色譜分析法研究生課件

1、色譜分析法研究生色譜分析法研究生 毛細(xì)管氣相色譜法使用的色譜柱是空心的毛細(xì)管柱，叫開(kāi)管柱：固定液涂漬或固定化在柱管內(nèi)壁上，而載氣和其中的樣品從中心的通道上通過(guò)。柱材料主要是熔融石英（FSOT）。一、高分辨氣相色譜法2022/9/92 毛細(xì)管氣相色譜法使用的色譜柱是空心的（一）色譜柱1毛細(xì)管柱的類(lèi)型： 柱類(lèi)型 柱內(nèi)徑 柱長(zhǎng) 液膜厚度普通開(kāi)管柱 0.20.53mm 560m 0.11.0m 壁涂開(kāi)管柱 多孔層開(kāi)管柱 擔(dān)體涂漬開(kāi)管柱 微內(nèi)徑開(kāi)管柱 100m大內(nèi)徑開(kāi)管柱 0.32mm 1m或5m2022/9/93（一）色譜柱1毛細(xì)管柱的類(lèi)型： 柱類(lèi)型2毛細(xì)管柱的選擇常用的固定液有：SE-31、OV-1

2、、SE-54、SE-52、OV-1701、Carbowax 20M。柱的選擇：根據(jù)樣品組分的沸點(diǎn)，一般地，相差2或2以上的組分，采用非極性毛細(xì)管柱分離；若沸點(diǎn)相差在2以?xún)?nèi)的組分，則需在極性較大的毛細(xì)管柱上分離。 2022/9/942毛細(xì)管柱的選擇常用的固定液有：SE-31、OV-1、S3毛細(xì)管柱的性能評(píng)價(jià)評(píng)價(jià)指標(biāo)：分離效率、表面惰性、熱穩(wěn)定性。評(píng)價(jià)方法：在一定的色譜條件下，分離各種測(cè)試物質(zhì)，獲得的特征性數(shù)據(jù)和峰對(duì)稱(chēng)性，以此來(lái)評(píng)價(jià)柱效和表面活性。在測(cè)定了柱效和表面活性之后，用流失速率試驗(yàn)來(lái)評(píng)價(jià)熱穩(wěn)定性。2022/9/953毛細(xì)管柱的性能評(píng)價(jià)評(píng)價(jià)指標(biāo)：分離效率、表面惰性、熱穩(wěn)定（二）進(jìn)樣方式 分流

3、進(jìn)樣：使用方便，對(duì)分流比、進(jìn)樣溫度 樣品和載氣的情況、進(jìn)樣體積和 濃度、進(jìn)樣重復(fù)性需要注意。 不適于痕量分析和寬沸程樣。 適合大多數(shù)類(lèi)型的樣品，樣品濃 濃高、各組分的濃度相近2022/9/96（二）進(jìn)樣方式 分流進(jìn)樣：使用方便，對(duì)分流比、進(jìn)樣溫度溶液直接進(jìn)樣 進(jìn)樣口溫度應(yīng)高于柱溫3050；采用微量注射器、微量進(jìn)樣閥或有分流裝置的氣化室進(jìn)樣，進(jìn)樣量一般不超過(guò)數(shù)微升，色譜柱越細(xì)，進(jìn)樣量應(yīng)越少，毛細(xì)管氣相色譜法中，一般應(yīng)分流以免過(guò)載。頂空進(jìn)樣 適用于固體和液體供試品中揮發(fā)性組分的分離和測(cè)定。供試液在恒溫控制的加熱室中加熱至供試品中揮發(fā)性組分在非氣態(tài)和氣態(tài)達(dá)到平衡后，由進(jìn)樣器自動(dòng)吸取一定體積的頂空氣注

4、入色譜柱中。2022/9/97溶液直接進(jìn)樣 進(jìn)樣口溫度應(yīng)高于柱溫3050；采用微量注射不分流進(jìn)樣：須利用溶劑效應(yīng)或冷阱，操作較難 特別適用于痕量分析和寬沸程樣品柱頭進(jìn)樣：必須使用外徑為0. 17 0.23mm的 細(xì)針，柱內(nèi)徑必須大于0.32 mm , 不能通過(guò)隔墊進(jìn)樣，緩慢進(jìn)樣 對(duì)熱不穩(wěn)定、稀的和寬沸程樣品較 理想；能給出定量結(jié)果 非揮發(fā)物在柱的中積累導(dǎo)致柱變性 和柱效損失 2022/9/98不分流進(jìn)樣：須利用溶劑效應(yīng)或冷阱，操作較難 直接進(jìn)樣：樣品無(wú)須事先濃縮，進(jìn)樣器溫度可較 低，載氣消耗量小，分析所需樣量小 適用于濃度范圍要比不分流進(jìn)樣寬一個(gè) 數(shù)量級(jí)以上的樣品，有利于對(duì)熱不穩(wěn)定 的樣品；當(dāng)

5、樣品中含有揮發(fā)性低的組分 時(shí)，難于定量分析2022/9/99 直接進(jìn)樣：樣品無(wú)須事先濃縮，進(jìn)樣器溫度可較2022/9/3 （三）應(yīng)用示例-人尿中勞拉西泮的檢測(cè)1.測(cè)定意義：勞拉西泮(簡(jiǎn)稱(chēng)LRZ)上用為催眠、鎮(zhèn)靜和抗癲癇藥物 ,常被犯罪分子作為麻醉藥物用于麻醉?yè)尳俚嚷樽砗蠓缸?。為了確證這類(lèi)案件的性質(zhì) ,經(jīng)常需要對(duì)受害人的血、尿等體液中麻醉藥物或其代謝物進(jìn)行檢測(cè)。人體攝入該藥后其血液中藥物濃度較低 ,且犯罪分子所用藥量一般不使受害人死亡,而且此類(lèi)案件一般報(bào)案較遲，因此血中藥物濃度較低 ,對(duì)其檢測(cè)較為困難。該藥主要以葡萄糖醛酸苷的形式由尿液排泄。 2022/9/9102022/9/312 2.色譜條

6、件：HP-5毛細(xì)管柱(300.32mm ,膜厚0.1)。氮磷檢測(cè)器,不分流進(jìn)樣(閥關(guān)閉時(shí)間0.75min),進(jìn)樣口溫度:280,柱溫:200(1min)20/min280 (15min),載氣為高純氮(2.2ml/min),尾吹氣為高純氮(10ml/min)。2022/9/911 2.色譜條件：HP-5毛細(xì)管柱(300.32mm3.樣品預(yù)處理-酶解及萃取 取檢尿1ml,加10mg/L的羥乙基氟西泮(HEF)標(biāo)準(zhǔn)工作液10l,再加pH4.8的乙酸鹽緩沖液 50l及-葡萄糖醛酸苷酶溶液0.1l,置于55水浴中水解4冷至室溫后加 pH10.8的碳酸鹽緩沖液0.5ml及乙醚5ml,渦旋2min,離心,

7、分取上層有機(jī)相4ml置于經(jīng)硅烷化處理的帶尾管的雞心瓶中,加甲醇0.4ml,于40水浴中揮發(fā)至約0.1ml,進(jìn)樣1l進(jìn)行GC分析2022/9/9123.樣品預(yù)處理-酶解及萃取 取檢尿1ml,加1 4.方法學(xué)評(píng)價(jià)（1)選擇性: 空白尿1ml及空白尿1ml加LRZ和HEF標(biāo)準(zhǔn)液,經(jīng)酶解、萃取后進(jìn)樣分析所得色譜圖表明尿中雜質(zhì)不干擾檢測(cè).（2)線(xiàn)性試驗(yàn): 用空白尿配制不同濃度的LRZ標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行酶解、萃取、進(jìn)樣分析,將LRZ與HEF色譜峰面積的比值與LRZ在尿液中的質(zhì)量濃度進(jìn)行線(xiàn)性回歸,得到工作曲線(xiàn)方程 :Y=3.110-3X 3.010 -3 , =0.998。LRZ在尿中的濃度為50500g/L范圍內(nèi)

8、呈良好的線(xiàn)性.2022/9/913 4.方法學(xué)評(píng)價(jià)（1)選擇性: 空白尿1ml及空白尿1（3)萃取液的選擇及萃取率:作者進(jìn)行了多種溶劑萃取 LRZ的研究 ,由經(jīng)萃取與未經(jīng)萃取所得色譜峰面積 比計(jì)算LRZ的萃取率 ,得(meanSD)為(83.43.1)%。（4）檢出限:以3倍信噪比計(jì)算檢出限 ,得本法的檢出 限為5g/L。（5)回收率:由工作曲線(xiàn)計(jì)算LRZ的質(zhì)量濃度及其回收 率 ,得(meanSD)為(103.35.1)%。2022/9/914（3)萃取液的選擇及萃取率:作者進(jìn)行了多種溶劑萃取2022/5.尿液檢測(cè):志愿者口服LRZ 2后,于32小時(shí)內(nèi)收集其排泄的尿液進(jìn)行檢測(cè) ,LRZ于9h達(dá)

9、尿中最高濃度為444/L,檢測(cè)結(jié)果表明 ,本方法適合于麻醉后犯罪案件中的檢測(cè)要求。返 回2022/9/9155.尿液檢測(cè):志愿者口服LRZ 2后,于32小時(shí)內(nèi)收集建立和發(fā)展快速而靈敏的分離和測(cè)定對(duì)映體藥物方法的重要性和必要性 對(duì)某些手性藥物進(jìn)行對(duì)映體的純度檢查； 生物體液中藥物對(duì)映體的分離分析研究可探索血藥濃度與臨床療效的關(guān)系； 評(píng)價(jià)單個(gè)對(duì)映體的效價(jià)、毒性、不良反應(yīng)以及藥動(dòng)學(xué)性質(zhì)； 必要時(shí)，可進(jìn)行手性藥物對(duì)映體的制備分離。二、手性藥物的高效液相色譜法2022/9/916建立和發(fā)展快速而靈敏的分離和測(cè)定對(duì)映體藥物方法的重要性和必要（一）手性藥物拆分機(jī)理 為了使對(duì)映體轉(zhuǎn)化為化學(xué)和物理性質(zhì)不同的非對(duì)

10、映體，就要提供一種手性源，使待拆分的對(duì)映異構(gòu)體（樣品）、手性作用物（如固定相）和手性源之間形成一個(gè)非對(duì)映異構(gòu)分子的絡(luò)合物。在對(duì)映體拆分理論中頗為流行的是“三點(diǎn)手性識(shí)別模式”。2022/9/917（一）手性藥物拆分機(jī)理 為了使對(duì)映體轉(zhuǎn)化為化2022/9/9182022/9/320（二）手性HPLC拆分法的類(lèi)型直接法：柱前手性衍生化法間接法：手性流動(dòng)相拆分法、手性固定相拆分法1柱前手性衍生化法：對(duì)映體混合物以手性試劑作柱前衍生化，形成非對(duì)映體，然后以常規(guī)（偶見(jiàn)手性）固定相分離。對(duì)手性衍生化試劑的要求：高光學(xué)純度。常用的手性衍生化試劑：羧酸衍生物類(lèi)、胺類(lèi)、異硫氰酸酯類(lèi)、異氰酸酯類(lèi)、萘衍生物類(lèi)、光學(xué)活

11、性氨基酸類(lèi)、固相衍生化試劑。2022/9/919（二）手性HPLC拆分法的類(lèi)型直接法：柱前手性衍生化法間2手性流動(dòng)相拆分法（手性洗脫法或手性流動(dòng)相添加劑法）：將手性試劑加入流動(dòng)相中，手性添加劑與樣品形成手性絡(luò)合物。常用的手性添加劑：配基交換型手性添加劑、環(huán)糊精類(lèi)添加劑、手性離子對(duì)絡(luò)合劑2022/9/9202手性流動(dòng)相拆分法（手性洗脫法或手性流動(dòng)相添加劑法）：將3手性固定相拆分法：將手性選擇器（如手性流動(dòng)相添加劑）固著于多種基質(zhì)上而制成手性固定相。迄今為止，尚沒(méi)有一種通用型的手性柱，需要根據(jù)化合物的分子結(jié)構(gòu)來(lái)選擇合適的手性柱。常用的手性固定相：Pirkle型手性固定相、蛋白質(zhì)類(lèi)手性固定相、環(huán)糊精

12、類(lèi)手性固定相。2022/9/9213手性固定相拆分法：將手性選擇器（如手性流動(dòng)相添加劑）固著（三）應(yīng)用1對(duì)某些手性藥物進(jìn)行對(duì)映體的純度檢查；2生物體液中藥物對(duì)映體的分離分析研究可探 索血藥濃度與臨床療效的關(guān)系；3在研制手性藥物過(guò)程中，可分別評(píng)價(jià)單個(gè)對(duì) 映體的效價(jià)、毒性、不良反應(yīng)、藥動(dòng)學(xué)性質(zhì)；4必要時(shí)，可進(jìn)行手性藥物對(duì)映體的制備分離 （或拆分）。2022/9/922（三）應(yīng)用1對(duì)某些手性藥物進(jìn)行對(duì)映體的純度檢查；2生 示例一、左旋吡喹酮中吡喹胺的檢查（柱前手性衍生化法）手性衍生化試劑：乙酰葡萄糖異硫氰酸酯色譜條件：色譜柱 NOVA-Pack C18（150mm3.9mm） 流動(dòng)相 甲醇-0.01

13、mol/L磷酸二氫鉀 （pH2.8）（5149） 該法所用的手性衍生化試劑可以與一級(jí)胺、二級(jí)胺在溫和的條件下迅速反應(yīng)，所生成的非對(duì)映體衍生物可以在普通色譜系統(tǒng)中進(jìn)行分離分析。2022/9/923 示例一、左旋吡喹酮中吡喹胺的檢查（柱前手性衍生化法）示例二、DL-色氨酸的拆分（手性流動(dòng)相拆分法）色譜條件：色譜柱 Zorbax ODS（250mm4.6mm），流動(dòng)相 含有0.15%L-苯丙氨酸及0.11%硫酸銅（CuSO45H2O）水溶液（以0.05mol/L硫酸調(diào)pH至3.0）-甲醇（91）（流動(dòng)相中L-苯丙氨酸及硫酸銅濃度分別為0.008mol/L和0.004mol/L）。 流動(dòng)相中L-苯丙氨

14、酸為配基交換型手性添加劑，硫酸銅為二價(jià)金屬螯離子，L-苯丙氨酸與銅離子螯合，分布于流動(dòng)相中，遇到色氨酸對(duì)映體，共同形成配位絡(luò)合物對(duì)，然后在反相柱上拆分。2022/9/924示例二、DL-色氨酸的拆分（手性流動(dòng)相拆分法）色譜條件：示例三、克侖特羅對(duì)映體的拆分（手性固定相拆分法）色譜條件：色譜柱 Chirex 3005手性色譜柱 （R）-1-萘基甘氨酸和3，5-二硝基 苯甲酸以共價(jià)鍵結(jié)合流動(dòng)相 正己烷-二氯乙烷-甲醇該法的拆分機(jī)理為“三點(diǎn)手性識(shí)別模式”。返 回2022/9/925示例三、克侖特羅對(duì)映體的拆分（手性固定相拆分法）色譜條件 三、毛細(xì)管電泳分析法 （一）簡(jiǎn)介 1高效 2高速 3微量 4低

15、消耗 （二）主要分離模式 1毛細(xì)管區(qū)帶電泳（capillary zone electrophoresis，CZE ） 在電解質(zhì)溶液中，帶電粒子在電場(chǎng)作用下，以不同速度向其所帶電荷相反方向遷移，產(chǎn)生泳流。 2022/9/926 三、毛細(xì)管電泳分析法2022/9/3282膠束電動(dòng)毛細(xì)管色譜（micellar electrokinetic capillary chromatography，MECC）或MEKC） 在緩沖液中加入離子型表面活性劑，形成膠束。被分離物質(zhì)在水和膠束兩相分配，各溶質(zhì)在因分配系數(shù)存在差別而被分離。3. 毛細(xì)管凝膠電泳（capollary gel electrophoresis,

16、 CGE）毛細(xì)管中裝入單體和引發(fā)劑引發(fā)聚合反應(yīng)生成凝膠作支持物進(jìn)行的電泳。2022/9/9272膠束電動(dòng)毛細(xì)管色譜（micellar electroki4. 毛細(xì)管等速電泳（capillary isotachor-phoresis, CITP）采用前導(dǎo)電解質(zhì)和尾隨電解質(zhì)，在毛細(xì)管中充入前導(dǎo)電解質(zhì)后，進(jìn)樣，電極槽中換用尾隨電解質(zhì)進(jìn)行電泳分析，帶不同電荷的組分遷移至各個(gè)狹窄的區(qū)帶，然后依次通過(guò)檢測(cè)器。5. 毛細(xì)管電色譜（capillary electrochromatography, CEC）將細(xì)粒徑固定相填充到毛細(xì)管中或在毛細(xì)管內(nèi)壁涂覆固定相以電滲流驅(qū)動(dòng)操作緩沖液進(jìn)行分離。2022/9/9284

17、. 毛細(xì)管等速電泳（capillary isotachor6. 毛細(xì)管等電聚焦電泳（capillary isoelectric focusing, CIEF）將毛細(xì)管內(nèi)壁涂覆聚合物減少電滲流，再將供試品和兩性電解質(zhì)混合進(jìn)樣，兩個(gè)電極槽中分別加入酸液和堿液，施加壓力后毛細(xì)管中操作電解質(zhì)溶液逐步形成pH梯度，各溶質(zhì)在毛細(xì)管中遷移至各自的等電點(diǎn)時(shí)變?yōu)橹行孕纬删劢沟膮^(qū)帶，而后用壓力或改變檢測(cè)器末端電極槽儲(chǔ)液的pH值得方法使溶質(zhì)通過(guò)檢測(cè)器。2022/9/9296. 毛細(xì)管等電聚焦電泳（capillary isoelec第二節(jié) 藥物現(xiàn)代光譜法及其應(yīng)用一、近紅外分光光度法（一）方法特點(diǎn) 1可獲得一系列的物理

18、性質(zhì)的信息 2樣品無(wú)需預(yù)處理 3分析速度快 3毛細(xì)管凝膠電泳（capillary gel electrophoresis，CGE ） 4毛細(xì)管等電聚焦（capillary isoelectric focusing，CIEF）（三）HPCE 在藥物分析中的應(yīng)用2022/9/930第二節(jié) 藥物現(xiàn)代光譜法及其應(yīng)用 3毛細(xì) 4靈敏度高 5運(yùn)用范圍廣 6便于在線(xiàn)分析和控制（二）常見(jiàn)的NIR吸收波長(zhǎng)及其結(jié)構(gòu)歸屬（三）應(yīng)用 1鑒別 2純度檢查 3含量測(cè)定二、核磁共振光譜分析法（一）簡(jiǎn)述（二）定量分析方法2022/9/931 4靈敏度高2022/9/333 1方法特點(diǎn) 2測(cè)定方法（三）應(yīng)用示列 1鹽酸普魯卡因

19、的結(jié)構(gòu)堅(jiān)鑒定 2植物中藥及其偽品的區(qū)別 3亞硝酸戊酯（amyl nitrite）及其吸入劑（amyl nitriteinhalant）的含量測(cè)定（USP24） 三、x 射線(xiàn)粉末衍射法（一）x 射線(xiàn)簡(jiǎn)介（二）布拉格方程（三）x 射線(xiàn)衍射儀的工作原理（四）應(yīng)用2022/9/932 1方法特點(diǎn)2022/9/334第三節(jié) 色譜聯(lián)用技術(shù)及其應(yīng)用一、氣相色譜-紅外光譜聯(lián)用技術(shù)（一）簡(jiǎn)介（二）GC-FTIR 系統(tǒng)組成與光譜檢索（三）應(yīng)用示列二、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（一）簡(jiǎn)述（二）色譜柱（三）接口2022/9/933第三節(jié) 色譜聯(lián)用技術(shù)及其應(yīng)用2022/9/335（四）定量分析方法 1總離子流色譜法 2質(zhì)量

20、碎片圖質(zhì)譜法（五）應(yīng)用示列 1固相萃取結(jié)合GC-MS 系統(tǒng)分離生 物體液中常見(jiàn)毒物藥物 2GC-MS測(cè)定冰片的川芎嗪血藥濃度三、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（一）概述2022/9/934（四）定量分析方法2022/9/336（二）接口裝置 1粒子束（partical beam ）接口 2熱噴霧（TSP ）接口 3大氣壓離子化（API）接口 4動(dòng)態(tài)快原子轟擊法（FAB ）（三）應(yīng)用示列 1區(qū)安奈德中特殊雜質(zhì)的檢查 2血樣和尿樣中秋水仙堿的 LC-ISP-MS 定性定量分析2022/9/935（二）接口裝置2022/9/337四、液相色譜-核磁共振聯(lián)用技術(shù)（一）方法特點(diǎn)（二）基本操作模式 1連續(xù)流動(dòng)（on-flow ）操作模式 2停流（stop flow）操作模式 3峰存貯藏操作模式（三）應(yīng)用示列2022/9/936四、液相色譜-核磁共振聯(lián)用技術(shù)2022/9/338三、核磁共振光譜分析法 核磁共振光譜廣泛用于化合物的結(jié)構(gòu)分析，而其在化合物的定