植物組織培養(yǎng)的一些注意事項(xiàng)

1、PAGE PAGE 19植物組織培養(yǎng)的一些注意事項(xiàng)一、常用培養(yǎng)基主要特性1、高鹽成分培養(yǎng)基包括MS、LS、BL、BM、ER 等培養(yǎng)基。其中MS 培養(yǎng)基應(yīng)用最廣泛,其鉀鹽、銨鹽及硝酸鹽含量均較高, 微量元素種類齊全, 其養(yǎng)分?jǐn)?shù)量及比例均比較合適, 廣泛用于植物的器官、花藥、細(xì)胞及原生質(zhì)體的培養(yǎng)。LS、BM、ER 培養(yǎng)基由MS 培養(yǎng)基演變而來。2 、硝硝酸鉀含含量較高高的培養(yǎng)養(yǎng)基包括括B5 、N6 、LH、GS 等培養(yǎng)養(yǎng)基。B5 培養(yǎng)基基B5 培養(yǎng)基基除含有有較高的的鉀鹽外外, 還含含有較低低的銨態(tài)態(tài)氮和較較高的鹽鹽酸硫胺胺素, 較適合合南洋杉杉、葡萄萄及豆科科與十字字花科植植物等的的培養(yǎng)。N6

2、培養(yǎng)基基N6 培養(yǎng)基基( 朱至至清等119755 ) 系我國國學(xué)者創(chuàng)創(chuàng)造, 獲國家家發(fā)明二二等獎(jiǎng), 適用用于單子子葉植物物花藥培培養(yǎng), 柑橘花花藥培養(yǎng)養(yǎng)也適合合, 在楸楸樹、針針葉樹等等的組織織培養(yǎng)中中使用效效果也好好。SH 培養(yǎng)基基是礦鹽鹽濃度較較高的一一種培養(yǎng)養(yǎng)基, 其中銨銨與磷酸酸是由磷磷酸二氫氫銨( NHH4 HH2 PPO4 ) 提提供的, 這種種培養(yǎng)基基適合于于某些單單子葉及及雙子葉葉植物的的培養(yǎng)。3 、中中等無機(jī)機(jī)鹽含量量的培養(yǎng)養(yǎng)基H 培培養(yǎng)基本本培養(yǎng)基基大量元元素約為為MS 培養(yǎng)基基的一半半, 僅磷磷酸二氫氫鉀及氯氯化鈣稍稍低, 微量元元素種類類減少, 而含含量較MMS 為高高

3、, 維生生素種類類比MSS 多。適于花花藥培養(yǎng)養(yǎng)。尼奇培培養(yǎng)基(Niootscch 119699 ) 此培養(yǎng)養(yǎng)基與HH 培養(yǎng)養(yǎng)基成分分基本相相同, 僅生物物素比HH 培養(yǎng)養(yǎng)基高110 倍倍。也適適合于花花藥培養(yǎng)養(yǎng)。米勒培培養(yǎng)基(Milllerr 19963 ) 此此培養(yǎng)基基和Bllayddes(19666) 培養(yǎng)基基二者成成分完全全相同。適合大大豆愈傷傷組織培培養(yǎng)和花花藥等培培養(yǎng)用。4 、低低無機(jī)鹽鹽培養(yǎng)基基大多情情況下用用于生根根培養(yǎng)基基。有以以下幾種種:改良懷懷特培養(yǎng)養(yǎng)基(WWhitte 119633 )WS 培養(yǎng)基基(Woolteer & Skkoogg 19966)克諾普普液( Kno

4、op 119655 ) 花卉培培養(yǎng)上用用得多。貝爾什什勞特液液(Beerthheloot 119344)HB 培養(yǎng)基基( HHollley & BBakeer 119633) 此此培養(yǎng)基基在花卉卉脫毒培培養(yǎng)和木木本植物物的莖尖尖培養(yǎng)中中效果良良好。其其成分是是大量元元素比11/ 22 克諾諾普( Knoop ) 液稍稍多, 微量元元素用貝貝爾什勞勞特液, 每升升培養(yǎng)基基中加00 . 5mll。二、與培培養(yǎng)基有有關(guān)的一一些細(xì)節(jié)節(jié)問題1、培養(yǎng)養(yǎng)基所用用藥品應(yīng)應(yīng)采用等等級較高高的化學(xué)學(xué)純CPP(三級級) 及分分極純AAR(二二級) , 以以免雜質(zhì)質(zhì)對培養(yǎng)養(yǎng)物造成成不利影影響。2、調(diào)節(jié)節(jié)PH也也可用精

5、精密pHH試紙(應(yīng)在干干燥器中中保存, 以免免吸濕而而失效)。培養(yǎng)養(yǎng)基過酸酸的可用用1mool/ L 氫氫氧化鈉鈉( NNaOHH) 來來調(diào)節(jié); 培養(yǎng)養(yǎng)基過堿堿的可用用1mool/ L 鹽鹽酸( HCll ) 來調(diào)節(jié)節(jié)( 11moll/ LL NaaOH 的配制制方法是是稱400gNaaOH, 溶解解后加入入蒸餾水水, 定容容到1 0000ml 即可。1mool/ L HHCl 的配制制方法是是量取112mool/ LHCCl 884mll , 加水定定容至11 0000mll)。經(jīng)經(jīng)高壓蒸蒸汽滅菌菌后, 由于某某些成分分的分解解(如蔗糖糖的分解解) 或氧氧化, 酸度會(huì)會(huì)增加( pHH 值一一

6、般可降降低0 . 22 )。有時(shí)玻玻璃器皿皿質(zhì)量較較差, 其中一一部分物物質(zhì)溶解解, 也會(huì)會(huì)影響酸酸度的變變化。這這些在調(diào)調(diào)整pHH 值時(shí)時(shí)都要考考慮進(jìn)去去。分裝裝后應(yīng)立立即滅菌菌, 若因因故不能能及時(shí)滅滅菌, 最好放放入冰箱箱中在224h 內(nèi)完成成滅菌工工作。滅滅菌時(shí)壓壓力表讀讀數(shù)為00 . 8kgg/ ccm2 1 . 1kkg/ cm22 , 1211時(shí)保持持15mmin20mmin 即可。3、某些些生長調(diào)調(diào)節(jié)物質(zhì)質(zhì), 如吲吲哚乙酸酸、玉米米素及某某些維生生素等物物質(zhì)遇熱熱不穩(wěn)定定, 因此此不能進(jìn)進(jìn)行高壓壓滅菌, 而需需用過濾濾方法滅滅菌, 經(jīng)過過濾滅菌菌的溶液液, 可在在瓊脂培培養(yǎng)基溫

7、溫度下降降到大約約40時(shí)加入入到已高高壓滅菌菌的培養(yǎng)養(yǎng)基中。4、配好好的培養(yǎng)養(yǎng)基可放放到培養(yǎng)養(yǎng)室中預(yù)預(yù)培養(yǎng)33d ,若沒有有污染反反應(yīng), 則證明明是可靠靠的, 可以使使用。暫暫時(shí)不用用的培養(yǎng)養(yǎng)基最好好置于110下保存存, 含有有生長調(diào)調(diào)節(jié)物質(zhì)質(zhì)的培養(yǎng)養(yǎng)基在445低溫下下保存則則更理想想。含吲吲哚乙酸酸或赤霉霉素的培培養(yǎng)基應(yīng)應(yīng)在配制制一周內(nèi)內(nèi)用完, 其他他培養(yǎng)基基至多也也不能超超過一個(gè)個(gè)月。一一般情況況下, 兩周內(nèi)內(nèi)應(yīng)用完完, 以免免干燥變質(zhì)。三、培養(yǎng)養(yǎng)材料及及消毒1、取材材季節(jié)的的影響：大多數(shù)數(shù)植物應(yīng)應(yīng)在其生生長開始始的季節(jié)節(jié)采樣, 生長長末期或或已進(jìn)入入休眠期期, 則外外植體對對誘導(dǎo)反反應(yīng)遲

8、鈍鈍或無反反應(yīng)。2、器官官的生理理狀態(tài)和和發(fā)育年年齡：沿沿植物的的主軸, 越向向上的部部分所形形成的器器官其生生長的時(shí)時(shí)間越短短, 其生生理年齡齡也越老老, 越接接近發(fā)育育上的成成熟, 越易形形成花器器官。反反之, 越向下下, 其生生理年齡齡越小。木本植植物的組組織培養(yǎng)養(yǎng)中, 以幼齡齡樹的春春梢嫩枝枝段或基基部的萌萌條較好好, 下胚胚軸與具具有3 對4 對真葉葉的嫩莖莖段, 生長效效果也較較好 。一般情情況下, 幼年年組織比比老年組組織具有有較高的的形態(tài)發(fā)發(fā)生能力力。3、材料料大小的的影響：材料越越小成活活率越低低, 莖尖尖培養(yǎng)存存活的臨臨界大小小應(yīng)為一一個(gè)莖尖尖分生組組織帶11 個(gè)2 個(gè)葉葉

9、原基, 約0 .2mmm0 .3mmm 大小小。葉片片、花瓣瓣等約為為5mmm2 , 莖段則則長約00 .55mm。因此, 除非非用于去去除病毒毒否則不不宜將外外植體切切的過小小。但并并不是說說外植體體越大越越好, 外植體體過大易易造成污污染, 有實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證明外外植體越越大污染染率越高高。4、材料料的滅菌菌：一般般是組織織越大越越易污染染, 夏季季比冬季季帶菌多多，甚至至不同年年份污染染的情況況也有區(qū)區(qū)別。取取材最好好選在中中午或下下午, 避開陰陰雨天取取材可減減少污染染率。消消毒是為為了消滅滅病菌, 以保保證無菌菌組織培培養(yǎng)的進(jìn)進(jìn)行。但但不同植植物及一一株植物物不同部部位的組組織, 其帶菌菌程

10、度不不同, 它們對對不同種種類、不不同濃度度的消毒毒劑的敏敏感度也也不一樣樣。最初初所使用用的消毒毒劑種類類, 濃度度及消毒毒時(shí)間的的長短都都要進(jìn)行行摸索, 以達(dá)達(dá)到最佳佳的消毒毒效果。材料有絨絨毛最好好在消毒毒液中加加入幾滴滴吐溫- 800 ,對對與難消消毒的根根及地下下部位材材料 可可將其浸浸入消毒毒液中進(jìn)進(jìn)行抽氣氣減壓, 以幫幫助消毒毒液的滲滲入, 從而達(dá)到到徹底滅滅菌的目目的。潘潘學(xué)峰等等( 119988) 報(bào)報(bào)道, 12% 的雙雙氧水+ 0 .1%的升汞汞混合液液對南方方地下莖莖生姜滅滅菌100minn 的效效果最好好。四、材料料的接種種1、接種種室的消消毒：植植物組織織培養(yǎng)技技術(shù)實(shí)

11、際際上是一一種無菌菌操作和和無菌培培養(yǎng)技術(shù)術(shù), 做好好接種室室的消毒毒是至關(guān)關(guān)重要的的。污染染的主要要來源是是空氣中中的細(xì)菌菌和真菌菌孢子, 因此此, 每次次接種前前應(yīng)進(jìn)行行地面的的清潔衛(wèi)衛(wèi)生工作作, 并用用70%酒精噴噴霧使空空氣的灰灰塵沉降降, 并用用紫外線線燈照射射20mmin。接種種前超凈凈工作臺臺面要用用新潔爾爾滅或酒酒精擦洗洗,并定期期清洗過過濾膜, 以延延長使用用壽命。2、無菌菌操作要要求：工工作人員員使用的的工作服服、帽子子、口罩罩等, 要經(jīng)常常保持干干凈, 并定期期進(jìn)行消消毒, 即將洗洗凈、晾晾干的衣衣帽、口口罩等用用紙包好好后與培培養(yǎng)基一一起進(jìn)行行高壓滅滅菌。工工作人員員的

12、頭發(fā)發(fā)、衣服服、手指指中都帶帶有許多多雜菌, 為此此要穿上上工作服服, 戴上上帽子, 也必必須剪除除指甲, 并用用肥皂擦擦洗, 最好再再在新潔潔爾滅溶溶液中浸浸泡100min , 接接種操作作前則用用70%酒精擦擦洗。工工作人員員的呼吸吸所產(chǎn)生生的污染染, 主要要是在接種時(shí)時(shí)談話或或咳嗽所所引起的的, 因此此, 在操操作時(shí)應(yīng)應(yīng)禁止談?wù)勗挷?yīng)應(yīng)戴上口口罩。3、材料料的分離離、切取和和接種切割動(dòng)作作要快, 防止止擠壓使使材料受受損傷而而招致培培養(yǎng)失敗敗, 也要要避免使使用生銹銹的刀片片, 以防防止氧化化現(xiàn)象產(chǎn)產(chǎn)生。接接種時(shí)要要防止交交叉污染染的發(fā)生生,刀和鑷鑷子等接接種工具具使用一一次應(yīng)放放入70

13、0% ( 或95%)酒精精中浸泡泡, 然后后灼燒放放涼備用用。接種時(shí)輕輕輕取下下封口紙紙, 動(dòng)作作要慢以以免氣流流沖入瓶瓶中造成成污染。將瓶口口靠近酒酒精燈火火焰, 瓶口傾傾斜, 以免空空氣中的的微生物物落入瓶瓶中,將瓶口口外部在在燈焰上上燎數(shù)秒秒鐘, 將灰塵塵雜物等等固定在在原處, 然后后用鑷子子將外植植體送入入瓶中, 材料料在培養(yǎng)養(yǎng)容器內(nèi)內(nèi)的分布布要均勻勻, 以保保證必要要的營養(yǎng)養(yǎng)面積和和光照條條件。莖莖尖、莖莖段等基基部插入入固體培培養(yǎng)基中中, 葉片片通常將將葉背接接觸培養(yǎng)養(yǎng)基, 這是由由于葉背背氣孔多多, 利于于吸收水水分和養(yǎng)養(yǎng)分的緣緣故。五、材料料的初代代培養(yǎng)1、實(shí)驗(yàn)驗(yàn)方案的的設(shè)計(jì)1

14、）、單單因子實(shí)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)計(jì)：單因因子實(shí)驗(yàn)驗(yàn)是組織織培養(yǎng)中中最常用用的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)方法, 尤其其在選擇擇適當(dāng)?shù)牡募に胤N種類和濃濃度配比比上使用用最多。2 ）、正交實(shí)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)計(jì)植物離離體培養(yǎng)養(yǎng)的成功功是由多多種因素素決定的的。正交交設(shè)計(jì)是是多因素素分析的的有力工工具, 它可以以很方便便的從眾眾多因素素中選出出主要影影響因素素及最佳佳水平, 因?yàn)闉樗梢砸杂幂^少少的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)次數(shù)得得到較多多的信息息。例如如, 一個(gè)個(gè)7 因素素水平的的實(shí)驗(yàn), 若將將各因素素水平全全部組合合都做一一遍, 需要27 = 1288 次, 而正正交設(shè)計(jì)計(jì)只需做做8 次實(shí)實(shí)驗(yàn)就可可以了, 雖然然實(shí)驗(yàn)次次數(shù)減少少了, 但因?yàn)闉楦饕蛩厮厮酱?/p>

15、搭配均勻勻, 88 次實(shí)實(shí)驗(yàn)基本本代表了了全部實(shí)實(shí)驗(yàn)的情情況。正交實(shí)驗(yàn)驗(yàn)的設(shè)計(jì)計(jì), 主要要工具是是正交表表。大多多數(shù)生物物統(tǒng)計(jì)學(xué)學(xué)書都列列出了可可供選擇擇的正交交表,如L4 ( 23 ) , LL8 (227 )見(表2 - 111 , 表2 - 122) 。字母LL 右下下角號碼碼8 表示示它有88 個(gè)實(shí)實(shí)驗(yàn)要做做, 括號號內(nèi)的指指數(shù)7 表示這這張表所所安排的的實(shí)驗(yàn)最最多可考考察7 個(gè)因素素(也可安安排2 個(gè)6 個(gè), 超過過7 個(gè)要要選擇其其他正交交表) , 底底數(shù)2 表示被被考察的的因素只只要求兩兩個(gè)水平平。在進(jìn)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)前可根根據(jù)要測測試因素素的多少少及每種種因素所所考察的的水平, 選擇

16、擇適合的的正交表表, 然后后按表進(jìn)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)?，F(xiàn)舉舉一個(gè)例例子來說說明, 設(shè)影響響某種植植物試管管苗生長長的因素素有光照照時(shí)間、光照強(qiáng)強(qiáng)度、ppH 值值、溫度度、蔗糖糖濃度、BA濃度度、NAAA 濃濃度7 個(gè)因素素, 每個(gè)個(gè)因素選選擇兩個(gè)個(gè)水平, 即, 光照照時(shí)間( 100h , 144h )、光照照強(qiáng)度(10000lxx , 20000lxx )、pH 值( 55 . 5 , 5 . 88 )、溫度( 200, 225) 、BA 濃度( 0 . 5 , 22 . 0 )、NAAA 濃度度( 00 . 5 ,1 . 0)、蔗糖糖濃度(2% , 44%)?，F(xiàn)根據(jù)據(jù)因素和和水平的的多少選選擇一個(gè)個(gè)

17、適合本本實(shí)驗(yàn)的的正交表表, 選L8 (227)最理想想, 填表表時(shí), 因素水水平對號號入座, 見表表( 22 - 13 )。第第一號實(shí)實(shí)驗(yàn)是光光照時(shí)間間10hh/ dd、光照照強(qiáng)度110000lx、pH 值5 . 5、BA 濃度2 . 00、NAAA 濃度度0 . 5、蔗糖濃濃度4% , 其他實(shí)實(shí)驗(yàn)依次次類推。根據(jù)88 個(gè)實(shí)實(shí)驗(yàn)結(jié)果果, 如出出苗數(shù)量量、苗高高、生根根數(shù)、移移栽成活活率等, 綜合合考慮, 根據(jù)據(jù)需要選選取各最最適培養(yǎng)養(yǎng)條件。也可通通過一定定的計(jì)算算方法(參考統(tǒng)統(tǒng)計(jì)學(xué)書書) , 算出出極差( R) , 極差(RR) 表表示每個(gè)個(gè)因素在在實(shí)驗(yàn)中中所起作作用的大大小, R 越越大表示

18、示該因素素的不同同水平對對實(shí)驗(yàn)結(jié)結(jié)果的影影響越大大, 但若若沒有可可計(jì)算的的指標(biāo)時(shí)時(shí), 還是是選擇單單因子實(shí)實(shí)驗(yàn)較好好。初代培養(yǎng)養(yǎng)物的建建立1）、保保證無菌菌2）、條條件合適適：首先先, 一一定要選選擇好合合適的作作物種類類、品種種及培養(yǎng)養(yǎng)的部位位; 其其次,一一定要選選擇合適適的培養(yǎng)養(yǎng)基, 激素及及其他添添加物; 還要要注意掌掌握適宜宜的環(huán)境境條件。所以在在進(jìn)行一一種植物物的組織織培養(yǎng)之之前, 應(yīng)查找找該種植植物有關(guān)關(guān)方面的的資料, 根據(jù)據(jù)這種植植物過去去所采用用的培養(yǎng)養(yǎng)部位、培養(yǎng)基基、培養(yǎng)養(yǎng)條件和和培養(yǎng)技技術(shù)等, 再?zèng)Q決定自己己的工作作步驟。3）、操操作技術(shù)術(shù)過關(guān)3、污染染的防治治1）、植

19、植物材料料的選擇擇及防止止污染通常多年年生的木木本材料料比一二二年生的的草本材材料帶菌菌多; 老的材材料比幼幼嫩的材材料帶菌菌多; 田間生生長的材材料比溫溫室生長長的材料料帶菌多多; 帶帶泥土的的材料比比不帶泥泥土的材材料帶菌菌多。為為此對于于培養(yǎng)材材料的取取材就應(yīng)應(yīng)很認(rèn)真真地加以以選擇, 以減減少污染染的發(fā)生生。用莖尖作作外植體體時(shí), 應(yīng)在室室內(nèi)或無無菌條件件下對枝枝條進(jìn)行行預(yù)培養(yǎng)養(yǎng)。將枝枝條用水水沖洗干干凈后插插入無糖糖的營養(yǎng)養(yǎng)液或自自來水中中, 使使其發(fā)枝枝, 然然后以這這種新抽抽的嫩枝枝條作為為外植體體, 便便可大大大減少材材料的污污染?；蚧蛟跓o菌菌條件下下對采自自田間的的枝條進(jìn)進(jìn)行暗

20、培培養(yǎng), 待抽出出徒長的的黃化枝枝條時(shí)取取材, 也可明明顯地減減少污染染。對木本植植物等難難以消毒毒的材料料可采用用多次滅滅菌法。如將切切好的外外植體放放入1 . 33%次氯氯酸鹽溶溶液中(商品漂漂白粉225%的的溶液)消毒330miin , 然后后用無菌菌水沖洗洗3 次次, 再再放在無無菌條件件下,次次日用22 . 6%次次氯酸鈉鈉滅菌330miin , 然后后用無菌菌水沖洗洗3 次次。也可可采用多多種藥液液多次浸浸泡法,以加強(qiáng)強(qiáng)滅菌效效果。材料內(nèi)部部易感染染病菌, 在這這種情況況下, 必須在在培養(yǎng)基基中加入入抗生素素類, 防止初初代培養(yǎng)養(yǎng)物污染染。、人為污污染的防防止接種前應(yīng)應(yīng)用肥皂皂將手

21、仔仔細(xì)洗凈凈后, 再用770%酒酒精擦洗洗雙手, 并需需及時(shí)剪剪除指甲甲。在工工作中特特別要注注意避免免交叉感感染, 雙手必必須清潔潔, 工工具則用用一次即即需消毒毒一次。工作人人員呼吸吸所產(chǎn)生生的污染染, 主主要是接接種時(shí)說說話或咳咳嗽所引引起的, 因此此, 操操作時(shí)嚴(yán)嚴(yán)禁談話話, 并并應(yīng)戴上上口罩, 也應(yīng)應(yīng)穿工作作服, 戴工作作帽。污染中特特別注意意一種呈呈乳白色色的細(xì)菌菌污染, 這種種細(xì)胞為為芽孢桿桿菌。法法國林木木育種協(xié)協(xié)會(huì)鑒定定為遲緩緩芽孢桿桿菌( Baccilllus lennluss) , 它外外被莢膜膜, 耐耐高溫, 一般般消毒劑劑難以殺殺死。它它可隨培培養(yǎng)材料料、用具具等傳播

22、播; 它它可出現(xiàn)現(xiàn)在培養(yǎng)養(yǎng)基表面面, 或或呈滴形形云霧狀狀存在于于培養(yǎng)基基內(nèi)。若若出現(xiàn)應(yīng)應(yīng)嚴(yán)格滅滅菌, 清洗用用具, 更換消消毒酒精精。4、防止止外植體體褐變1）、褐褐變的影影響因素素褐變是由由于組織織中的多多酚氧化化酶被激激活, 使細(xì)胞胞的代謝謝發(fā)生變變化, 酚類物物質(zhì)被氧氧化后產(chǎn)產(chǎn)生醌類類物質(zhì), 這類類物質(zhì)呈呈棕褐色色, 它它們會(huì)逐逐漸擴(kuò)散散到培養(yǎng)養(yǎng)基中, 抑制制其他酶酶的活性性, 毒毒害培養(yǎng)養(yǎng)的材料料。褐變變的影響響因素是是復(fù)雜的的, 隨隨植物種種類、基基因型、外植體體的部位位及生理理狀況等等的不同同而危害害的程度度也有區(qū)區(qū)別。材料本身身的生理理狀態(tài)不不同, 接種后后褐變的的程度也也不同

23、。如在歐歐洲栗的的培養(yǎng)中中, 用用幼年型型的材料料培養(yǎng)含含醌類物物質(zhì)少, 而用用成年型型材料培培養(yǎng)時(shí)含含醌類物物質(zhì)多。而在卡卡德利亞亞蘭的培培養(yǎng)中, 較短短的新生生莖致褐褐物質(zhì)含含量高, 而較較長的新新生莖致致褐物質(zhì)質(zhì)含量低低, 另另外致褐褐物質(zhì)的的含量也也因季節(jié)節(jié)的不同同而不同同, 冬冬季褐變變少, 夏秋季季褐變最最嚴(yán)重, 存活活率最低低。在枝枝條上取取芽的時(shí)時(shí)期及所所取部位位不同也也有區(qū)別別, 如如歐洲栗栗取1 月后半半月的芽芽培養(yǎng)則則醌的形形成少, 而在在5 月月6 月取芽芽培養(yǎng)則則醌類物物質(zhì)發(fā)生生嚴(yán)重。在第一一至第四四個(gè)芽的的生長期期單寧類類物質(zhì)合合成多, 因此此, 接接種后褐褐變也嚴(yán)

24、嚴(yán)重。油油棕用幼幼嫩外植植體( 如胚)培養(yǎng)較較少褐變變, 而而用高度度分化的的葉片接接種后則則容易褐褐變?？偪傊? 分生部部位接種種后形成成的醌類類物質(zhì)少少, 而而分化的的部位則則形成的的醌類物物質(zhì)較多多。培養(yǎng)基成成分過高高的無機(jī)機(jī)鹽濃度度會(huì)引起起棕櫚科科植物外外植體酚酚的氧化化。例如如油棕用用MS無無機(jī)鹽培培養(yǎng)基容容易引起起外植體體的褐變變, 而而用降低低了無機(jī)機(jī)鹽濃度度的改良良MS 培養(yǎng)基基時(shí)則可可減輕褐褐變, 而且可可獲得愈愈傷組織織和胚狀狀體。激激素使用用不當(dāng)時(shí)時(shí), 材材料也容容易褐變變。細(xì)胞胞分裂素素6 - 芐基基氨基嘌嘌呤或激激動(dòng)素有有刺激多多酚氧化化酶活性性提高的的作用, 這在在

25、甘蔗的的組織培培養(yǎng)中表表現(xiàn)十分分明顯。在外植植體最適適宜的脫脫分化條條件下, 分生生能力強(qiáng)強(qiáng)的細(xì)胞胞大量增增殖, 酚類的的氧化會(huì)會(huì)受到抑抑制。在在芽旺盛盛增殖時(shí)時(shí), 褐褐變也被被抑制。此外, 培養(yǎng)養(yǎng)條件不不適宜, 如溫溫度過高高或光照照過強(qiáng), 均可可使多酚酚氧化酶酶的活性性提高, 從而而加速被被培養(yǎng)組組織的褐褐變。培養(yǎng)時(shí)間間過長接接種后材材料培養(yǎng)養(yǎng)時(shí)間過過長, 未及時(shí)時(shí)轉(zhuǎn)移, 也會(huì)會(huì)引起材材料的褐褐變, 甚至導(dǎo)導(dǎo)致全部部死亡, 這在在培養(yǎng)過過程中是是經(jīng)常可可見的。、褐變的的防止選擇適當(dāng)當(dāng)?shù)耐庵仓搀w和培培養(yǎng)條件件： 選選擇適當(dāng)當(dāng)?shù)耐庵仓搀w和培培養(yǎng)條件件是克服服褐變的的最主要要的手段段。外植植體應(yīng)

26、有有較強(qiáng)的的分生能能力, 在最適適宜的細(xì)細(xì)胞脫分分化和再再分化的的培養(yǎng)條條件下, 使外外植體處處于旺盛盛的生長長狀態(tài), 便可可大大減減輕褐變變。抗氧化劑劑的作用用：在培培養(yǎng)基中中加入抗抗壞血酸酸、聚乙乙烯吡咯咯烷酮( PVVP)、半胱氨氨酸等抗抗氧化劑劑, 或或用抗氧氧化劑進(jìn)進(jìn)行材料料的預(yù)處處理或預(yù)預(yù)培養(yǎng), 可減減輕醌類類物質(zhì)的的毒害。連續(xù)轉(zhuǎn)移移：對于于易褐變變的材料料, 進(jìn)進(jìn)行連續(xù)續(xù)轉(zhuǎn)移, 可以以減輕醌醌類物質(zhì)質(zhì)對培養(yǎng)養(yǎng)物的毒毒害作用用。試管苗的的增殖與與繼代培培養(yǎng)（一）、加快試試管苗的的繁殖速速度1、試管管苗繁殖殖類型試管繁殖殖類型共共有五種種：微型型扦插型型、叢生生芽增殖殖型、器器官發(fā)生

27、生型、胚胚狀體發(fā)發(fā)生型、原球莖莖發(fā)生型型，一定定要注意意其遺傳傳穩(wěn)定性性, 前前三種途途徑一般般能保持持遺傳穩(wěn)穩(wěn)定性。2、試管管繁殖速速率及計(jì)計(jì)算統(tǒng)計(jì)試管管苗增殖殖速度, 有以以苗為單單位, 也有以以芽或未未生根的的小莖作作單位的的, 以以原球莖莖球狀體體或胚狀狀體因難難以統(tǒng)計(jì)計(jì), 則則以瓶為為單位。大多數(shù)數(shù)以芽和和苗作單單位。試管苗理理論上一一年能繁繁殖多少少, 可可用下面面的簡單單公式計(jì)計(jì)算:Y = mXnnY = 年繁殖殖數(shù)m = 無菌母母株苗數(shù)數(shù)X = 每個(gè)培培養(yǎng)周期期增殖的的倍數(shù)n = 全年可可增殖的的周期次次數(shù)例如月季季每5 周轉(zhuǎn)接接一次, 甲品品種每次次增殖33 倍, 乙品品種每

28、次次增殖55 倍, 丙品品種每次次增殖77 倍, 假定定一開始始都是一一個(gè)芽, 那么么這三個(gè)個(gè)品種一一年能繁繁殖多少少呢? 根據(jù)公公式可知知:n =3365dd/355d= 10 .4 , 即即每年可可轉(zhuǎn)接110 次次, 那那么這三三個(gè)品種種年繁殖殖率分別別計(jì)算如如下:甲品種YY = 131 0 = 599 0000 = 5 .91044乙品種YY = 151 0 = 9 7600 0000 = 9 .7661066丙品種YY = 171 0 = 2882 0000 0000 = 2 .821088從上可知知甲品種種每5 周轉(zhuǎn)接接一次, 一年年可繁殖殖出5 萬多苗苗, 乙乙品種每每周期增增殖5

29、 倍, 一年可可得9000 多多萬苗, 而丙丙品種每每周期增增殖7 倍, 一年可可繁殖出出2 億億苗來。不過實(shí)際際值遠(yuǎn)比比理論值值為低。因?yàn)閷?shí)實(shí)踐中要要受到多多種因素素制約, 困難難很多。但理論論計(jì)算可可以作為為一個(gè)計(jì)計(jì)算產(chǎn)量量的指標(biāo)標(biāo), 提提供參考考, 有有它的積積極意義義。3、提高高繁殖速速度的方方法不僅試管管苗的繁繁殖類型型不同, 而且且在試管管內(nèi)又受受到基因因型、外外植體來來源、年年齡、部部位、培培養(yǎng)基種種類、附附加成分分和培養(yǎng)養(yǎng)環(huán)境等等多種因因素的影影響, 應(yīng)通過過具體試試驗(yàn)來摸摸索每種種植物最最快最好好的繁殖殖方法。1）、改改進(jìn)培養(yǎng)養(yǎng)基：、不同的的植物材材料需要要使用不不同類型型的

30、培養(yǎng)養(yǎng)基。、糖具有有維持培培養(yǎng)基滲滲透壓的的作用，在培養(yǎng)養(yǎng)過程中中植物組組織不斷斷地從培培養(yǎng)基中中吸收糖糖，糖濃濃度降低低，當(dāng)糖糖濃度不不能維持持正常滲滲透壓時(shí)時(shí)，材料料要轉(zhuǎn)移移到新鮮鮮培養(yǎng)基基。培養(yǎng)養(yǎng)基中的的維生素素絕大部部分為BB族維生生素，它它們一各各種輔酶酶的形式式參與植植物代謝謝活動(dòng)，影響形形態(tài)發(fā)生生、分化化及試管管苗的生生長，為為防植物物缺乏，一般均均加入。、植物生生長調(diào)節(jié)節(jié)物質(zhì)在在試管苗苗增殖中中期決定定性作用用促進(jìn)葉芽芽形成和和生長的的激素：細(xì)胞分分裂素抑抑制了植植物的頂頂端優(yōu)勢勢，使得得葉芽不不斷分化化和生長長，逐漸漸形成芽芽叢，并并促進(jìn)芽芽叢生長長。大多多植物最最適用量量為

31、1.02.00，一般般用量00.110.0。應(yīng)應(yīng)用最多多的是66-BAA,其次次KT和和2ipp，ZTT用的較較少，因因它的價(jià)價(jià)格太貴貴。對于于微型扦扦插型繁繁殖可不不加細(xì)胞胞分裂素素或加00.1以以下也可可。除了了細(xì)胞分分裂素以以外，還還可加入入低濃度度的生長長素，以以促進(jìn)葉葉芽的生生長，但但要防止止愈傷組組織化。常用的的有NAAA,IIBA,IAAA，濃度度在0.11.00。在實(shí)際操操作中高高濃度細(xì)細(xì)胞分裂裂素和低低濃度生生長素的的配比，既能提提高腋芽芽的增殖殖速度，也能保保證腋芽芽健壯生生長。如如果細(xì)胞胞分裂素素濃度過過高生長長素濃度度過低，會(huì)形成成過于細(xì)細(xì)密的嫩嫩芽，雖雖然提高高了增殖

32、殖速度，但苗多多而弱，降低了了芽的質(zhì)質(zhì)量。但但如果細(xì)細(xì)胞分裂裂素過低低，生長長素過高高，影響響芽的增增殖速度度，甚至至有時(shí)沒沒有側(cè)芽芽產(chǎn)生。B、誘導(dǎo)導(dǎo)不定芽芽形成和和生長的的激素：除現(xiàn)有有的芽之之外, 任何器器官上的的, 通通過器官官發(fā)生重重新形成成的芽稱稱為不定定芽。促促進(jìn)外植植體形成成不定芽芽, 要要使用一一定量的的細(xì)胞分分裂素和和生長素素, 一一般濃度度不能過過高。否否則不但但使器官官分化能能力降低低, 而而且也使使遺傳性性難以穩(wěn)穩(wěn)定。誘導(dǎo)外植植體形成成不定芽芽時(shí), 一般使使用細(xì)胞胞分裂素素的濃度度高于生生長素濃濃度的配配比, 但也經(jīng)經(jīng)常采用用細(xì)胞分分裂素和和生長素素濃度的的比值接接近于

33、11 的配配比。C、促進(jìn)進(jìn)胚狀體體的形成成和繁殖殖的激素素：胚狀狀體途徑徑的優(yōu)點(diǎn)點(diǎn)是增殖殖率高, 而且且同時(shí)具具有胚根根和胚芽芽, 可可免去生生根?，F(xiàn)現(xiàn)在胚狀狀體發(fā)生生還不普普遍或產(chǎn)產(chǎn)生的胚胚狀體難難以成株株或成株株率太低低, 以以及遺傳傳性尚不不穩(wěn)定, 故僅僅在有限限植物中中應(yīng)用。一般是是在含有有豐富還還原氮的的培養(yǎng)基基上, 加有生生長素, 特別別是2 , 44 - D 以以誘導(dǎo)胚胚狀體的的發(fā)生, 然后后轉(zhuǎn)移到到降低濃濃度或沒沒有生長長素的培培養(yǎng)基上上使其成成熟、萌萌發(fā)和生生長。培養(yǎng)基中中, 還還可加入入其他附附加成分分, 如如氨基酸酸、水解解乳蛋白白( LLH ) 3000mgg/ LL5

34、000mgg/ LL、水解解酪蛋白白(CHH) 2200mmg/ L5500mmg/ L, 以及腺腺嘌呤(ADEE) 11mg/ L80mmg/ L 等等, 以以促進(jìn)試試管苗的的生長。、改善培培養(yǎng)條件件:試管管苗增殖殖與培養(yǎng)養(yǎng)條件如如溫度、光照、濕度、培養(yǎng)器器皿和培培養(yǎng)基的的pH值值密切相相關(guān), 需要進(jìn)進(jìn)行控制制, 以以促進(jìn)繁繁殖。保持試管管苗的繼繼代培養(yǎng)養(yǎng)試管苗的的繼代方方法、液體培培養(yǎng)、固體培培養(yǎng)影響試管管苗繼代代培養(yǎng)的的因素及及解決措措施、馴化現(xiàn)現(xiàn)象：有有些植物物在開始始的繼代代培養(yǎng)中中需要添添加生長長調(diào)節(jié)物物質(zhì), 其后加加入少量量或不必必加入生生長調(diào)節(jié)節(jié)物質(zhì)就就可以生生長, 此現(xiàn)象象就

35、叫做做“ 馴化化”。、在長期期的繼代代培養(yǎng)中中, 材材料自身身內(nèi)部要要發(fā)生一一系列的的生理變變化, 除了前前面講的的“ 馴化化”現(xiàn)象外外, 還還會(huì)出現(xiàn)現(xiàn)形態(tài)發(fā)發(fā)生能力力的喪失失。一般認(rèn)為為分化能能力衰退退主要有有三個(gè)因因素:愈傷組織織中含有有從外植植體啟動(dòng)動(dòng)分裂時(shí)時(shí)就包括括進(jìn)來的的成器官官中心（分生組組織），當(dāng)重復(fù)復(fù)繼代則則會(huì)逐漸漸減少或或喪失，這意味味著不能能形成維維管束，只能保保持無組組織的細(xì)細(xì)胞團(tuán)。形態(tài)發(fā)生生能力的的減弱和和喪失也也可能與與內(nèi)源生生長物質(zhì)質(zhì)的減少少或喪失失有關(guān)。也可能是是細(xì)胞染染色體出出現(xiàn)畸變變，數(shù)目目增加或或丟失。影響繼代代培養(yǎng)的的其他因因素、植物材材料的影影響 不同種

36、種類植物物，同種種植物不不同品種種，同一一植物不不同器官官或不同同部位繼繼代繁殖殖能力也也不相同同。一般般是草本本木本本；被子子植物裸子植植物；年年幼植物物老年年植物；剛分離離植物已繼代代植物；胚營營養(yǎng)體植植物；芽芽胚狀狀體愈愈傷組織織。、培養(yǎng)基基及培養(yǎng)養(yǎng)條件 培養(yǎng)養(yǎng)基及培培養(yǎng)條件件適當(dāng)與與否對能能否繼代代培養(yǎng)影影響頗大大，故常常改變培培養(yǎng)基和和培養(yǎng)條條件來保保持繼代代培養(yǎng)。、繼代培培養(yǎng)時(shí)間間長短 關(guān)于于繼代培培養(yǎng)次數(shù)數(shù)對繁殖殖率的影影響的報(bào)報(bào)道不一一。有的的材料長長期繼代代可保持持原來的的再生能能力；有有的經(jīng)過過一定時(shí)時(shí)間繼代代后才有有分化再再生能力力；而有有的隨繼繼代時(shí)間間加長而而分化再再

37、生能力力降低。、季節(jié)的的影響 植物物材料能能否繼代代與季節(jié)節(jié)有關(guān)。一般能達(dá)達(dá)到每月月繼代3310倍倍，即可可用于大大量繁殖殖，盲目目追求過過高增殖殖倍數(shù)一一是所產(chǎn)產(chǎn)小苗小小而弱，給生根根、移栽栽帶來很很大困難難，二是是會(huì)引起起遺傳性性不穩(wěn)定定，造成成災(zāi)難性性后果。試管苗的的生根與與移栽試管苗的的生根試管內(nèi)生生根、根發(fā)生生過程 植物物離體培培養(yǎng)根的的發(fā)生都都來自不不定根。根的形形成從形形成上可可以分為為兩個(gè)階階段，即即形成根根源基和和根源基基的伸長長及生長長。前一一階段根根源基的的形成包包括第一一次、第第二次細(xì)細(xì)胞橫分分裂和第第三次細(xì)細(xì)胞縱分分裂，細(xì)細(xì)胞橫分分裂能夠夠被生長長素促進(jìn)進(jìn)。根源源基的

38、啟啟動(dòng)和形形成約歷歷時(shí)488h，后后一階段段為細(xì)胞胞快速伸伸長階段段，大約約需24448hh。根源源基的形形成和生生長素有有關(guān)，根根源基的的伸長可可以在沒沒有外源源生長素素下實(shí)現(xiàn)現(xiàn)。、影響試試管內(nèi)生生根的因因素 、植物材材料 不同植植物、不不同基因因型、同同一植株株不同部部位和不不同年齡齡對分化化根都有有決定性性因素。若試管管里不生生根不要要完全從從培養(yǎng)中中去找原原因，也也應(yīng)在取取材時(shí)考考慮。不不同植物物的一般般生根規(guī)規(guī)律是：木本比比草本難難，成年年樹比幼幼年樹難難，喬木木比灌木木難。、基本培培養(yǎng)基 大多多數(shù)使用用低濃度度的MSS培養(yǎng)基基，其中中不少使使用1/2MSS或1/3MSS培養(yǎng)基基。大

39、量量元素中中有人認(rèn)認(rèn)為NHH4+多可能能不利于于發(fā)根，生根需需要P和K元素，但不宜宜太多；而Caa2+多數(shù)數(shù)報(bào)道有有利于根根的形成成于生長長。微量量元素對對生根有有利的是是B和Fe。生生根通常常用1%3%的的蔗糖。植物生長長調(diào)節(jié)劑劑 據(jù)據(jù)報(bào)道單單用一種種生長素素的占551.5%，生長素素加激動(dòng)動(dòng)素占220.11%。aa、愈傷傷組織分分化根時(shí)時(shí)使用NNAA最最多，濃濃度以11.02.00為多。使用IIAA+激動(dòng)素素濃度范范圍以11.04.00和0.010.002居多多。b、而胚軸軸、莖段段、插枝枝、花梗梗等分化化根時(shí)，使用IIBA居居首位，濃度以以1.001為多多?？梢娨娚嗯囵B(yǎng)多數(shù)數(shù)使用生生

40、長素，大多以以IAAA、IBBA、NNAA單單獨(dú)用或或配合使使用，或或與低濃濃度激動(dòng)動(dòng)素配合合使用。NAAA與細(xì)胞胞分裂素素配合時(shí)時(shí)摩爾比比在（22030）：1為為好。一一般赤霉霉素、細(xì)細(xì)胞分裂裂素、乙乙烯通常常不利于于發(fā)根，如與生生長素配配合，一一般濃度度宜低于于生長素素，ABBA可能能有助于于發(fā)根，植物生生長延緩緩劑多效效唑（MMET）對不定定根的形形成也有有良好作作用，使使用濃度度0.114.00。、使用方方法 將生根根材料先先在一定定濃度植植物生長長調(diào)節(jié)劑劑中浸泡泡或培養(yǎng)養(yǎng)一段時(shí)時(shí)間，然然后轉(zhuǎn)入入無植物物生長調(diào)調(diào)節(jié)劑培培養(yǎng)基中中培養(yǎng)，能顯著著提高生生根率。、其他物物質(zhì) 間苯三三酚、脯脯

41、氨酸、核黃素素、活性性炭等等等。、繼代培培養(yǎng) 新梢生生根能力力隨繼代代時(shí)間增增長而能能力增加加，植物物在培養(yǎng)養(yǎng)初期不不易生根根。從試試管苗長長成的植植株上去去枝條比比在一般般植株上上取的更更易生根根。、光照強(qiáng)強(qiáng)度和光光照時(shí)間間對生根根的影響響十分復(fù)復(fù)雜，結(jié)結(jié)果不一一。、pH值值 一一般在55.06.00。、溫度 166C 25C。試管外生生根有些植物物種類在在試管內(nèi)內(nèi)難以生生根，或或有根但但與莖維維管束不不相通，或根與與莖聯(lián)系系差，或或有根無無根毛，或吸收收功能極極弱不易易成活，此時(shí)可可采用試試管外生生根的方方法，把把生根和和馴化過過程聯(lián)系系起來，即可大大幅度降降低成本本，又可可提高移移栽成活活率。試試管外生生根有三三種方法法：、在試管管內(nèi)誘導(dǎo)導(dǎo)根源基基再移栽栽 、在生根根小室進(jìn)進(jìn)行生根根和煉苗苗 做做一個(gè)生生根小室室，不用用瓊脂和和蔗糖，而用透透氣又保保濕的基基質(zhì)如泥泥炭、蛭蛭石、珍珍珠巖、苔蘚等等，并要要控制溫溫度、光光照、采采用人工工噴霧，霧滴要要細(xì)。、盆插和和瓶插生生根法 用罐罐頭瓶或或盆內(nèi)裝裝有泥炭炭或腐殖殖土與細(xì)細(xì)沙，每每瓶插入入20株株或300株無根根苗，插插入深度度為0.31.22cm,加入11/22MS+1.005.00IBAA或IAAA生根根液,，在一定定溫度、