免疫化學(xué)實(shí)驗(yàn)操作指導(dǎo)書(shū)：酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)

1、PAGE PAGE 271實(shí)驗(yàn)(八) 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(enzyme-linked immunosorbent assay 簡(jiǎn)稱(chēng)ELISA)是在免疫酶技術(shù)(immunoenzymatic techniques)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一種新型的免疫測(cè)定技術(shù),ELISA過(guò)程包括抗原(抗體)吸附在固相載體上稱(chēng)為包被，加待測(cè)抗體(抗原), 再加相應(yīng)酶標(biāo)記抗體(抗原),生成抗原(抗體)-待測(cè)抗體(抗原)-酶標(biāo)記抗體的復(fù)合物，再與該酶的底物反應(yīng)生成有色產(chǎn)物。借助分光光度計(jì)的光吸收計(jì)算抗體(抗原)的量。待測(cè)抗體(抗原)的定量與有色產(chǎn)生成正比。一 酶的交聯(lián)用于免疫酶技術(shù)的酶有很多，如過(guò)氧化物酶，堿

2、性磷酸酯酶，半乳糖苷酶，葡萄糖氧化酶，碳酸酐酶，乙酰膽堿酯酶，6磷酸葡萄糖脫氧酶等。常用于ELISA法的酶有辣根過(guò)氧化物酶，堿性磷酸酯酶等，其中尤以辣根過(guò)氧化物酶為多。由于酶摧化的是氧化還原反應(yīng)，在呈色后須立刻測(cè)定，否則空氣中的氧化作用使顏色加深，無(wú)法準(zhǔn)確地定量。辣根過(guò)氧化物酶交聯(lián)在抗體上的方法主要有兩種，即戊二醛法和過(guò)碘酸氧化法。 1戊二醛法戊二醛作為雙活性試劑可將酶與抗體交聯(lián)在一起，但戊二醛與蛋白質(zhì)反應(yīng)的機(jī)理各說(shuō)不一，有的認(rèn)為可能形成Michael加合物：也有人認(rèn)為可能是產(chǎn)生不飽合醛，再與NH2反應(yīng)成雙Schiff堿蛋白衍生物：戊二醛交聯(lián)法有一步法和二步法之分。一步交聯(lián)法是把一定量的酶，抗

3、體和戊二醛同加入溶液中，在一定溫度下反應(yīng)一段時(shí)間，然后用透析法或凝膠過(guò)濾除去未結(jié)合的戊二醛即可得到酶結(jié)合物。在蛋白質(zhì)與戊二醛的交聯(lián)反應(yīng)中，蛋白質(zhì)賴(lài)氨酸基團(tuán)是戊二醛最可能的反應(yīng)部位，組成辣根過(guò)氧化物酶（HRP）的300多個(gè)氨基酸中只有6個(gè)賴(lài)氨酸。市售的HRP中，只有12個(gè)賴(lài)氨酸基團(tuán)可供交聯(lián)，而抗體分子中，賴(lài)氨酸基團(tuán)含量要大得多，因此在一步交聯(lián)中，HRP反應(yīng)性不強(qiáng)，抗體分子在戊二醛作用下易形成聚合物，因此交聯(lián)反應(yīng)后必須用50飽和硫酸銨沉淀或用凝膠過(guò)濾除去聚合物。一步法酶結(jié)合物產(chǎn)率僅67，其中HRP約占5。在正常情況下，HRP只有一個(gè)戊二醛分子的一個(gè)醛基反應(yīng)，而第二個(gè)醛基不能與同一個(gè)或其他酶反應(yīng)，即

4、不發(fā)生聚合，故可將戊二醛先與HRP反應(yīng)，透析除去未反應(yīng)的戊二醛，再加入抗體，這樣就不會(huì)產(chǎn)生聚合現(xiàn)象，此為二部交聯(lián)法。產(chǎn)生的酶結(jié)合物中，其酶和抗體的mol比接近1：1，標(biāo)記活性的損失比一步法少，但該法效率也不高，僅有25的HRP標(biāo)記在抗體分子上，標(biāo)記的抗體只占25，酶結(jié)合物的產(chǎn)率僅為1015。在實(shí)際運(yùn)用中，酶與抗體mol比在12之間為宜，但未標(biāo)記的抗體嚴(yán)重干擾檢測(cè)結(jié)果，常用聚丙烯酰胺瓊脂糖凝膠(Ultrogel ACA-4A)過(guò)濾法除去未標(biāo)記的抗體，無(wú)上述凝膠，也可Sephadex G-200代替。 2過(guò)碘酸鹽氧化法辣根過(guò)氧化物酶是一種帶糖的酶。糖含量約占18，過(guò)碘酸鹽可將糖中的羥基氧化成醛基，

5、再與抗體直接連接。然后加硼氫化鈉還原形成穩(wěn)定的酶結(jié)合物。該法交聯(lián)效果比戊二醛法好，結(jié)合物中HRP與抗體的mol比在23之間，參與酶結(jié)合物中的HRP可達(dá)70，而抗體則可達(dá)99。但在標(biāo)記過(guò)程中，酶活性和抗體的免疫活性損失較多。 用戊二醛交聯(lián)時(shí)，戊二醛的質(zhì)量至關(guān)重要。戊二醛易揮發(fā)，久置可發(fā)生聚合和氧化，降低交聯(lián)作用。由于戊二醛單體的光吸收峰是280nm，而聚合體則在235nm，故新鮮的，保存得法的戊二醛其A235/A280nm的比值小于3。戊二醛應(yīng)避光.低溫保存。 辣根過(guò)氧化物酶（HRP）是一種糖蛋白，每個(gè)分子含有一個(gè)氯化血紅素(protonhemin)區(qū)作輔基。酶的濃度和純度常以輔基的含量表示。氯

6、化血紅素輔基的最大吸收峰是403nm，HRP酶蛋白的最大吸收峰是275nm，所以酶的濃度和純度計(jì)算式是酶結(jié)合物的A(1cm 403nm)稀釋倍數(shù) HRP的A(1cm 403nm)酶結(jié)合物中HRP濃度(mg/ml) 酶結(jié)合物的A(1cm 403nm) 0.4稀釋倍數(shù)（已知HRP的A(1cm 403nm 1%)25，式中1指HRP百分濃度為100ml含酶蛋白1g，即10mg/ml，所以，酶濃度以 mg/ml 計(jì)算是HRP的A(1cm 403nm mg/ml=2.5)HRP純度(RZ)=A403nm/A275nm純度RZ（einheit Zahl）值越大說(shuō)明酶內(nèi)所含雜質(zhì)越少。高純度HRP的RZ值在3

7、.0左右，最高可達(dá)3.4。用于ELISA檢測(cè)的HRP的RZ值要求在3.0以上。二 酶與底物酶結(jié)合物是酶與抗體或抗原, 半抗原在交聯(lián)劑作用下聯(lián)結(jié)的產(chǎn)物。是ELISA成敗的關(guān)鍵試劑，它不僅具有抗體抗原特異的免疫反應(yīng)，還具有酶促反應(yīng)，顯示出生物放大作用，但不同的酶選用不同的底物。免疫技術(shù)常用的酶及其底物酶底 物顯色反應(yīng)測(cè)定波長(zhǎng)/(nm)辣根過(guò)氧化物酶(HRP) 鄰苯二胺(OPD)3.3.5.5四甲替聯(lián)苯胺(TMB)5-氨基水楊酸(5-AS)鄰聯(lián)苯甲胺(OT)2,2-連胺基-2(3-乙基-并噻唑啉磺酸-6)銨鹽(ABTS)橘紅色黃色棕色蘭色藍(lán)綠色492*, 460*450449425642堿性磷酸酯酶

8、4-硝基酚磷酸鹽(PNP)萘酚-ASMx磷酸鹽+重氮鹽黃色紅色400500葡萄糖氧化酶ABTS+HRP+葡萄糖葡萄糖+甲硫酚嗪+噻唑蘭黃色深藍(lán)色405,420-半乳糖苷酶4-甲基傘酮基-半乳糖苷(4MuG)硝基酚半乳糖苷(ONPG)熒光黃色360,450420 * 終止劑為2mol/L H2SO4 * 終止劑為2 mol/L檸檬酸， 不同的底物有不同的終止劑?？纱呋铝蟹磻?yīng)：HRP+H2O2復(fù)合物復(fù)合物+AH2過(guò)氧化物酶+H2O+AAH2 為無(wú)色底物, 供氫體； A 為有色產(chǎn)物。三 ELISA常用的四種方法直接法測(cè)定抗原將抗原吸附在載體表面；加酶標(biāo)抗體，形成抗原抗體復(fù)合物；C. 加底物。底物的

9、降解量抗原量。 2間接法測(cè)定抗體將抗原吸附于固相載體表面；加抗體, 形成抗原-抗體復(fù)合物; 加酶標(biāo)抗體；D. 加底物。 測(cè)定底物的降解量抗體量。 3雙抗體夾心法測(cè)定抗原將抗原免疫第一種動(dòng)物獲得的抗體吸附于固相表面; 加抗原，形成抗原-抗體復(fù)合物; 加抗原免疫第二種動(dòng)物獲得的抗體，形成抗體抗原抗體復(fù)合物; 加酶標(biāo)抗抗體(第二種動(dòng)物抗體的抗體); E. 加底物。底物的降解量抗原量。 4. 競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)定抗原將抗體吸附在固相載體表面; B.(1) 加入酶標(biāo)抗原； B.(2),(3)加入酶標(biāo)抗原和待測(cè)抗原； C. 加底物。對(duì)照孔與樣品孔底物降解量的差未知抗原量。四. 操作步驟1. 包被抗原：用包被液將抗原

10、作適當(dāng)稀釋, 一般為110微克/孔，每孔加200微升，37溫育1小時(shí)后，4冰箱放置1618小時(shí)。 2. 洗滌：倒盡板孔中液體，加滿洗滌液，靜放三分鐘，反復(fù)三次，最后將反應(yīng)板倒置在吸水紙上，使孔中洗滌液流盡。 3. 加封閉液200微升，37放置一小時(shí)。 4. 洗滌同2。 5. 加被檢血清：用稀釋液將被檢血清作幾種稀釋,，每孔200微升。同時(shí)作稀釋液對(duì)照。37放置2小時(shí)。 6. 洗滌同2。 7. 加辣根過(guò)氧化物酶羊抗兔IgG, 每孔200微升, 放置37 1小時(shí)。 8. 洗滌同2。 9. 加底物：鄰苯二胺溶液加200ml，室溫暗處10-15分鐘。 10. 加終止液：每孔50微升。 11. 觀察結(jié)果：用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀記錄490nm讀數(shù)。五. 儀器和材料 1. 聚苯乙烯微量細(xì)胞培養(yǎng)板(平板, 40, 96孔)。 2. 酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀 3. 辣根過(guò)氧化物酶羊抗兔IgG, 工作稀釋度1:1000。4. 包被液:：0.05mol/L pH9.6碳酸緩沖液,4，保存,Na2CO3 0.15克, NaHCO3 0.293克,蒸餾水稀釋至100 ml。5. 稀釋液：0.01mol/LpH7.4 PBS-Tween-20, ，保存. NaCl 8g, KH2PO4 0.2g, Na2HPO4.12H2O 2.9g, Tween20，0.5ml. 蒸餾水加至1000ml。6. 洗滌液：同稀釋液7. 封