臨床免疫學(xué)檢驗(yàn)：免疫金標(biāo)記技術(shù)

1、1免疫金標(biāo)記技術(shù)(Immunogold labelling techique) 2目的和要求掌握金免疫測(cè)定在臨床快速檢驗(yàn)中的應(yīng)用斑點(diǎn)免疫金滲濾試驗(yàn)和金免疫層析試驗(yàn)的原理及方法學(xué)評(píng)價(jià)熟悉膠體金與免疫金的特性、制備過程和影響因素了解金免疫組織化學(xué)技術(shù)3免疫技術(shù)試劑標(biāo)本AgAbAbAg4標(biāo)記免疫技術(shù)試劑標(biāo)本Ag*AbAb*Ag放射性核素?zé)晒馑孛富瘜W(xué)發(fā)光劑膠體金標(biāo)記物技術(shù)放射性核素放射免疫技術(shù)熒光素?zé)晒饷庖呒夹g(shù)酶酶免疫技術(shù)化學(xué)發(fā)光劑化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)膠體金金免疫技術(shù)5金免疫測(cè)定技術(shù) 金免疫組織化學(xué)染色技術(shù) 金免疫技術(shù)斑點(diǎn)金免疫滲濾試驗(yàn)金免疫層析試驗(yàn)金免疫光鏡染色技術(shù)金免疫電鏡染色技術(shù)6簡(jiǎn)介 膠體金顆粒具

2、有高電子密度的特性，故在金標(biāo)蛋白的抗原抗體結(jié)合處，顯微鏡下可見黑褐色顆粒； 當(dāng)這些標(biāo)記物在相應(yīng)的標(biāo)記處大量聚集時(shí)，可在載體膜上呈現(xiàn)肉眼可見紅色或粉紅色斑點(diǎn)(線); 從而用于抗原或抗體物質(zhì)的定位或定性。金免疫組織化學(xué)染色技術(shù)金免疫測(cè)定技術(shù)78制備膠體金制備免疫金建立金免疫測(cè)定技術(shù)9膠體金的特性膠體金（金溶膠）：是由金鹽被還原成原子金后形成的金顆粒懸液。膠體金的特性膠體性質(zhì)：穩(wěn)定性、對(duì)電解質(zhì)的敏感性光吸收性和呈色性：膠體金的光吸收峰波長隨顆粒的大小而變化。穩(wěn)定性：影響因素-電解質(zhì)、溶膠濃度、溫度、穩(wěn)定劑10呈色性不同大小的膠體金呈現(xiàn)不同的顏色 小顆粒-橙黃色 中等顆粒酒紅色 較大顆粒深紅色 大顆粒

3、紫色 11膠體性質(zhì)穩(wěn)定性：穩(wěn)定地、均勻地、呈單一分散狀態(tài)懸浮于液體中121檸檬酸三鈉加入量（ml）*膠體金特性 max 呈色162.00 橙色518nm24.51.50 橙紅522nm411.00 紅色525nm71.50.70 紫色535nm膠體金粒徑（nm）13膠體金的制備化學(xué)還原法:向一定濃度的金溶液內(nèi)加入一定量的還原劑使金離子變成金原子,形成金顆粒懸液。還原材料：氯金酸（HAuCl4)還原劑：枸櫞酸鹽、白磷、硼氫化鈉、維生素C。最常用的制備方法：枸櫞酸鹽還原法 14 操作要點(diǎn) 配HAuC4水溶液 加熱 沸 枸櫞酸三鈉 攪動(dòng) 加熱 沸（約23min*）冷卻 加蒸餾水至 原體積 * 見淡黃

4、色的氯金酸水溶液在檸檬酸鈉加入后 很快變灰色，續(xù)而轉(zhuǎn)成黑色，隨后逐漸穩(wěn)定 成紅色。通過改變枸櫞酸鈉的用量可制得不同大小的膠體金顆粒15制備膠體金的注意事項(xiàng)（1）玻璃容器必須是 最好是經(jīng)硅 化處理的。（2）氯金酸對(duì)金屬有強(qiáng)烈的腐蝕性（3）氯金酸易潮解（4）制備膠體金應(yīng)用 或者是 高質(zhì)量的去離子水。 ，不應(yīng)使用金屬藥匙稱量氯金酸。雙蒸/三蒸餾水，絕對(duì)清潔的，應(yīng)干燥、避光保存。16膠體金的鑒定和保存鑒定 1、 清亮透明 2、金顆粒的大小 通過觀察膠體金的顏色，粗略估計(jì)金顆粒的大??； 分光光度計(jì)掃描max來估計(jì)金顆粒的粒徑 電鏡觀察保存 保存于潔凈的玻璃器皿中，室溫或4C，加入少許防腐劑（如0.02N

5、aN3）可有利于保存。17優(yōu) 質(zhì)劣 質(zhì)18免疫金的特性用于免疫測(cè)定時(shí)膠體金多與免疫活性物質(zhì)（抗原或抗體）結(jié)合，這類膠體金結(jié)合物常稱為免疫金復(fù)合物，或簡(jiǎn)稱免疫金（immunogold）。膠體金可以和蛋白質(zhì)等各種大分子物質(zhì)結(jié)合，在免疫組織化學(xué)技術(shù)中，習(xí)慣上將膠體金結(jié)合蛋白質(zhì)的復(fù)合物稱為金探針。物理吸附性： - - - + + + + 膠體金蛋白質(zhì)19免疫金的制備制備要點(diǎn)PH值的調(diào)整：原則上可選擇待標(biāo)記蛋白質(zhì)等電點(diǎn)，也可略為偏堿 蛋白質(zhì)最適標(biāo)記量的確定標(biāo)記過程離心純化：超速離心法 免疫金最終用稀釋液配成工作濃度保存 ：穩(wěn)定劑-PEG，BSA20待標(biāo)記蛋白作系列稀釋+定量膠體金+Nacl最適標(biāo)記量：能

6、保持紅色不變而蛋白含量最低的一管蛋白量逐漸減低對(duì)照管21金免疫測(cè)定技術(shù) 固相膜免疫測(cè)定技術(shù)固相載體：硝酸纖維素膜標(biāo)志物：膠體金斑點(diǎn)金免疫滲濾試驗(yàn)（ dot immunogold filtration assay,DIGFA ），又稱為滴金免疫測(cè)定法金免疫層析試驗(yàn) （ goldimmunochromatographic assay,GICA ） 22斑點(diǎn)金免疫滲濾試驗(yàn)（dot immunogold filtration assay,DIGFA) 操作示意圖裝置分解圖蓋微孔膜吸水墊料底加標(biāo)本 免疫金 洗滌液23技術(shù)類型：夾心法、間接法雙抗體夾心法24間接法25質(zhì)控雙抗體夾心法：相應(yīng)抗原間接法：反應(yīng)

7、斑點(diǎn)質(zhì)控點(diǎn)人IgG26反應(yīng)線質(zhì)控線陽性陰性DIGFA雙抗體夾心法測(cè)抗原AB操作技術(shù)要點(diǎn)DIGFA結(jié)果判斷29金免疫層析試驗(yàn)（goldimmunochromatographic assay, GICA)GTC30 夾心法 競(jìng)爭(zhēng)法(抑制法） 間接法金免疫層析試驗(yàn)（ goldimmunochromatographic assay,GICA )雙抗原夾心法雙抗體夾心法31雙抗體夾心法G區(qū)：金標(biāo)特異性抗體(兔型)C區(qū)：羊抗兔IgT區(qū)：特異性抗體 吸水紙標(biāo)本陽性結(jié)果33競(jìng)爭(zhēng)法標(biāo)本G區(qū)：金標(biāo)特異性抗體(兔型)C區(qū)：羊抗兔IgT區(qū)：標(biāo)準(zhǔn)抗原 吸水紙陽性結(jié)果34標(biāo)本G區(qū)：金標(biāo)特異性抗體(兔型)C區(qū)：羊抗兔IgT

8、區(qū)：標(biāo)準(zhǔn)抗原 吸水紙陰性結(jié)果35間接法反流免疫層析法合上檢測(cè)盒窗(B)吸水材料(A)金標(biāo)抗人IgG(G0)吸水材料(D)吸水材料(F)標(biāo)本加樣區(qū)(E)包被抗原（T）標(biāo)記線(G)液體流動(dòng)方向包被抗抗體（C）36標(biāo)本CTCT閉合前閉合后E陽性結(jié)果37CT38DIGFA與GICA的比較DIGFA （穿透濾過型）GICA （橫向流動(dòng)型）硝酸纖維素膜的種類圓片膜窄長型膜試劑形式滲濾裝置及2瓶液體試劑（液相形式 ）單一試劑條(板)（固相形式 ）操作步驟31觀察時(shí)間操作結(jié)束(約3min)即刻觀察操作結(jié)束后等待3-20min39IFA 穿流（FLOW THROUGH）ICA 橫流（LATERAL FLOW）4

9、0免疫金標(biāo)記技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)結(jié)果判讀簡(jiǎn)單：以膠體金為指示劑，本身形成免疫分析過程后的顏色標(biāo)記自帶質(zhì)控對(duì)照簡(jiǎn)便、快速：全部檢測(cè)過程僅需 3-20分鐘。可單份檢測(cè)41免疫金標(biāo)記技術(shù)的不足之處敏感度略低，價(jià)格略高（與ELISA比）一般作為定性，不易定量。 金標(biāo)法在臨床中的應(yīng)用感染性疾病的診斷妊娠、排卵的診斷腫瘤標(biāo)志心肌標(biāo)志濫用藥物實(shí)例1：HBsAg的檢測(cè)實(shí)例2：HCG的檢測(cè)42金免疫組織化學(xué)技術(shù)一、免疫金（銀）光鏡染色技術(shù)二、免疫金電鏡染色技術(shù)43 免疫金銀染色原理示意圖44臨床應(yīng)用與評(píng)價(jià)檢測(cè)細(xì)胞懸液或培養(yǎng)單層細(xì)胞的膜表面抗原檢測(cè)培養(yǎng)的單層細(xì)胞胞內(nèi)抗原檢測(cè)組織中或切片中的抗原免疫金電鏡染色技術(shù)：操作簡(jiǎn)便，

10、敏感性高，定位精確，雙標(biāo)記或多標(biāo)記免疫金（銀）光鏡染色：敏感性提高，可以替代熒光免疫技術(shù)；彌補(bǔ)其它標(biāo)記染色技術(shù)本底過高和內(nèi)部酶活性干擾的缺點(diǎn)46HBsAg診斷試劑試劑盒參考圖示 47操作步驟1：洗凈雙手 步驟2：用采血針采指尖血 步驟3：將1滴指尖血滴入加樣孔 ，或者用吸管將1滴指尖血滴入加樣孔48步驟4：立即加1-2滴緩沖液 步驟5：15分鐘讀取結(jié)果 49?結(jié)果 ?結(jié)果 50早孕膠體金法檢測(cè)試劑 步驟:從包裝鋁箔袋中取出試紙條步驟:將試紙條按箭頭方向插入尿液標(biāo)本中步驟:至少5秒后取出放于干凈平臺(tái)上或放在尿杯中讀結(jié)果。測(cè)試結(jié)果應(yīng)在3分鐘讀取.51小結(jié)金免疫測(cè)定技術(shù) 金免疫組織化學(xué)染色技術(shù) 金免疫技術(shù)斑點(diǎn)金免