，Gomeri法是讓該酶在堿性條件下，分解甘油磷酸鈉，產(chǎn)生磷酸根。在孵育液中加入CaCl2，分解產(chǎn)生的磷酸根離子立即被Ca2+原位捕捉形成沉淀。 HPO2-+Ca2+CaHPO4 （無色沉淀）因出現(xiàn)的是無色沉淀，故還不能在光鏡下觀察到，尚

3、需轉(zhuǎn)化為有色沉淀，先讓制片與Co（NO3）2反應(yīng)生成磷酸鈷： CaHPO4+Co（NO3）2 CoHPO4 （無色沉淀）+ Ca（NO3）2 再讓它與硫化銨反應(yīng)生成黑色的硫化鈷沉淀。 CoHPO4 +（NH4）2S（NH4）2HPO4 +CoS （黑色沉淀）我們可以在顯微鏡下觀察到黑色沉淀的位置，由于以上的這些操作都是在原位進(jìn)行的，可以認(rèn)為黑色沉淀的位置就是酶所在的位置，這類方法是讓酶作用于底物而將酶顯示出來。因此制作酶組織切片的時(shí)候不能使酶失活，還要盡量避免酶所需的反應(yīng)的產(chǎn)物擴(kuò)散，否則不會得到正確的結(jié)果。 二、組織制備： 1.取材：取動(dòng)物腎、小腸等大塊組織，大小約2-3mm。 2.固定：將取

4、下的材料迅速在冷丙酮中固定24小時(shí)（一直在4oC中進(jìn)行），中間換冷丙酮4次。 3.包埋：將固定好的材料，用純酒精脫水30分鐘（中間交換一次），二甲苯透明（20分鐘），用快速法把材料包埋于石蠟中（用低熔點(diǎn)的石蠟）。 4.切片：切片56，在37oC以下的溫水中展片，將蠟片粘于涂有蛋白膠的載波片上。 5.把切片置于37oC溫箱種干燥小時(shí)。 6.將切片置于4oC的冰箱，直至試驗(yàn)前才取出。 三、器材（每小組需用）：1.立式染缸 12個(gè) 2.鑷子 2把3.量筒 25ml 1個(gè) 10ml 1個(gè)4.恒溫水?。?7oC） 1個(gè)5.沸水浴 1個(gè)6.電爐 1個(gè) 四、試劑：1.二甲苯 2.無水乙醇3. 95%乙醇 4

5、.90%乙醇5. 70%乙醇 6.30%乙醇7. 3% 甘油磷酸鈉 8.2%巴比妥液9. 2% 氯化鈣 10.2%硫酸鎂11.2%硫化銨（45ml蒸餾水+硫化銨6-7滴） 12.2%硝酸鈷13.AKP作用液： 3%甘油磷酸鈉 10ml 2%巴比妥液 10ml 2%氯化鈣 2 ml 2%硫酸鎂 1 ml 蒸餾水 20 ml 五、操作步驟： 1.每人取已粘好烘干的鼠腎切片兩塊，放入二甲苯（一）二甲苯（二）（各3-4分鐘）的染缸中進(jìn)行脫蠟，再經(jīng)100%乙醇（一）100%乙醇（二）95%乙醇90%乙醇70%乙醇30%乙醇水。每級各一分鐘，在移切片時(shí)，用鑷子夾住切片震蕩并提起，放下反復(fù)幾次，在移入下一染缸邊緣前稍停留，讓溶液滴凈后，再入下一染缸，以免把上一染缸溶液過多帶入下一染缸，而影響切片質(zhì)量。 2.將其中一塊切片以蠟筆作一標(biāo)記（用作對照組切片），放入沸水中煮沸5分鐘。 3.將兩塊切片均放入AKP作用液中孵育30-60分鐘，作用液要事先預(yù)熱到37oC，水浴中進(jìn)行。 4.取出切片在蒸餾水中洗滌。 5.放入硝酸鈷溶液2-3分鐘。 6.蒸餾水沖洗干凈，否則切片易被污染，影響定位。 7.切片浸入硫化銨中2-3分鐘。 8.蒸餾水沖洗干凈。 9.經(jīng)各級酒精脫水。即30%乙醇70%乙醇90%乙醇950%乙醇100%乙醇（二）100