《生化分離工程》第七章 層析分離技術

1、第七章 層析分離技術1主 要 內(nèi) 容第一節(jié) 概述第二節(jié) 凝膠層析第三節(jié) 離子交換層析第四節(jié) 疏水作用層析第五節(jié) 親和層析第六節(jié) 高效液相色譜2第一節(jié) 概述1.1 層析簡介 層析技術，亦稱色譜技術，是一種物理的分離方法。它是利用混合物中各組分的物理化學性質(zhì)的差別，使各組分以不同程度分布在兩個相中，其中一個相為固定的(稱為固定相)，另一個相則流過此固定相(稱為流動相)并使各組分以不同速度移動，從而達到分離。31903年，M.Tswett用碳酸鈣分離色素的示意圖Tswett分離葉綠素的經(jīng)典色譜過程41.2 層析技術的分類1.2.1 按兩相所處的狀態(tài)分類液體作為流動相，稱為“液相色譜”（liquid

2、chromatograp-hy）；用氣體作為流動相，稱為“氣相色譜”（gas chromatogr-aphy）。固定相也有兩種狀態(tài)，以固體吸附劑作為固定相和以附載在固體上的液體作為固定相，所以層析法按兩相所處的狀態(tài)可以分為： 液固色譜（liquid-solid chromatography） 液液色譜（liquid-liquid chromatography） 氣固色譜（gas-solid chromatography） 氣液色譜（gas-liquid chromatography） 51.2.2 按層析過程的機理分類吸附層析利用吸附劑表面對不同組分吸附性能的差異，達到分離鑒定的目的。分配層析

3、利用不同組分在流動相和固定相之間的分配系數(shù)（或溶解度）不同，而使之分離的方法。凝膠層析利用某些凝膠對于不同組分因分子大小不同而阻滯作用不同的差異，進行分離的技術。6吸附層析的種類物理吸附層析離子交換層析親和層析疏水作用層析金屬螯合層析有機染料層析71.2.3 按操作形式不同分類 柱層析（colum chromatography）將固定相裝于柱內(nèi)，使樣品沿一個方向移動而達到分離。 紙層析（paper chrmatography）用濾紙作液體的載體（擔體support），點樣后，用流動相展開，以達到分離鑒定的目的。 薄層層析（thin layper chromatography）將適當粒度的吸附劑

4、鋪成薄層，以紙層析類似的方法進行物質(zhì)的分離和鑒定。8 在層析過程中，流動相起運載作用，固定相起阻滯作用，不同的物質(zhì)根據(jù)其在兩相中的分配系數(shù)進行分配。 Kd=Cs/Cm。 K值大，表示某種物質(zhì)牢固地吸附在固定相中，溶質(zhì)出現(xiàn)在流動相中較晚。反之亦然。 在不同類型的層析中， K值的含義也不同。吸附層析中Kd為吸附平衡常數(shù)；分配層析中Kd為分配系數(shù)；離子交換層析中Kd為交換系數(shù)；親和層析中Kd為親和常數(shù)。1.3 層析技術原理與術語9色譜的名詞術語色譜術語 ：A、基線：B、峰高：色譜峰頂與基線間的垂直距離，以h表示。C、保留值：死時間tm：不被固定相吸附或溶解的物質(zhì)進入色譜柱時，從進樣到出現(xiàn)峰極大值所需

5、的時間。因為物質(zhì)不被固定相吸附，故其流動速度將與流動相的流動速度相近：保留時間tr：試樣從進樣到柱后出現(xiàn)峰極大點時所經(jīng)歷的時間。調(diào)整保留時間tr：.10tr的表達：時間單位(如s, d, h), 距離單位(如cm)，體積(ml, l)表示。tr意義：色譜法定性的基本依據(jù)，但同一組份的tr常受到流動相流速的影響，因此色譜工作者有時用保留體積等參數(shù)進行定性檢定。D、死體積VM：指色譜柱內(nèi)固定相顆粒間所剩留的空間、色譜儀中管路和連接頭間的空間以及檢測器的空間的總和，當后兩項很小而可忽略不計時， VM可由 tm與流動相體積流速F0(ml/min)計算：E、保留體積VR：指從進樣開始到被測組份在柱后出現(xiàn)

6、濃度極大點時所通過的流動相體積。保留體積與tr的關系如下：F、調(diào)整保留體積VR：某組份VR扣除VM后，稱該組份的VR ，即色譜的名詞術語11G、相對保留值2,1：某組份2與組份1的調(diào)整保留值之比，即：由于2,1只與柱溫及固定相的性質(zhì)有關，而與柱徑、柱長、填充情況及流動相流速無關，因此，它是色譜法中，如GC、HPLC中，廣泛使用的定性數(shù)據(jù)。注意：2,1絕不是兩個組份保留時間或保留體積之比在定性分析中，通常固定一個色譜峰作為標值(s), 然后再求其它峰(i)對這個峰的相對保留值。此時r,i 可能大于1，也可能小于1。在多元混合物分析中，通常選擇一對最難分離的物質(zhì)對，將它們的相對保留值作為重要參數(shù)。

7、在這種特殊情況下，可用符號a表示： 式中tr,2為下一峰的調(diào)整保留時間，所以這時a總是大于1。色譜的名詞術語12H)、分配比k, 即容量因子：意義：色譜柱對組份保留能力的重要參數(shù)k與m的關系：4)、區(qū)域?qū)挾壬V主峰的區(qū)域?qū)挾仁墙M份在色譜柱中譜帶擴張的函數(shù)，它反映了色譜操作條件的動力學因素。度量色譜峰區(qū)域?qū)挾韧ǔＳ腥N方法：A、標準差：0.607倍峰高處峰寬的一半。B、半峰寬Y1/2：峰高一半處對應的峰寬。它與的關系為C、基線寬度Y：色譜兩側(cè)拐點上的切線在基線上的截距。它與的關系是色譜的名詞術語13色譜曲線反映出的重要信息：A、根據(jù)色譜峰的個數(shù)，可以斷樣品中所含組份的最少數(shù)；B、根據(jù)色譜峰的保留

8、值(或位置)，可以進行定性分析；C、根據(jù)色譜峰下的面積或峰高，可以進行定量分析；D、依據(jù)色譜峰的保留值及其區(qū)域?qū)挾龋u價色譜柱分離效能；E、色譜峰兩峰間的距離，是評價固定相(和流動相)選擇是否合適的依據(jù)。14色譜理論 兩組份完全分離必須滿足：A、兩組份的分配系數(shù)必須有差異；B、區(qū)域擴寬的速率應小于區(qū)域分離的速度；C、在保證快速分離的前提下，提供足夠長的色譜柱。15塔板理論 塔板模型:將色譜柱視為精餾塔，即色譜柱是一系列連續(xù)的、相等的水平塔板組成。每一塊塔板高(plate high)為H。假設在每一塊塔板上，溶質(zhì)在兩相間很快達到分配平衡，然后隨著流動相按一個一個塔板的方式向前轉(zhuǎn)移。對一長為L的色

9、譜柱，溶質(zhì)平衡的次數(shù)應為：n稱為理論塔板數(shù)(theoretical plate number)。與精餾塔一樣，色譜柱的柱效隨理論塔板數(shù)n的增加而增加，隨塔板高H的增大而減小。n與半峰寬及峰底的關系式為: 式中tr(或Y1/2)應采取同一單位(時間或距離)。上式示：在tR一定時，如果色譜峰越窄，則說明n越大，H越小，柱效能越高。16例1 已知某組分峰的峰底寬為40S，保留時間為400S，計算此色譜柱的理論塔板數(shù)。例2 已知一根1米長的色譜柱的有效塔板數(shù)為1600塊，組份A在該柱上的調(diào)整保留時間為100秒，試求A峰的半峰寬及有效塔塔板高度。171 平衡關系分布系數(shù)Kd= Cs/CmCs： 溶質(zhì)在固

10、定相中的溶度Cm：溶質(zhì)在流動相中的溶度 溶質(zhì)在固定相中的量K (容量因子)= 溶質(zhì)在固定相中的量K = Kd （為相比）18阻滯因數(shù)（Rf值）Rf = = 保留值保留時間 tR、保留體積 vR 柱高 （L） t0（死時間） = tR = t0（1 + k） 線速度（） 分離度 tR2 tR1R = W1+ W2流動相在色譜系統(tǒng)中的移動速度Am + Kd As（固定相的平均截面積）溶質(zhì)的移動速度Am（流動相的平均截面積）191.4 層析技術的流程裝柱緩沖溶液平衡上樣收集洗脫活性檢測20實驗室用的層析柱工業(yè)用的層析柱21自動餾分收集儀（國產(chǎn)）自動餾分收集儀（進口）22蠕動泵23國產(chǎn)柱層析系統(tǒng)24伯

11、樂公司（BIO-RAD）柱層析系統(tǒng)25發(fā)瑪西亞公司（Pharmacia）柱層析系統(tǒng)26表面涂有硅膠層的玻璃板溶劑（流動相）點樣點樣品遷移方向帶蓋玻璃缸溶劑前沿薄層層析示意圖27第二節(jié) 凝膠層析 凝膠層析又稱為分子篩層析或凝膠過濾，是使混合物流動相經(jīng)過固定相凝膠的層析柱時，混合物中各組分按其分子大小不同而分離的技術。 具有分子篩作用的物質(zhì)很多，如浮石、瓊脂、瓊脂糖、聚乙烯醇、聚丙烯酰胺、葡聚糖凝膠等。28良好的凝膠過濾介質(zhì)應具備的條件：親水性高，表面惰性穩(wěn)定性強，使用壽命長具有一定的孔徑分離范圍機械強度高29常用填料Sephadex系：是以氯代環(huán)氧丙烷進行交聯(lián)的葡聚糖珠狀凝膠。經(jīng)典的凝膠介質(zhì)Se

12、pharose系:經(jīng)過純化的瓊脂糖，含極少的帶電集團。型號最多、應用最廣Sephacryl系：有是丙基葡聚糖與N,N-亞甲基雙丙稀酰胺共聚而成。經(jīng)濟高效Superdex系：是葡聚糖與瓊脂糖共聚而成的復合凝膠。最新，選擇性強，分辨率極高30（一）原理 凝膠是一種多孔性的不帶表面電荷的物質(zhì)，當帶有多種成分的樣品溶液在凝膠內(nèi)運動時，由于它們的分子量不同而表現(xiàn)出速度的快慢，在緩沖液洗脫時，分子量大的物質(zhì)不能進入凝膠孔內(nèi)，而在凝膠間幾乎是垂直的向下運動，而分子量小的物質(zhì)則進入凝膠孔內(nèi)進行“繞道”運行，這樣就可以按分子量的大小，先后流出凝膠柱，達到分離的目的。3132（二）葡聚糖凝膠的種類與性能 葡聚糖又

13、名右旋糖酐，在它們的長鏈間以三氯環(huán)氧丙烷交聯(lián)劑交聯(lián)而成。葡聚糖凝膠具有很強的吸水性，交聯(lián)度大，吸水性小，相反交聯(lián)度小，吸水性大。商品名以SephadexG表示，G值越小，交聯(lián)度越大，吸水性越小，G值越大，交聯(lián)度越小，吸水性就越大，二者呈反比關系，G值大約為吸水量的10倍。由此可以根據(jù)床體積而估算出葡聚糖凝膠干粉的用量。33表 Sephadex1的種類與特性型號分離范圍（分子量）吸水量（ml/mg）最小溶脹時間（h）床體積（ml）/干凝膠（mg）20-25100G10 7001.00.13123G15 1,5001.50.2312.53.5G25 5,0002.50.23146G501,500-

14、20,0008.00.331911G753,000-70,0007.50.52411215G1004,000-15,0000101.07211520G1505,000-800, 000151.5721203G2005,000-3000,000202.0721304034（三）試驗方法1凝膠的選擇 根據(jù)層析物質(zhì)分子量的大小選擇不同型號的凝膠，如除鹽和除游離的熒光素，則可選用粗、中粒度的G25或G50，G250多用于分離蛋白質(zhì)單體，G200多用于分離蛋白質(zhì)凝膠聚合體等。2凝膠的預處理 稱取適量的凝膠加入過量的緩沖液在冰箱（或室溫）中充分膨脹，或在沸水中煮，膨脹時間應根據(jù)不同型號的凝膠而定。35表1

15、10 凝膠量與型號和層析柱大小與規(guī)格及凝膠用量 層析柱規(guī)格凝膠的規(guī)格和用量（g）直徑（cm）高（cm）容量（ml）G25 G50G100G2000.9159.52.510.60.30.93019521.20.60.960381042.51.21.620401042.51.21.640802085.02.41.67014035149.04.41.6100200502012.562.64021050201272.670370903520122.62.6100605301 0001302505011030701735 表 凝膠量與型號和層析柱大小與規(guī)格及凝膠用量 363裝柱 層析柱的選擇一般根據(jù)分離

16、樣品的種類和樣品的數(shù)量而定。純化蛋白質(zhì)時，柱床體積應為樣品體積的25100倍。去鹽、游離熒光素約為樣品體積的410倍。 柱太短，影響分離效果。柱長一些，分離效果好，但柱太長，則延長分離時間，樣品也稀釋過度。層析柱的內(nèi)徑也要選擇適當。內(nèi)徑過細，會發(fā)生“器壁效應”，即靠近管壁的流速要大于中心的流速影響分離效果。所以層析柱的內(nèi)徑和高度應有一定的比例。對于除鹽來說應為15125；對于純化蛋白質(zhì)來說應為1201100。374加樣與洗脫 樣品體積不宜過多，最好為床體積的15%，最多不要超過10%。樣品濃度也不宜過大，濃度過大粘度大，分離效果差，一般不超過4%。 洗脫液應與膨脹一致，否則更換溶劑，凝膠體積會

17、發(fā)生變化，影響分離效果。洗脫液要有一定的離子強度和pH值。分離血清蛋白常用0.020.1Mol/L pH 6.98.0的PBS液（0.14Mol/L NaCl）和0.1Mol/L pH8.0Tris-HCl緩沖鹽溶液（0.14Mol/L NaCl）。5洗脫液收集及檢測386凝膠柱的重復使用與保存 當樣品的各組分全部洗脫下來之后，即可加入新的樣品，繼續(xù)使用。保存方法有三種： 在液相中保存最方便，即于凝膠懸液中加入防腐劑（一般為0.02%疊氮鈉或0.002%洗必泰）或高壓滅菌后4保存。此法至少可以保存半年以上。 用完后，以水沖洗，然后用60%70%酒精液沖洗，凝膠體積縮小，即在半收縮狀態(tài)下保存。

18、長期不用者，最好以干燥狀態(tài)保存，即水洗凈后，用含乙醇的水洗，逐漸加大乙醇用量，最后用95%的乙醇洗，可全部去水，再用乙烯去除乙醇，抽濾干，于6080干燥后保存。39凝膠過濾層析的特點優(yōu)點：可測定蛋白質(zhì)分子量可研究蛋白質(zhì)二聚體或寡聚體的存在可用于蛋白質(zhì)的脫鹽洗脫操作條件溫和，產(chǎn)品收率可接近100%易實施循環(huán)操作，提高產(chǎn)品純度不足：選擇性低，料液處理量小需要具有濃縮作用的單元操作40凝膠過濾層析的應用分離純化脫鹽相對分子量的測定41第三節(jié) 離子交換層析 陰離子交換凝膠本身帶有正電荷基團，陽離子交換凝膠本身帶負電荷基團。由于靜電相互作用而使樣品結合到凝膠上，再采用鹽濃度梯度或者更換緩沖液的pH值進行

19、洗脫 對于等電點小于5.0的酸性蛋白質(zhì)，推薦使用陰離子交換，對于等電點大于7.0的堿性蛋白質(zhì)，推薦使用陽離子交換。 兩種模式：一種使目的蛋白結合凝膠，通過梯度洗脫；一種使目的蛋白不結合凝膠，而大部分雜質(zhì)結合凝膠，則穿過液中含有目的蛋白。 42DEAE-Cl 蛋白質(zhì)DEAE-Cl + DEAE- 蛋白質(zhì)NaCl蛋白質(zhì)Cl陰離子交換色譜原理4344層析條件pH：陰離子交換層析：蛋白質(zhì)帶負電荷，則要求pHpI，但不能高于介質(zhì)功能基團的pK；陽離子交換層析：蛋白質(zhì)帶正電荷，則要求pHpI，但不能低于介質(zhì)功能基團的PK；緩沖溶液：陰離子交換層析：Tris-HCl陽離子交換層析：PBS上樣：上樣量；鹽濃度

20、45吸附速度：洗脫方式：改變離子強度、PH等/線性梯度洗脫階段/逐次洗脫洗脫速度：階段洗脫可盡量大；梯度洗脫需根據(jù)出峰情況調(diào)整。46強酸和強堿型交換劑能在較為廣泛的pH范圍內(nèi)(pH1-pH14)完全解離。弱酸型交換劑在低于pH4，弱堿型交換劑在高于pH9就難于解離，因而失去交換能力。陽離子交換劑陰離子交換劑根據(jù)可交換的離子的性質(zhì)強酸型強堿弱酸弱堿根據(jù)酸堿性的強弱離子交換劑的分類47離子交換劑的選擇考慮因素：酸堿強弱：由功能基團決定穩(wěn)定性再生性經(jīng)濟具有三維空間立體結構的網(wǎng)絡骨架連接在骨架上的活性基團活性基團所帶的相反電荷的活性離子（可交換離子）48常見類型纖維素類：無定形，分辨率和穩(wěn)定性都較低

21、葡聚糖系：體積和流速受PH值、離子強度影響較大；瓊脂糖系：最常用聚乙烯醇系(Toyopearl)：全合成的苯乙烯系（Source）：流速快，分辨率高49離子交換層析的優(yōu)點料液處理量大，具濃縮作用應用范圍廣產(chǎn)品回收率高商業(yè)化的離子交換劑種類多，價格較低50常見問題分析不吸附：緩沖溶液pH不對；離子強度太高；峰形不穩(wěn)或出現(xiàn)奇異峰：柱床中有氣泡或緩沖溶液不純分辨率低：梯度太大；流速太高前沿峰：柱過載；填充效果差；柱需再生峰拖尾：樣品在柱濾膜上或凝膠床頂部沉淀基線隨梯度上移：鹽濃度臨近CMC51 （1）原理第四節(jié) 疏水作用層析疏水層析是利用表面偶聯(lián)疏水性基團的疏水性吸附劑為固定相，根據(jù)生物分子與固定相

22、之間疏水作用力的差別進行分離的層析方法。 52疏水層析技術示意圖53離子強度及種類破壞水化作用的物質(zhì)表面活性劑溫度 （2）影響疏水性的條件54（3）疏水層析操作要點 根據(jù)試驗目的及樣品特點選擇合適的疏水膠：要選擇能完全吸附目的蛋白質(zhì)，但洗脫條件又比較溫和的柱材料。 吸附條件的選擇：上柱樣品中應含一定濃度的中性鹽，以增加溶質(zhì)與疏水膠的相互作用。一般要求在較高的離子強度（4 mol/L,NaCl）下吸附蛋白質(zhì)。各種鹽對疏水作用的影響由其化學性質(zhì)決定。55 洗脫條件的選擇：選擇原則：直接破壞疏水作用；通過改變蛋白質(zhì)的構象作用洗脫方法：改用低鹽析效應的鹽降低離子強度加乙二醇降低洗脫液極性在洗脫液中加去

23、污劑增加洗脫pH上述洗脫方法有的通常由高到低的NaCl濃度梯度洗脫，或由高到低的鹽濃度梯度加由低到高的乙二醇濃度梯度洗脫56柱的再生 再生的目的是除去緊密吸附的蛋白質(zhì)和殘存去污劑。經(jīng)驗證明按下述方法有效： 2倍柱床體積水 1體積乙醇2體積正丁醇1體積乙醇1體積水再用初始緩沖液平衡吸附劑57疏水層析的特點由于在高濃度鹽溶液中疏水性吸附作用較大，因此疏水層析可直接分離鹽析后的蛋白質(zhì)溶液。 可通過調(diào)節(jié)疏水配基鏈長和密度調(diào)節(jié)吸附力，因此可根據(jù)目標產(chǎn)物的性質(zhì)選擇適宜的吸附劑。疏水吸附劑種類多，選擇余地大。 58疏水作用層析的應用互換酶的分離蛋白質(zhì)亞基與蛋白質(zhì)聚合物的分離多肽與蛋白質(zhì)碎片的分離59定義：親

24、和層析是利用生物大分子的生物學特異性，即生物分子與其配體之間所具有的專一性親和力而設計的層析技術。 例如：酶和酶的抑制劑、抗原和抗體、蛋白質(zhì)和輔酶之間有一種特殊的親和力，在一定條件下它們能緊密結合成復合物。如果將復合物的某一方固定在不溶性載體上，則可以從溶液中專一性地分離和提純另一方。第五節(jié) 親和層析60親和層析原理 先將待提純蛋白質(zhì)的特異配基，通過適當?shù)幕瘜W反應共價地連接到象瓊脂糖凝膠一類的載體的功能基上。一般在配基與多糖基質(zhì)之間插入一段所謂連接臂使配基與凝膠之間保持足夠的距離，不致因載體表面的空間位阻而防礙待分離的大分子與配基的結合。 當待提純的蛋白質(zhì)樣品加到這種多糖材料的層析柱上時，待提

25、純的蛋白質(zhì)就會有特異的配體結合，而其他的蛋白質(zhì)，因?qū)@個配體不具有特異的結合位點，將通過柱子 而流出。而特異地結合到柱子上的蛋白質(zhì)可用自由配體分子（含游離配體的溶液）洗脫下來。61621 親和層析的一般問題 1.1 配基的選擇將一對能可逆結合和解離生物分子的一方與水不溶載體相偶聯(lián)制成親和吸附劑，這樣一對生物分子中，被偶聯(lián)的一方就叫作配基。在實際工作中，究競選擇哪一種物質(zhì)作配基，要根據(jù)分離對象和實驗的具體情況而定。純化酶選擇酶的競爭性抑制劑、底物、輔酶和效應劑作配基。純化酶的抑制劑選擇相應的酶做配基。純化能結合維生素的蛋白質(zhì)，選擇與其專一結合的維生素做配基。631.2 載體的選擇 將親和配基共價

26、偶聯(lián)在固體粒子的表面(或孔內(nèi))即可制備親和吸附介質(zhì)，該固體粒子通常稱為配基的載體。因此，親和吸附介質(zhì)又稱親和載體。作為載體的固體粒子應滿足下列要求：(1)具有親水性多孔結構，無非特異性吸附，比表面積大 (2)物理和化學穩(wěn)定性高，較高的機械強度，使用壽命長(3)含有可活化的反應基團，用于親和配基的固定化；(4)粒徑均一的球形粒子64手臂的選擇具有與載體和配體進行偶聯(lián)反應的功能基團。要能經(jīng)得起偶聯(lián)、洗脫等操作過程的化學處理和條件的變化。親水，但又不能帶電荷。一般對臂有如下要求：651.3 基質(zhì)活化和偶聯(lián) 大部份基質(zhì)在偶聯(lián)抗體之前，均需要進行化學活化?；罨|(zhì)通常經(jīng)過與抗體表面殘基的-NH反應將抗體

27、偶聯(lián)，偶聯(lián)反應也可通過與抗體表面的-0H、-C00H或-NH進行。 在小配體的親和色譜中，間隔臂常插在基質(zhì)和配體之間，以盡量減少空間位阻對蛋白質(zhì)與其配體相互作用的影響。當配體本身就是蛋白質(zhì)大分子，因此，空間位阻將不會阻礙抗體與抗原的相互作用。 最常使用的基質(zhì)活化方法是溴化氰法。用溴化氰活化多糖類基質(zhì)具有簡單、效果好的特點。許多活化好的、穩(wěn)定的基質(zhì)已商品化。661.4 洗脫問題 非特異洗脫的方法，通過改變洗脫液的PH值、離子強度、離子種類或溫度等理化性質(zhì)使固定化配基和生物高分子之間的親和力降低，以至解開生物高分子和親和吸附劑之間的結合。 特異洗脫的方法，利用含有與親和配基或目標產(chǎn)物具有親和作用的

28、小分子化合物溶液為洗脫劑，通過與親和配基或目標產(chǎn)物的競爭性結合，脫附目標產(chǎn)物。 另一種洗脫的方法是利用配基通過重氮鍵或硫脂鍵連接在載體上的這一特點，當吸附生物大分子以后，可以用還原劑斷裂重氮鍵或斷裂硫脂鍵，從而得到生物大分子和配基的絡合物，然后將絡合物解離，再分出欲純化的生物大分子。67親和層析的優(yōu)缺點是分離蛋白質(zhì)的一種極為有效的方法是最有效的生物活性物質(zhì)純化方法仍有些非特異的吸附，且配基易脫落進入分離體系載體較昂貴，機械強度低，配基制備困難68金屬離子親和層析（IMAC）基本原理 通過Cu2 +、Co2 +、Zn2 +、Ni2 +等過渡金屬離子與蛋白質(zhì)表面的組氨酸的咪唑基、半胱氨酸的巰基和色

29、氨酸的吲哚基配位結合，利用蛋白質(zhì)表面這些氨基酸的種類、數(shù)量、位置和空間構象的不同所導致的與金屬螯合物的親和力大小的不同，選擇性地對蛋白質(zhì)加以分離純化 。693.2 固定化金屬離子親和層析柱的制法 將柱子浸沒于某種金屬離子(如Cu2+、Zn2+、Ni2+、Co2+)緩沖液中，直至螯合到固定相上的金屬離子和溶液中的金屬離子達到平衡。固相載體，通常是多聚物(如交聯(lián)化的瓊脂糖，葡聚糖)，配位體(亞氨基二乙酸，IDA)共價連接當在緩沖液中浸泡平衡后，經(jīng)洗滌，可將含有生物活性物質(zhì)的樣品上柱，與固定化金屬配基有親和力的分子都將被滯留，其余則流出柱外。70 IMAC的應用 近二十年來，國外在IMAC分離純化蛋

30、白質(zhì)方面的主要研究結果列于下表。 近年來，IMAC廣泛應用于基因重組技術產(chǎn)生的蛋白及多肽的分離純化。在欲分離的蛋白表面接上對金屬離子有親和性的氨基酸（如組氨酸、半胱氨酸、色氨酸）或螯合肽（如組氨酸色氨酸、組氨酸組氨酸），促進蛋白質(zhì)的分離和純化。對基因工程重組蛋白的純化，常通過基因工程人工合成多組氨酸殘基尾巴(常為6His尾巴)，添加到蛋白質(zhì)的N-末端或C-末端，這種基因工程蛋白與料液中的其他蛋白質(zhì)相比，對金屬離子有更高的特異性，在分離純化后再用化學法或酶法將尾巴切掉。71蛋白質(zhì)來源金屬離子過氧化氫酶牛肝FeD-乙內(nèi)酰脲酶細胞溶解物Cu細胞色素C 和溶菌酶大腸桿菌細胞抽提物Cu 磷蛋白牛奶Ga綠

31、色熒光蛋白大腸桿菌細胞抽提物Cu/Ni/Co/Zn果膠酶植物（Biocon Plus）Cu泌乳刺激素大腸桿菌培養(yǎng)物Ni生長激素大腸桿菌培養(yǎng)物Cu生物素標記的蛋白質(zhì)沒有生物素標記的相似物Pt表 固定金屬離子親和色譜分離蛋白質(zhì) 72膠原纖維固化鐵從蛋清粉中吸附分離溶菌酶 吸附前蛋白質(zhì)起始濃度為0.97mg/mL,洗脫液中蛋白質(zhì)濃度最高為4.8mg/mL,約為原蛋白質(zhì)濃度的5倍，說明膠原纖維固化鐵固定床對蛋白質(zhì)具有富集作用。吸附前蛋白質(zhì)溶液的溶菌酶酶活很低(100U/mL),洗脫液的最高酶活可達4.84104U/mL，說明洗脫液中溶菌酶的濃度遠遠高于蛋白質(zhì)起始溶液中的。 初次使用的固定床與再生固定床

32、對溶菌酶的回收率分別為70.5和70.0。從蛋清粉中分離純化溶菌酶73膠原纖維固化鋯從蛋清粉中吸附分離溶菌酶吸附前蛋白質(zhì)濃度為1.0mg/mL,洗脫液中蛋白質(zhì)濃度最高為3.9mg/mL，約為原蛋白質(zhì)濃度的4倍，說明膠原纖維固化鋯固定床對蛋白質(zhì)具有富集作用。吸附前蛋白質(zhì)溶液的溶菌酶酶活很低(100U/mL),洗脫液的最高酶活可達4.72104U/mL，說明洗脫液中溶菌酶的濃度遠遠高于蛋白質(zhì)起始溶液中的。 初次使用的固定床與再生固定床對溶菌酶的回收率分別為68.7和68.4。 從蛋清粉中分離純化溶菌酶74高效液相色譜法檢測分離后溶菌酶的純度 膠原纖維固化鐵固定床和膠原固化鋯固定床吸附分離后溶菌酶的

33、純度均為100。 從蛋清粉中分離純化溶菌酶753.3 固定化金屬離子親和層析的優(yōu)點 和傳統(tǒng)的親和層析相比，固定化金屬離子親和層析具有以下優(yōu)點：(1)配基穩(wěn)定性高，不易脫落；(2)金屬離子配基價格低廉，再生成本低；(3)可在高鹽濃度下操作，從而省去了脫鹽的預處理步驟，而且可以減少非特異性吸附；(4)蛋白質(zhì)洗脫比較容易，采用較低pH或采用競爭性物質(zhì)如咪唑,EDTA,便可將吸附蛋白解吸下來。76IMAC與其他親和層析相比具有以下優(yōu)點： (1)蛋白質(zhì)吸附容量大，是天然配基結合量的1O-100倍； (2)價格便宜，投資低； (3)具有普遍適用性金屬離子配基具有很好的穩(wěn)定性，吸附容量大，成本很低，且層析柱

34、可長期連續(xù)使用，易于再生。 (4)洗脫條件溫和77 固定化金屬離子親和層析的缺點 金屬離子親和層析與免疫親和層析比較起來，對蛋白質(zhì)的特異性差，會發(fā)生非特異性吸附，結合常數(shù)K在104105之間。 另外，螯合在親和載體上的金屬離子在操作過程中有可能脫落而混入產(chǎn)品中，嚴重影響產(chǎn)品質(zhì)量螯合。78第六節(jié) 高效液相色譜 高效液相色譜法（HPLC）是20世紀60年代末70年代初發(fā)展起來的一種新型分離分析技術，它是在經(jīng)典液相色譜基礎上，引入了氣相色譜的理論，在技術上采用了高壓泵、高效固定相和高靈敏度檢測器，因而具備速度快、效率高、靈敏度高、操作自動化的特點。 為了更好地了解高效液相色譜法優(yōu)越性，現(xiàn)從兩方面進行

35、比較： 79 1高效液相色譜法與經(jīng)典液相色譜法 高效液相色譜法比起經(jīng)典液相色譜法的最大優(yōu)點在于高速、高效、高靈敏度、高自動化。 高速是指在分析速度上比經(jīng)典液相色譜法快數(shù)百倍。由于經(jīng)典色譜是重力加料，流出速度極慢；而高效液相色譜配備了高壓輸液設備，流速最高可達 103cmmin-1。802高效液相色譜法與氣相色譜法 （l）氣相色譜法分析對象只限于分析氣體和沸點較低的化合物，它們僅占有機物總數(shù)的20。對于占有機物總數(shù)近80的那些高沸點、熱穩(wěn)定性差、摩爾質(zhì)量大的物質(zhì)，目前主要采用高效液相色譜法進行分離和分析。 (2)氣相色譜采用流動相是惰性氣體，它對組分沒有親和力，即不產(chǎn)生相互作用力，僅起運載作用。

36、而高效液相色譜法中流動相可選用不同極性的液體，選擇余地大，它對組分可產(chǎn)生一定親和力，并參與固定相對組分作用的劇烈競爭。因此，流動相對分離起很大作用，相當于增加了一個控制和改進分離條件的參數(shù)，這為選擇最佳分離條件提供了極大方便。81 (3)氣相色譜一般都在較高溫度下進行的，而高效液相色譜法則經(jīng)常可在室溫條件下工作。 總之，高效液相色譜法是吸取了氣相色譜與經(jīng)典液相色譜優(yōu)點，并用現(xiàn)代化手段加以改進，因此得到迅猛的發(fā)展。目前高效液相色譜法已被廣泛應用于分析對生物學和醫(yī)藥上有重大意義的大分子物質(zhì)，例如蛋白質(zhì)、核酸、氨基酸、多糖類、植物色素、高聚物、染料及藥物等物質(zhì)的分離和分析。 高效液相色譜法的儀器設備

37、費用昂貴，操作嚴格，這是它的主要缺點。 82高效液相色譜儀 高效液相色譜儀的結構示意見圖，一般可分為4個主要部分：高壓輸液系統(tǒng)，進樣系統(tǒng)，分離系統(tǒng)和檢測系統(tǒng)。此外還配有輔助裝置：如梯度淋洗，自動進樣及數(shù)據(jù)處理等。 其工作過程如下：首先高壓泵將貯液器中流動相溶劑經(jīng)過進樣器送入色譜柱，然后從控制器的出口流出。當注入欲分離的樣品時，流經(jīng)進樣器貯液器的流動相將樣品同時帶入色譜柱進行分離，然后依先后順序進入檢測器，記錄儀將檢測器送出的信號記錄下來，由此得到液相色譜圖。 8384 1高壓輸液系統(tǒng) 高壓輸液系統(tǒng)高效液相色譜儀最重要的部件，一般由儲液罐、高壓輸液泵、過濾器、壓力脈動阻力器等組成，其中高壓輸液泵

38、是核心部件。 對于一個好的高壓輸液泵應符合密封性好，輸出流量恒定，壓力平穩(wěn)，可調(diào)范圍寬，便于迅速更換溶劑及耐腐蝕等要求。 常用的輸液泵分為恒流泵和恒壓泵兩種。恒流泵特點是在一定操作條件下，輸出流量保持恒定而與色譜柱引起阻力變化無關；恒壓泵是指能保持輸出壓力恒定，但其流量則隨色譜系統(tǒng)阻力而變化，故保留時間的重視性差，它們各有優(yōu)缺點。852進樣系統(tǒng) 高效液相色譜柱比氣相色譜柱短得多（約530cm），所以柱外展寬（又稱柱外效應）較突出。柱外展寬是指色譜柱外的因素所引起的峰展寬，主要包括進樣系統(tǒng)、連接管道及檢測器中存在死體積。柱外展寬可分柱前和柱后展寬。進樣系統(tǒng)是引起往前展寬的主要因素，因此高效液相色

39、譜法中對進樣技術要求較嚴。 863 分離系統(tǒng)色譜柱 色譜柱是液相色譜的心臟部件，它包括柱管與固定相兩部分。柱管材料有玻璃、不銹鋼、鋁、銅及內(nèi)襯光滑的聚合材料的其他金屬。玻璃管耐壓有限，故金屬管用得較多。 一般在分離前備有一個前置柱，前置柱內(nèi)填充物和分離柱完全一樣，這樣可使淋洗溶劑由于經(jīng)過前置柱為其中的固定相飽和，使它在流過分離柱時不再洗脫其中固定相，保證分離柱的性能不受影響。 柱子裝填得好壞對柱效影響很大。對于細粒度的填料（20m）一般采用勻漿填充法裝柱，先將填料調(diào)成勻漿，然后在高壓泵作用下，快速將其壓入裝有洗脫液的色譜柱內(nèi)，經(jīng)沖洗后，即可備用。 874檢測系統(tǒng) 在液相色譜中，有兩種基本類型的

40、檢測器： 溶質(zhì)性檢測器：僅對被分離組分的物理或化學特性有響應，屬于這類檢測器的有紫外、熒光、電化學檢測器等。 總體檢測器：對試樣和洗脫液總的物理或化學性質(zhì)有響應，屬于這類檢測器的有示差折光，電導檢測器等。88 （l）紫外檢測器 (2) 熒光檢測器 (3) 示差折光率檢測器 幾乎所有物質(zhì)都有各自不同的折射率，因此差示折光檢測器是一種通用型檢測器。靈敏度可達10-7gcm-3。主要缺點是對溫度變化敏感，并且不能用于梯度淋洗。 (4) 電導檢測器 (5) 附屬系統(tǒng) 包括脫氣、梯度淋洗、恒溫、自動進樣、餾分收集以及數(shù)據(jù)處理等裝置。其中梯度淋洗裝置是高壓液相色譜儀中尤為重要的附屬裝置 . 89高效液相色

41、譜的固定相和流動相 固定相 高效液相色譜固定相以承受高壓能力來分類，可分為剛性固體和硬膠兩大類。 剛性固體以二氧化硅為基質(zhì)，可承受7.O1081.O109Pa的高壓，可制成直徑、形狀、孔隙度不同的顆粒。 硬膠主要用于離子交換和尺寸排阻色譜中，它由聚苯乙烯與二乙烯苯基交聯(lián)而成?？沙惺軌毫ι舷逓?.5108Pa。 固定相按孔隙深度分類，可分為表面多孔型和全多孔型固定相兩類。 90表面多孔型固定相 其基體是實心玻璃珠，在玻璃球外面覆蓋一層多孔活性材料，如硅膠、氧化鋁、離子交換劑、分子篩、聚酸胺等。 這類固定相的多孔層厚度小、孔淺，相對死體積小，出峰迅速、柱效亦高；顆粒較大，滲透性好，裝柱容易，梯度淋

42、洗時能迅速達平衡，較適合做常規(guī)分析。由于多孔層厚度薄，最大允許量受限制。 91全多孔型固定相 它由直徑為10nm的硅膠微粒凝聚而成。也可由氧化鋁微粒凝聚成全多孔型固定相。 這類固定相由于顆粒很細（510m），孔仍然較淺，傳質(zhì)速率快，易實現(xiàn)高效、高速。特別適合復雜混合物分離及痕量分析。92 93流動相 由于高效液相色譜中流動相是液體，它對組分有親和力，并參與固定相對組分的競爭。因此，正確選擇流動相直接影響組分的分離度。對流動相溶劑的要求是： （1）溶劑對于待測樣品，必須具有合適的極性和良好的選擇性。 （2）溶劑要與檢測器匹配。對于紫外吸收檢測器，應注意選用檢測器波長比溶劑的紫外截止波長要長。所謂

43、溶劑的紫外截止波長指當小于截止波長的輻射通過溶劑時，溶劑對此輻射產(chǎn)生強烈吸收，此時溶劑被看作是光學不透明的，它嚴重干擾組分的吸收測量。表20-2列出了一些常用溶劑的紫外截止波長。 對于折光率檢測器，要求選擇與組分折光率有較大差別的溶劑作流動相，以達最高靈敏度。9495(3) 高純度。由于高效液相靈敏度高，對流動相溶劑的純度也要求高。不純的溶劑會引起基線不穩(wěn)，或產(chǎn)生“偽峰”。痕量雜質(zhì)的存在，將使截止波長值增加50100nm。(4) 化學穩(wěn)定性好。不能選與樣品發(fā)生反應或聚合的溶劑。(5) 低粘度。若使用高粘度溶劑，勢必增高壓力，不利于分離。常用的低粘度溶劑有丙酮、乙醇、乙晴等。但粘度過于低的溶劑也不宜采用，例戊烷、乙醚等，它們易在色譜柱或檢