臨床免疫學檢驗：化學發(fā)光免疫分析技術(shù)

1、化學發(fā)光免疫分析技術(shù)酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）（enzyme-linked immunosorbent assay）酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）（enzyme-linked immunosorbent assay）化學發(fā)光免疫分析（CLIA）（ chemiluminescence immunoassay）技術(shù)要點抗原抗體反應雙抗體夾心法雙抗原夾心法間接法競爭法標記免疫復合物（B）和游離標記物（F）分離顯色（光強度的檢測）標準曲線制作和標本結(jié)果計算化學發(fā)光免疫分析技術(shù)（chemiluminescence immunoassay techniques) 是將化學發(fā)光與免疫反應相結(jié)合，用于檢測

2、微量抗原或抗體的一種新型標記免疫分析技術(shù)。 特點：特異性高、敏感性高、分離簡便、快速、試劑無毒、安全穩(wěn)定、 可自動化發(fā)光（luminescence) 一種物質(zhì)由電子激發(fā)態(tài)回復到基態(tài)時，釋放出的能量表現(xiàn)為光的發(fā)射。光照發(fā)光（photoluminescence) 生物發(fā)光（bioluminescence)化學發(fā)光（chemiluminescence)第一節(jié) 概述光照發(fā)光（photoluminescence) 發(fā)光劑經(jīng)短波長入射后進入激發(fā)態(tài)，當回復至基態(tài)時發(fā)出較長波長的可見光。生物發(fā)光（bioluminescence) 熒光素在熒光素酶的催化下，利用ATP能，生成激發(fā)態(tài)氧化熒光素，在回復基態(tài)時多余的

3、能量以光子釋放出的光?；瘜W激發(fā)（足夠能量170-300kj/mol)發(fā)光化學發(fā)光（chemiluminescence) 物質(zhì)在化學反應過程中，其物質(zhì)分子吸收化學能產(chǎn)生的光的輻射現(xiàn)象?；瘜W反應產(chǎn)生的能量 產(chǎn)物分子（或中間態(tài)分子）呈激發(fā)態(tài) 發(fā)射光子 衰退到基態(tài) （釋放能量）化學發(fā)光效率（或量子產(chǎn)率）（CL）決定于生成激發(fā)態(tài)產(chǎn)物分子的化學激發(fā)效率（CE） 激發(fā)態(tài)分子的發(fā)射效率（EM）化學發(fā)光效率越高，檢測的靈敏度越高。化學發(fā)光劑（chemiluminescence reagent) 在化學反應中參與能量轉(zhuǎn)移并最終以發(fā)射光子的形式釋放能量的化合物。酶促反應的發(fā)光劑 直接化學發(fā)光劑電化學發(fā)光劑第二節(jié) 化

4、學發(fā)光劑與標記技術(shù)能作為化學發(fā)光劑的條件：發(fā)光的量子產(chǎn)率高；它的物理-化學特性要與被標記或測定的物質(zhì)相 匹配；能與抗原或抗體形成穩(wěn)定的偶聯(lián)結(jié)合物； 其化學發(fā)光常是氧化還原反應的結(jié)果；在所使用的濃度范圍內(nèi)對生物體沒有毒性。偶聯(lián)后仍保留高的量子效應和反應動力；應不改變或極少改變被標記物的理化特性， 特別是免疫活性。保證在可見光范圍內(nèi)觀察到發(fā)光酶促反應的發(fā)光劑 經(jīng)酶的降解作用而發(fā)出光的一類發(fā)光劑。HRP的發(fā)光劑魯米諾或其衍生物對-羥基苯乙酸ALP的發(fā)光底物AMPPD4-MUPHRP的發(fā)光劑 1、魯米諾(luminol)或其衍生物pH8.6425nmHRP的發(fā)光劑 2、對-羥基苯乙酸(HPA)HPA+

5、 H2O2 氧化二聚體（熒光物質(zhì)） 450 nm波長熒光 HRP350nm激發(fā)ALP的發(fā)光劑 1、AMPPD（金剛烷）470nm穩(wěn)定不穩(wěn)定ALP的發(fā)光劑 2、4-MUP4-MUP ALP 4-MU 448nm熒光360nm直接化學發(fā)光劑 不需酶的催化作用，只需改變?nèi)芤旱膒H等條件就能發(fā)光的一類發(fā)光劑。吖啶酯（acridinium ester,AE 直接標記 470nm ）電化學發(fā)光劑 通過在電極表面進行電化學反應而發(fā)出光的物質(zhì)。三聯(lián)吡啶釕電化學發(fā)光劑反應原理陽極強還原劑強氧化劑三丙胺三聯(lián)吡啶釕化學發(fā)光劑標記物的制備 化學發(fā)光劑標記物是將化學發(fā)光劑與抗體或抗原結(jié)合在一起的復合物。 標記方法多利用

6、交聯(lián)劑使化學發(fā)光劑與被標記物分子結(jié)構(gòu)中游離的氨基、羧基、硫氫基、羥基等基團形成不可逆連接。碳二亞胺（EDC）縮合法 （蛋白質(zhì)中游離羧基與發(fā)光分子中的氨基形成穩(wěn)定的酰胺鍵）過碘酸鈉氧化法 （標記的糖蛋白穩(wěn)定性好。凡含有芳香伯胺和脂肪伯胺的發(fā)光劑可用此法標記。無糖基的蛋白不適用）重氮鹽偶聯(lián)法（簡易，成本低，重復性好。無芳香伯氨的不適用）N-羥基琥珀酰亞胺活化法 （吖啶酯類多用此法標記）影響標記的因素發(fā)光劑被標記蛋白質(zhì)的性質(zhì) 標記方法原料比 標記率 溫度 純化與保存 純化的結(jié)合物應及時測定蛋白質(zhì)的含量、免疫活性及發(fā)光效率?；瘜W發(fā)光酶免疫分析: 用酶標記抗原或抗體，免疫反應后，酶催化發(fā)光底物，引發(fā)發(fā)光

7、。（直接）化學發(fā)光免疫分析: 化學發(fā)光物質(zhì)直接標記抗原或抗體，免疫反應后引發(fā)化學發(fā)光。 電化學發(fā)光免疫分析： 電化學發(fā)光劑標記抗原或抗體，免疫反應后引發(fā)電化學發(fā)光。第三節(jié) 化學發(fā)光免疫分析技術(shù)的類型化學發(fā)光免疫技術(shù)的分類標記物底物原理檢測信號均相/非均相推出年代堿性磷酸酶金剛烷LEIA光強度非均相19904-MUPLEIA光強度非均相1992辣根過氧化物酶魯米諾LEIA光強度非均相1989吖啶酯無CLIA光強度非均相1990三聯(lián)吡啶釕無ECL電激發(fā)強度非均相1990原理技術(shù)要點 抗原抗體反應 標記物游離部分和結(jié)合部分分離 發(fā)光反應及檢測 方法學評價第三節(jié) 化學發(fā)光免疫分析技術(shù)的類型一、發(fā)光酶免

8、疫分析原理 屬于酶免疫測定的一種。只是最后一步酶反應所用底物為發(fā)光劑，通過發(fā)光反應發(fā)出的光在特定的儀器上進行測定。技術(shù)類型 根據(jù)酶促反應底物不同可分為：熒光酶免疫測定技術(shù) 化學發(fā)光酶免疫測定技術(shù) 根據(jù)免疫學反應模式可分為:雙抗體夾心法雙抗原夾心法固相抗原競爭法原理（ALP標記化學發(fā)光免疫分析示意圖 ）470nm原理（ALP標記化學發(fā)光免疫分析示意圖 ） 洗滌棄上清原理（HRP標記化學發(fā)光免疫分析示意圖 ）技術(shù)要點抗原抗體反應雙抗體夾心法雙抗原夾心法固相抗原競爭法酶標記免疫復合物（B）和游離酶標記物（F）分離磁顆粒分離法微粒子捕獲法包被珠分離法技術(shù)要點酶促發(fā)光反應ALP法標準曲線制作和標本結(jié)果計

9、算試劑校準：標準曲線的發(fā)光量值質(zhì)控品驗證校準曲線的有效性根據(jù)標本的發(fā)光量值自動計算待測物的含量方法學評價靈敏度高酶和發(fā)光兩級放大發(fā)光增強劑影響因素非特異性吸附洗滌不夠徹底可因其他來源的過氧化物酶類物質(zhì)產(chǎn)生非特異性酶發(fā)光反應標本中含影響標記酶活性的物質(zhì)二、化學發(fā)光免疫分析原理（吖啶酯標記化學發(fā)光免疫分析示意圖 ）技術(shù)要點抗原抗體反應雙抗體夾心法雙抗原夾心法間接法競爭法酶標記免疫復合物（B）和游離酶標記物（F）分離磁顆粒分離法技術(shù)要點發(fā)光反應加入氧化劑（H2O2）加pH糾正液（NaOH）使呈堿性吖啶酯分解發(fā)光標準曲線制作和標本結(jié)果計算試劑校準：標準曲線的發(fā)光量值質(zhì)控品驗證校準曲線的有效性根據(jù)標本的

10、發(fā)光量值自動計算待測物的含量方法學評價發(fā)光噪音低，反應簡單、快速直接標記，結(jié)合穩(wěn)定，不影響標記物的生物學活性和理化特性固相磁粉包被面積大，清洗分離簡便、快捷瞬間發(fā)光對檢測儀的靈敏度要求高特定項目試劑檢測試劑含以下組分：a、三聯(lián)吡啶釕標記的抗體b、生物素化合的抗體c、鏈霉親和素（SA）磁性微粒d、三丙胺（TPA）溶液e、洗滌液 三、電化學發(fā)光免疫分析原理： 電化學發(fā)光免疫測定(Electro Chemiluminescence ImmunoAssay，ECLIA）系統(tǒng)試劑步驟一 在孵育杯中加試劑三聯(lián)吡啶釕標記的抗體、生物素化合的抗體及待測標本（含抗原） 反應在液相中進行，37下9分鐘完成步驟二

11、在上述反應液中加入試劑SA磁性微粒 反應在接近液相的條件中進行，37下9分鐘完成步驟三 光子檢測 反應液輸入測量池，由于磁鐵吸引，磁性微粒被吸著在電極上，其余反應物游離在測量池，完成游離的和結(jié)合的標記抗體的分離。TPA溶液送入測量池，將殘余的游離標記抗體排出測量池，在測量池中充滿TPA溶液。電極上通電，三聯(lián)吡啶釕與TPA發(fā)生電化學發(fā)光反應，發(fā)出的光被光電倍增管收集，測定光強度。 最后，終止電壓，移開磁珠，加入清洗液沖洗流動測量室，準備下一個樣品測定。技術(shù)要點抗原抗體反應雙抗體夾心法雙抗原夾心法間接法競爭法酶標記免疫復合物（B）和游離酶標記物（F）分離磁顆粒分離法技術(shù)要點發(fā)光反應加三丙胺的緩沖液

12、，電極加壓，啟動ECL反應標準曲線制作和標本結(jié)果計算試劑校準：標準曲線的發(fā)光量值質(zhì)控品驗證校準曲線的有效性根據(jù)標本的發(fā)光量值自動計算待測物的含量方法學評價持續(xù)時間長，信號強度強，易測定、控制直接標記，結(jié)合穩(wěn)定，不影響標記物的生物學活性和理化特性靈敏度高、線性范圍寬、反應時間短第四節(jié) 化學發(fā)光免疫技術(shù)的應用檢測項目甲狀腺激素: T3、T4、 FT3、FT4、TSH、TGAb、 TPOAb生殖激素：-HCG、FE3、AFP、 PRL、FSH、LH、 PGN、E2、TES腎上腺和垂體激素：ALD、COR、GH、PTH、ACTH貧血因子：VitB12、FOLATE、FER腫瘤標志物：AFP、CEA、P

13、SA、fPSA、CA19-9、 CA12-5、CA15-3、 CA72-4第四節(jié) 化學發(fā)光免疫技術(shù)的應用檢測項目感染性疾?。阂略w、弓形蟲、風疹病毒、巨細胞病毒糖尿?。篒NS、C-P心血管系統(tǒng)：CK、CK-MB、MB、CTNI、BNP、MYO病毒標志物：HBV、HIV、HCV等骨代謝：骨膠原酶、脫氧吡啶啉過敏性疾?。篒gE治療藥物:茶堿、地高辛、環(huán)孢素、巴比妥、苯妥英鈉、 丙戊酸、卡馬西平唐氏綜合征唐氏綜合征是一種新生兒最常見的常染色體異常疾病，發(fā)病率大約為1：800。唐氏篩查 孕早期（7周-14周）：PAPP-A、 游離-HCG 孕中期（14周+1-21周)：AFP、-HCG、FE312孕周

14、16孕周唐氏綜合征風險評估統(tǒng)計的專門算法多項生化標志物檢查母親年齡、準確的孕周頸部半透明厚度（孕早期）對篩查對象的血清檢測結(jié)果和對應孕周的中位值進行比較，以中位值倍數(shù)（MoM）表示PRISCA能夠計算下面多種不同的風險：年齡風險21三體綜合征血清生化標志物風險18三體綜合征血清生化標志物風險頸部半透明厚度血清生化標志物21三體綜合征相結(jié)合的風險神經(jīng)管缺陷風險(必須檢測AFP， AFP只能在孕中期檢測到，孕早期不能計算神經(jīng)管缺陷風險)報告格式及內(nèi)容：1、孕周2、AFP、 FE3、 -HCG（孕中期） 3、游離-HCG、PAPP-A（孕早期）4、18三體風險（孕早期、孕中期）5、21三體風險（孕早

15、期、孕中期）6、神經(jīng)管缺陷風險（孕中期）7、風險評估8、建議高風險孕婦的進一步檢查 唯一的染色體異常產(chǎn)前實驗診斷是通過像羊水穿刺或絨毛取樣（CVS）等侵襲性手段作胎細胞的細胞遺傳（染色體核型分析）檢查。 產(chǎn)前診斷時間 1早孕絨毛采樣檢查宜在孕8周11周進行。 2羊水穿刺檢查宜在孕16周21周進行。 3臍血管穿刺檢查宜在孕18周24周進行。 相對于用藥劑量，血藥濃度與療效間有更好的相關(guān)性血藥濃度監(jiān)測的選擇標準嚴重毒性及相當不明確的臨床最終治療效果陡直的劑量-反應曲線狹窄的治療范圍長期治療威脅生命的疾病藥物動力學上存在明顯的個體差異非線性藥物動力學經(jīng)常服用的藥物可靠的檢測方法血藥濃度監(jiān)測的指征懷疑治療藥物過量治療無效監(jiān)測病人是否依照處方服藥確定藥物的劑量一般藥物監(jiān)測的采血時間： 用