臨床免疫學檢驗：免疫金標記技術

1、1免疫金標記技術(Immunogold labelling techique) 2目的和要求掌握金免疫測定在臨床快速檢驗中的應用斑點免疫金滲濾試驗和金免疫層析試驗的原理及方法學評價熟悉膠體金與免疫金的特性、制備過程和影響因素了解金免疫組織化學技術3免疫技術試劑標本AgAbAbAg4標記免疫技術試劑標本Ag*AbAb*Ag放射性核素熒光素酶化學發(fā)光劑膠體金標記物技術放射性核素放射免疫技術熒光素熒光免疫技術酶酶免疫技術化學發(fā)光劑化學發(fā)光免疫技術膠體金金免疫技術5金免疫測定技術 金免疫組織化學染色技術 金免疫技術斑點金免疫滲濾試驗金免疫層析試驗金免疫光鏡染色技術金免疫電鏡染色技術6簡介 膠體金顆粒具

2、有高電子密度的特性，故在金標蛋白的抗原抗體結合處，顯微鏡下可見黑褐色顆粒； 當這些標記物在相應的標記處大量聚集時，可在載體膜上呈現(xiàn)肉眼可見紅色或粉紅色斑點(線); 從而用于抗原或抗體物質的定位或定性。金免疫組織化學染色技術金免疫測定技術78制備膠體金制備免疫金建立金免疫測定技術9膠體金的特性膠體金（金溶膠）：是由金鹽被還原成原子金后形成的金顆粒懸液。膠體金的特性膠體性質：穩(wěn)定性、對電解質的敏感性光吸收性和呈色性：膠體金的光吸收峰波長隨顆粒的大小而變化。穩(wěn)定性：影響因素-電解質、溶膠濃度、溫度、穩(wěn)定劑10呈色性不同大小的膠體金呈現(xiàn)不同的顏色 小顆粒-橙黃色 中等顆粒酒紅色 較大顆粒深紅色 大顆粒

3、紫色 11膠體性質穩(wěn)定性：穩(wěn)定地、均勻地、呈單一分散狀態(tài)懸浮于液體中121檸檬酸三鈉加入量（ml）*膠體金特性 max 呈色162.00 橙色518nm24.51.50 橙紅522nm411.00 紅色525nm71.50.70 紫色535nm膠體金粒徑（nm）13膠體金的制備化學還原法:向一定濃度的金溶液內加入一定量的還原劑使金離子變成金原子,形成金顆粒懸液。還原材料：氯金酸（HAuCl4)還原劑：枸櫞酸鹽、白磷、硼氫化鈉、維生素C。最常用的制備方法：枸櫞酸鹽還原法 14 操作要點 配HAuC4水溶液 加熱 沸 枸櫞酸三鈉 攪動 加熱 沸（約23min*）冷卻 加蒸餾水至 原體積 * 見淡黃

4、色的氯金酸水溶液在檸檬酸鈉加入后 很快變灰色，續(xù)而轉成黑色，隨后逐漸穩(wěn)定 成紅色。通過改變枸櫞酸鈉的用量可制得不同大小的膠體金顆粒15制備膠體金的注意事項（1）玻璃容器必須是 最好是經(jīng)硅 化處理的。（2）氯金酸對金屬有強烈的腐蝕性（3）氯金酸易潮解（4）制備膠體金應用 或者是 高質量的去離子水。 ，不應使用金屬藥匙稱量氯金酸。雙蒸/三蒸餾水，絕對清潔的，應干燥、避光保存。16膠體金的鑒定和保存鑒定 1、 清亮透明 2、金顆粒的大小 通過觀察膠體金的顏色，粗略估計金顆粒的大小； 分光光度計掃描max來估計金顆粒的粒徑 電鏡觀察保存 保存于潔凈的玻璃器皿中，室溫或4C，加入少許防腐劑（如0.02N

5、aN3）可有利于保存。17優(yōu) 質劣 質18免疫金的特性用于免疫測定時膠體金多與免疫活性物質（抗原或抗體）結合，這類膠體金結合物常稱為免疫金復合物，或簡稱免疫金（immunogold）。膠體金可以和蛋白質等各種大分子物質結合，在免疫組織化學技術中，習慣上將膠體金結合蛋白質的復合物稱為金探針。物理吸附性： - - - + + + + 膠體金蛋白質19免疫金的制備制備要點PH值的調整：原則上可選擇待標記蛋白質等電點，也可略為偏堿 蛋白質最適標記量的確定標記過程離心純化：超速離心法 免疫金最終用稀釋液配成工作濃度保存 ：穩(wěn)定劑-PEG，BSA20待標記蛋白作系列稀釋+定量膠體金+Nacl最適標記量：能

6、保持紅色不變而蛋白含量最低的一管蛋白量逐漸減低對照管21金免疫測定技術 固相膜免疫測定技術固相載體：硝酸纖維素膜標志物：膠體金斑點金免疫滲濾試驗（ dot immunogold filtration assay,DIGFA ），又稱為滴金免疫測定法金免疫層析試驗 （ goldimmunochromatographic assay,GICA ） 22斑點金免疫滲濾試驗（dot immunogold filtration assay,DIGFA) 操作示意圖裝置分解圖蓋微孔膜吸水墊料底加標本 免疫金 洗滌液23技術類型：夾心法、間接法雙抗體夾心法24間接法25質控雙抗體夾心法：相應抗原間接法：反應

7、斑點質控點人IgG26反應線質控線陽性陰性DIGFA雙抗體夾心法測抗原AB操作技術要點DIGFA結果判斷29金免疫層析試驗（goldimmunochromatographic assay, GICA)GTC30 夾心法 競爭法(抑制法） 間接法金免疫層析試驗（ goldimmunochromatographic assay,GICA )雙抗原夾心法雙抗體夾心法31雙抗體夾心法G區(qū)：金標特異性抗體(兔型)C區(qū)：羊抗兔IgT區(qū)：特異性抗體 吸水紙標本陽性結果33競爭法標本G區(qū)：金標特異性抗體(兔型)C區(qū)：羊抗兔IgT區(qū)：標準抗原 吸水紙陽性結果34標本G區(qū)：金標特異性抗體(兔型)C區(qū)：羊抗兔IgT

8、區(qū)：標準抗原 吸水紙陰性結果35間接法反流免疫層析法合上檢測盒窗(B)吸水材料(A)金標抗人IgG(G0)吸水材料(D)吸水材料(F)標本加樣區(qū)(E)包被抗原（T）標記線(G)液體流動方向包被抗抗體（C）36標本CTCT閉合前閉合后E陽性結果37CT38DIGFA與GICA的比較DIGFA （穿透濾過型）GICA （橫向流動型）硝酸纖維素膜的種類圓片膜窄長型膜試劑形式滲濾裝置及2瓶液體試劑（液相形式 ）單一試劑條(板)（固相形式 ）操作步驟31觀察時間操作結束(約3min)即刻觀察操作結束后等待3-20min39IFA 穿流（FLOW THROUGH）ICA 橫流（LATERAL FLOW）4

9、0免疫金標記技術的優(yōu)點結果判讀簡單：以膠體金為指示劑，本身形成免疫分析過程后的顏色標記自帶質控對照簡便、快速：全部檢測過程僅需 3-20分鐘?？蓡畏輽z測41免疫金標記技術的不足之處敏感度略低，價格略高（與ELISA比）一般作為定性，不易定量。 金標法在臨床中的應用感染性疾病的診斷妊娠、排卵的診斷腫瘤標志心肌標志濫用藥物實例1：HBsAg的檢測實例2：HCG的檢測42金免疫組織化學技術一、免疫金（銀）光鏡染色技術二、免疫金電鏡染色技術43 免疫金銀染色原理示意圖44臨床應用與評價檢測細胞懸液或培養(yǎng)單層細胞的膜表面抗原檢測培養(yǎng)的單層細胞胞內抗原檢測組織中或切片中的抗原免疫金電鏡染色技術：操作簡便，

10、敏感性高，定位精確，雙標記或多標記免疫金（銀）光鏡染色：敏感性提高，可以替代熒光免疫技術；彌補其它標記染色技術本底過高和內部酶活性干擾的缺點46HBsAg診斷試劑試劑盒參考圖示 47操作步驟1：洗凈雙手 步驟2：用采血針采指尖血 步驟3：將1滴指尖血滴入加樣孔 ，或者用吸管將1滴指尖血滴入加樣孔48步驟4：立即加1-2滴緩沖液 步驟5：15分鐘讀取結果 49?結果 ?結果 50早孕膠體金法檢測試劑 步驟:從包裝鋁箔袋中取出試紙條步驟:將試紙條按箭頭方向插入尿液標本中步驟:至少5秒后取出放于干凈平臺上或放在尿杯中讀結果。測試結果應在3分鐘讀取.51小結金免疫測定技術 金免疫組織化學染色技術 金免疫技術斑點金免