臨床免疫學(xué)檢驗(yàn)：第5章 凝集反應(yīng)和沉淀反應(yīng)

1、第五章 凝集反應(yīng)和沉淀反應(yīng)(Chapter 5 Agglutination And Precipitation Reaction)臨床免疫學(xué)檢驗(yàn)主 要 內(nèi) 容第一節(jié) 凝集反應(yīng)1第二節(jié) 沉淀反應(yīng)2第三節(jié) 凝集反應(yīng)和沉淀反應(yīng)的應(yīng)用3目錄(Section 1 Agglutination Reaction) 凝集反應(yīng)是指細(xì)菌和紅細(xì)胞等顆粒性抗原或表面包被可溶性抗原（或抗體）與相應(yīng)抗體（或抗原）特異性結(jié)合后，一定條件下，形成肉眼可見(jiàn)的凝集現(xiàn)象。第一節(jié) 凝集反應(yīng)第一節(jié) 凝集反應(yīng)一、直接凝集反應(yīng) 在適當(dāng)電解質(zhì)參與下，細(xì)菌、螺旋體和紅細(xì)胞等顆粒性抗原直接與相應(yīng)抗體結(jié)合出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的凝集現(xiàn)象。第一節(jié) 凝集反應(yīng)一

2、、直接凝集反應(yīng)（一）玻片凝集試驗(yàn)第一節(jié) 凝集反應(yīng)一、直接凝集反應(yīng)（二）試管凝集試驗(yàn)第一節(jié) 凝集反應(yīng)二、間接凝集反應(yīng) 將可溶性抗原（或抗體）先吸附于適當(dāng)大小的顆粒性載體（如正常人O型紅細(xì)胞、細(xì)菌、膠乳顆粒等）的表面，然后與相應(yīng)抗體（或抗原）作用，在適宜的電解質(zhì)存在條件下，出現(xiàn)特異性凝集現(xiàn)象。第一節(jié) 凝集反應(yīng)二、間接凝集反應(yīng)（一）正向間接凝集反應(yīng) 用可溶性抗原致敏載體以檢測(cè)標(biāo)本中的待檢抗體。第一節(jié) 凝集反應(yīng)二、間接凝集反應(yīng)（二）反向間接凝集反應(yīng) 用特異性抗體致敏載體以檢測(cè)標(biāo)本中的待檢抗原。第一節(jié) 凝集反應(yīng)二、間接凝集反應(yīng)（三）間接凝集抑制反應(yīng) 用抗原致敏的顆粒載體及相應(yīng)的抗體作為診斷試劑，檢測(cè)標(biāo)本

3、中是否存在與致敏抗原相同的抗原。第一節(jié) 凝集反應(yīng)二、間接凝集反應(yīng)（四）協(xié)同凝集反應(yīng) 以葡萄球菌蛋白A（SPA）做載體的反向間接凝集反應(yīng)。用于細(xì)菌、病毒的直接檢測(cè)。第一節(jié) 凝集反應(yīng)三、間接血凝試驗(yàn) 以紅細(xì)胞作為載體的間接凝集試驗(yàn)。第一節(jié) 凝集反應(yīng)三、間接血凝試驗(yàn)自身紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)可用于抗HIV抗體、HBsAg的檢測(cè)。第一節(jié) 凝集反應(yīng)四、膠乳凝集試驗(yàn)以聚苯乙烯膠乳為載體的間接凝集試驗(yàn)。第一節(jié) 凝集反應(yīng)五、明膠凝集試驗(yàn) 以粉紅色明膠吸附病毒抗原或重組抗原，再與待檢血清作用，出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的粉紅色凝集。常用于抗HIV-1抗體和抗精子抗體檢測(cè)等。第一節(jié) 凝集反應(yīng)六、抗球蛋白試驗(yàn) 是抗球蛋白參與的間接血凝試

4、驗(yàn)，用于檢測(cè)抗紅細(xì)胞不完全抗體。又稱為Coombs試驗(yàn)。直接Coombs試驗(yàn)間接Coombs試驗(yàn)第一節(jié) 凝集反應(yīng)六、抗球蛋白試驗(yàn)（一）直接Coombs試驗(yàn) 常用于檢測(cè)新生兒溶血癥、自身免疫性溶血癥、特發(fā)性自身免疫性貧血和醫(yī)源性溶血等疾病的患者紅細(xì)胞上不完全抗體。第一節(jié) 凝集反應(yīng)六、抗球蛋白試驗(yàn)（二）間接Coombs試驗(yàn) 常用于檢測(cè)母體Rh（D）抗體和因紅細(xì)胞不相容的輸血所產(chǎn)生的血型抗體。第一節(jié) 凝集反應(yīng)特點(diǎn)：1可定性或半定量檢測(cè)；2方法簡(jiǎn)便快速，敏感度高。第二節(jié) 沉淀反應(yīng)(Section 2 Precipitation Reaction) 沉淀反應(yīng)是指可溶性抗原與相應(yīng)抗體(多克隆抗體)在適當(dāng)條

5、件下發(fā)生特異性結(jié)合而出現(xiàn)可見(jiàn)的沉淀現(xiàn)象。 反應(yīng)分兩個(gè)階段：特異性結(jié)合階段和可見(jiàn)階段。后者受抗原抗體比例、分子大小、親合力、絕對(duì)濃度、電解質(zhì)濃度和反應(yīng)溫度的影響。第二節(jié) 沉淀反應(yīng)一、液體內(nèi)沉淀試驗(yàn)（一）環(huán)狀沉淀反應(yīng) 將已知抗血清和待測(cè)抗原反應(yīng)，在液面交界處特異結(jié)合形成白色環(huán)狀沉淀。操作簡(jiǎn)單定性靈敏度低分辨率低第二節(jié) 沉淀反應(yīng)一、液體內(nèi)沉淀試驗(yàn)（二）絮狀沉淀反應(yīng) 是抗原與相應(yīng)抗體特異結(jié)合，在電解質(zhì)存在的條件下，形成肉眼可見(jiàn)的絮狀沉淀物。 受抗原抗體比例的影響非常明顯，常用作測(cè)定抗原抗體的最適比例。有抗原稀釋法、抗體稀釋法和方正滴定法。第二節(jié) 沉淀反應(yīng)一、液體內(nèi)沉淀試驗(yàn)（三）免疫濁度測(cè)定 是應(yīng)用抗原

6、抗體結(jié)合在液體中形成的IC干擾光線可用儀器檢測(cè)的特點(diǎn)，將現(xiàn)代光學(xué)測(cè)量?jī)x器與自動(dòng)分析檢測(cè)系統(tǒng)相結(jié)合應(yīng)用于沉淀反應(yīng)，對(duì)各種液體介質(zhì)中的微量物質(zhì)進(jìn)行定量測(cè)定。第二節(jié) 沉淀反應(yīng)一、液體內(nèi)沉淀試驗(yàn)（三）免疫濁度測(cè)定穩(wěn)定性高精確度高簡(jiǎn)便快速易于自動(dòng)化無(wú)放射性核素污染第二節(jié) 沉淀反應(yīng)一、液體內(nèi)沉淀試驗(yàn)（三）免疫濁度測(cè)定1影響因素（1）抗原抗體的比例海德堡曲線理論第二節(jié) 沉淀反應(yīng)一、液體內(nèi)沉淀試驗(yàn)（三）免疫濁度測(cè)定1影響因素（2）抗體的質(zhì)量特異性強(qiáng)效價(jià)高親合力強(qiáng)使用R型抗體第二節(jié) 沉淀反應(yīng)一、液體內(nèi)沉淀試驗(yàn)（三）免疫濁度測(cè)定1影響因素（3）抗原抗體反應(yīng)的環(huán)境最適PH為6.58.5離子強(qiáng)度大，常用磷酸鹽緩沖液作

7、為反應(yīng)液第二節(jié) 沉淀反應(yīng)一、液體內(nèi)沉淀試驗(yàn)（三）免疫濁度測(cè)定1影響因素（4）增濁劑使用聚乙二醇（PEG）、吐溫-20促進(jìn)IC形成第二節(jié) 沉淀反應(yīng)一、液體內(nèi)沉淀試驗(yàn)（三）免疫濁度測(cè)定2分類（1）根據(jù)抗原抗體反應(yīng)的時(shí)間和反應(yīng)結(jié)合的動(dòng)力學(xué)：速率比濁法終點(diǎn)比濁法第二節(jié) 沉淀反應(yīng)一、液體內(nèi)沉淀試驗(yàn)（三）免疫濁度測(cè)定2分類（2）根據(jù)檢測(cè)儀器的位置及光信號(hào)性質(zhì)：透射免疫比濁法散射免疫比濁法第二節(jié) 沉淀反應(yīng)一、液體內(nèi)沉淀試驗(yàn)（三）免疫濁度測(cè)定2分類（3）免疫膠乳比濁法：以膠乳作為載體對(duì)小分子復(fù)合物進(jìn)行微量測(cè)定，提高了免疫濁度測(cè)定的靈敏度。第二節(jié) 沉淀反應(yīng)二、凝膠內(nèi)沉淀試驗(yàn)（三）免疫濁度測(cè)定 是利用可溶性抗原和

8、相應(yīng)抗體在凝膠內(nèi)擴(kuò)散，形成濃度梯度，在抗原抗體相遇并且濃度比例適當(dāng)?shù)奈恢眯纬扇庋劭梢?jiàn)的沉淀線或沉淀環(huán)。常用凝膠包括：瓊脂、瓊脂糖、聚丙烯酰胺凝膠等。第二節(jié) 沉淀反應(yīng)二、凝膠內(nèi)沉淀試驗(yàn)（一）單向免疫擴(kuò)散試驗(yàn)先將一定量的抗體混于瓊脂凝膠中，使待測(cè)的抗原溶液在瓊脂內(nèi)由局部向周圍自由擴(kuò)散，在一定區(qū)域內(nèi)形成可見(jiàn)的沉淀環(huán)。第二節(jié) 沉淀反應(yīng)二、凝膠內(nèi)沉淀試驗(yàn)（一）單向免疫擴(kuò)散試驗(yàn)第二節(jié) 沉淀反應(yīng)二、凝膠內(nèi)沉淀試驗(yàn)（一）單向免疫擴(kuò)散試驗(yàn)常用于IgG、IgA、IgM、C3、C4等血漿蛋白的測(cè)定。定量測(cè)定（每次測(cè)定須制作標(biāo)準(zhǔn)曲線）重復(fù)性好靈敏度稍差（不能測(cè)定ug/ml以下含量）第二節(jié) 沉淀反應(yīng)二、凝膠內(nèi)沉淀試驗(yàn)（

9、二）雙向免疫擴(kuò)散試驗(yàn) 將抗原和抗體加在同一瓊脂板對(duì)應(yīng)孔中，各自向?qū)Ψ綌U(kuò)散，在濃度比例適當(dāng)處形成沉淀線。第二節(jié) 沉淀反應(yīng)二、凝膠內(nèi)沉淀試驗(yàn)（二）雙向免疫擴(kuò)散試驗(yàn)判斷抗原或抗體的存在以及評(píng)估相對(duì)含量分析抗原或抗體相對(duì)分子量分析抗原的性質(zhì)抗體效價(jià)的滴定鑒定抗原或抗體純度第二節(jié) 沉淀反應(yīng)二、凝膠內(nèi)沉淀試驗(yàn)（二）雙向免疫擴(kuò)散試驗(yàn)定性測(cè)定靈敏度低出現(xiàn)結(jié)果慢第二節(jié) 沉淀反應(yīng)三、免疫電泳技術(shù) 是直流電場(chǎng)作用下的凝膠擴(kuò)散試驗(yàn)，是將抗原抗體反應(yīng)的高度特異性與電泳技術(shù)的高分辨率及快速、微量等特性相結(jié)合的免疫化學(xué)技術(shù)。加快沉淀反應(yīng)的速度；抗原抗體移動(dòng)方向固定集中，提高了靈敏度。第二節(jié) 沉淀反應(yīng)三、免疫電泳技術(shù)（一）對(duì)

10、流免疫電泳 是將雙向免疫擴(kuò)散與電泳相結(jié)合在直流電場(chǎng)中的定向加速的免疫擴(kuò)散技術(shù)。第二節(jié) 沉淀反應(yīng)三、免疫電泳技術(shù)（一）對(duì)流免疫電泳第二節(jié) 沉淀反應(yīng)三、免疫電泳技術(shù)（一）對(duì)流免疫電泳簡(jiǎn)便、快速；靈敏度比雙擴(kuò)高816倍；定性檢測(cè)；常用于抗原或抗體的性質(zhì)、效價(jià)和純度測(cè)定。第二節(jié) 沉淀反應(yīng)三、免疫電泳技術(shù)（二）火箭免疫電泳 是單向免疫擴(kuò)散與電泳相結(jié)合的一項(xiàng)定向加速的單向擴(kuò)散試驗(yàn)。第二節(jié) 沉淀反應(yīng)三、免疫電泳技術(shù)（二）火箭免疫電泳簡(jiǎn)便、快速；可通過(guò)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，定性檢測(cè)；靈敏度不高（ug/ml）；可利用免疫自顯影技術(shù)，提高靈敏度（ng/ml）；常用于IgG、IgA等蛋白定量。第二節(jié) 沉淀反應(yīng)三、免疫電泳技

11、術(shù)（三）免疫電泳 是先將蛋白質(zhì)抗原在凝膠中作區(qū)帶電泳，根據(jù)其所帶電荷、分子量和構(gòu)型不同分成不可見(jiàn)的若干區(qū)帶，然后沿電泳方向挖一與之平行的抗體槽，加入相應(yīng)抗血清，進(jìn)行雙向擴(kuò)散，兩者比例適合處形成弧形沉淀線。通過(guò)對(duì)沉淀線的數(shù)量、位置和形態(tài)與已知標(biāo)準(zhǔn)抗原抗體生成的沉淀線比較，可對(duì)待測(cè)樣品中所含成分的種類和性質(zhì)進(jìn)行分析。第二節(jié) 沉淀反應(yīng)三、免疫電泳技術(shù)（三）免疫電泳第二節(jié) 沉淀反應(yīng)三、免疫電泳技術(shù)（四）免疫固定電泳 先將血清蛋白質(zhì)在瓊脂糖凝膠介質(zhì)上經(jīng)區(qū)帶電泳分離，再將固定劑和各型Ig及輕鏈抗血清加于凝膠表面的泳道上，經(jīng)孵育，固定劑和抗血清在凝膠內(nèi)滲透并擴(kuò)散，抗原抗體直接發(fā)生沉淀反應(yīng)，洗脫游離的抗體，形成IC則保留在凝膠中。經(jīng)氨基黑，參考泳道和抗原抗體沉淀區(qū)帶被染色，根據(jù)電泳移動(dòng)距離分離單克隆組分，可對(duì)各類Ig及其輕鏈進(jìn)行分型。第二節(jié) 沉淀反應(yīng)三、免疫電泳技術(shù)（四）免疫固定電泳第二節(jié) 沉淀反應(yīng)三、免疫電泳技術(shù)（四）免疫固定電泳分辨率高，敏感度高；操作周期短；結(jié)果易分析；常用于鑒定遷移率相近的蛋白和M蛋白、Ig輕鏈，尿液、腦脊液等微量蛋白，游離輕鏈，補(bǔ)體裂解產(chǎn)物等。第二節(jié) 沉淀反應(yīng)三、免疫電泳技術(shù)（五）交叉免疫電泳 是區(qū)帶電泳與火箭免疫電泳結(jié)合的一項(xiàng)