細(xì)菌內(nèi)毒素致WHBE兔致熱敏感性的研究

1、細(xì)菌內(nèi)毒素致WHBE兔致熱敏感性的研究基金項(xiàng)目1、浙江省教育廳一般項(xiàng)目（Y201121693） ; 2、受“浙江省衛(wèi)生高層次創(chuàng)新人才培養(yǎng)工程項(xiàng)目”資助。作者簡(jiǎn)介徐劍欽( 1980 ) ，男，實(shí)驗(yàn)師，研究方向: 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)與實(shí)驗(yàn)技術(shù)，E-mail:xujianqing1 。通訊作者陳民利( 1963 ) ，女，教授，研究方向: 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與比較醫(yī)學(xué)，E-mail: minlichen01 徐劍欽1,2，潘永明2，陳 誠(chéng)2，黃 宇2，呂建敏2，陳民利2（1.浙江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，杭州，310029；2.浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中心，杭州，310053）摘要 目的 探討不同劑量的細(xì)菌內(nèi)毒素對(duì)WHB

2、E兔致熱反應(yīng)的敏感性。方法 靜脈注射不同劑量（1.25、2.5、5、10 EU/kg）細(xì)菌內(nèi)毒素誘發(fā)WHBE兔和日本大耳白兔發(fā)熱反應(yīng)，并設(shè)空白對(duì)照組，記錄升溫曲線(xiàn)圖，計(jì)算發(fā)熱峰值、180min時(shí)體溫差、發(fā)熱指數(shù)以及升溫率，并通過(guò)曲線(xiàn)擬合計(jì)算出體溫升高0.6時(shí)的發(fā)熱閾值。結(jié)果 隨細(xì)菌內(nèi)毒素注射劑量的增加致WHBE兔和日本大耳白兔的發(fā)熱反應(yīng)增強(qiáng)，性別因素對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素所致WHBE兔和日本大耳白兔發(fā)熱反應(yīng)無(wú)明顯影響（P0.05）。5EU/kg和10EU/kg的細(xì)菌內(nèi)毒素所致WHBE兔的致熱反應(yīng)均高于日本大耳白兔，且WHBE兔的升溫率分別為60.7%和92.9%，日本大耳白兔的升溫率分別為39.3%和8

3、2.1%。另外，WHBE兔和日本大耳白兔的發(fā)熱閾值分別為5.72EU/kg和 7.93 EU/kg。 結(jié)論 細(xì)菌內(nèi)毒素對(duì)WHBE兔具有較好的致熱敏感性，適于致熱原物質(zhì)的檢查。關(guān)鍵詞 WHBE兔；細(xì)菌內(nèi)毒素；熱原；敏感性中圖分類(lèi)號(hào) R-332Study on the sensitivity of WHBE rabbits response to bacterial endotoxinXU Jian-qin, PAN Yong-ming, CHEN Chen, HUANG Yu , LV Jian-ming, CHEN Min-li (1 Zhejiang University College o

4、f Animal Science, Hangzhou 31000,2 Zhejiang Chinese Medical University Laboratory Animal Research Center/Comparative Medical Research Center, Hangzhou, 310053, Chnia)Abstract Objective To explore the sensitivity response to bacterial endotoxin of WHBE rabbits. Methods The fever was studied after the

5、 WHBE rabbits and Japanese white rabbits were intravenously injected bacterial endotoxin in different doses (1.25, 2.5, 5, 10 EU/kg), and on the normal rabbits as the control group. Heating curves were drew, and analyzed the fever peak, the temperature difference at 180min, temperature response inde

6、x and heating rate. Through curve fitting the fever threshold doses were calculated. Results The results of the study showed that the increase of bacterial endotoxin dosage had a promotive effect on the febrile response of the rabbits. It had no significant influence on gender factor for the febrile

7、 response of the WHBE rabbits and Japanese white rabbits induced by bacterial endotoxin. 5 EU/kg and 10 EU/kg dosages of bacterial endotoxin-induced pyrogenic reactions on WHBE rabbits were higher than those of Japanese white rabbits, and the heating rates of WHBE rabbits were 60.7% and 92.9%, while

8、 the heating rates of Japanese white rabbits were 39.3% and 82.1%. Furthermore, the pyrogenic threshold doses of endotoxin in WHBE rabbits and Japanese white rabbits were 5.72 EU/kg and 7.93 EU/kg after intravenous injection. Conclusion WHBE rabbits had better sensitivity on pyrogenic reactions indu

9、ced by bacterial endotoxin and are suitable to pyrogen test. Key words WHBE rabbit; Bacterial endotoxin; Pyrogen test;Sensitivity熱原試驗(yàn)?zāi)苤苯涌陀^的反映出各種致熱原物質(zhì)在機(jī)體中的反應(yīng)，是當(dāng)前藥品、醫(yī)療器械或材料浸提液安全性檢測(cè)的重要項(xiàng)目之一。自從1923年Seibert提出家兔熱原檢測(cè)法，到1942年美國(guó)將家兔熱原檢查法載入藥典之后，為保障藥品質(zhì)量和安全性起了重要的作用1。此后，各國(guó)藥典也相繼明確規(guī)定了藥品的熱原檢查項(xiàng)目，但目前對(duì)熱原的認(rèn)識(shí)和本質(zhì)闡述仍沒(méi)有統(tǒng)一，一般

10、普遍認(rèn)為熱原主要來(lái)源于細(xì)菌內(nèi)毒素所致體溫異常升高為主，現(xiàn)今隨著生物材料和醫(yī)療器械致熱物質(zhì)檢查研究的深入，顯示致熱物質(zhì)不僅僅是細(xì)菌性熱原，還包括了內(nèi)源性高分子熱原、內(nèi)源性低分子熱原及化學(xué)熱原等非細(xì)菌內(nèi)毒素?zé)嵩??？梢?jiàn)，對(duì)熱原質(zhì)的檢測(cè)仍還處于討論之中。當(dāng)前熱原檢查法主要為兔法、鱟試劑法、細(xì)胞法等2。鱟試劑法雖簡(jiǎn)單、方便、快速和靈敏，但對(duì)革蘭氏陰性菌以外的內(nèi)毒素不夠靈敏，細(xì)胞法操作簡(jiǎn)單可行、能模擬人體對(duì)熱原的反應(yīng)且能定量或半定量，但存在標(biāo)準(zhǔn)品缺乏、對(duì)人的致熱閾值的限定不清楚、而且對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)有干擾的不易用該法等局限性2，因此，采用家兔法不僅能檢測(cè)出細(xì)菌內(nèi)毒素的致熱原，也能檢查出非細(xì)菌性?xún)?nèi)毒素的致熱原，是

11、一種經(jīng)典的檢測(cè)方法。但近來(lái)研究表明，影響家兔法檢測(cè)結(jié)果的因素眾多，諸如環(huán)境因素、試驗(yàn)用兔的質(zhì)量、使用重復(fù)次數(shù)等。WHBE（白毛黑眼）兔是從日本大耳白兔生產(chǎn)群中發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)多年選育培育而成，已形成了遺傳穩(wěn)定、形態(tài)特征鮮明、生產(chǎn)性能穩(wěn)定的品系，在生物醫(yī)學(xué)研究中具有特殊的應(yīng)用價(jià)值。本課題組前期已探討了WHBE兔用于熱原檢查試驗(yàn)的適用性，顯示W(wǎng)HBE兔的體溫穩(wěn)定，一次性篩選合格率高，重復(fù)性好，適合于熱原檢查3。為進(jìn)一步證實(shí)WHBE兔對(duì)熱原檢查的敏感性，本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)不同劑量細(xì)菌內(nèi)毒素所致WHBE兔致熱敏感性的分析，并與日本大耳白兔比較，以探討WHBE兔在熱原檢測(cè)中是否具有較高的敏感性，為WHBE兔在熱原檢

12、測(cè)中的應(yīng)用提供依據(jù)。1.材料和方法1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物按照中國(guó)藥典2010年（二部）附錄XID熱原檢查法相關(guān)要求進(jìn)行篩選實(shí)驗(yàn)兔，選擇8次體溫在38.439.5范圍內(nèi)，最高溫與最低溫相差不超過(guò)0.4的動(dòng)物，共計(jì)196只，其中普通級(jí)WHBE兔98只、日本大耳白兔98只，體重：1.9-2.4kg，雌雄各半，來(lái)源于新昌縣大市聚鎮(zhèn)興達(dá)兔場(chǎng)提供【SCXK（浙）2009-0042】。單籠飼養(yǎng)，自由采食和飲水，24h明暗交替，環(huán)境溫度為211，相對(duì)濕度為50%10%，飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中心實(shí)驗(yàn)兔飼養(yǎng)室【SYXK（浙）2008-0116】。1.2儀器與試劑ZRY-2D智能熱原測(cè)溫儀，天津大學(xué)無(wú)線(xiàn)電制造。

13、細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品（批號(hào)：1205040，規(guī)格：10EU/支，有效期：2015年4月），由湛江安度斯生物有限公司生產(chǎn)。1.3動(dòng)物分組隨機(jī)將WHBE兔和日本大耳白兔各分成5組，即空白對(duì)照組12只，細(xì)菌內(nèi)毒素 1.25EU/kg劑量組12只，細(xì)菌內(nèi)毒素2.5 EU/kg劑量組18只，細(xì)菌內(nèi)毒素5EU/kg和10EU/kg劑量組各28只，雌雄各半，其中空白對(duì)照組在耳緣靜脈注射1mL/kg滅菌注射用水，其余各組均在耳緣靜脈注射1mL/kg的相應(yīng)細(xì)菌內(nèi)毒素的溶液。1.4測(cè)溫方法實(shí)驗(yàn)兔禁食后，并置于兔固定裝置中，將測(cè)溫探頭插入直腸內(nèi)6cm，固定尾部。用ZRY-2D智能熱原測(cè)溫儀每30min記錄一次體溫，

14、實(shí)驗(yàn)室環(huán)境溫度為211。實(shí)驗(yàn)兔給藥前連續(xù)2次測(cè)定體溫，當(dāng)2次體溫之差沒(méi)有超過(guò)0.2時(shí)，取其平均值為初始體溫。隨后按1mL/kg耳緣靜脈注射給予相應(yīng)細(xì)菌內(nèi)毒素溶液或滅菌注射用水，觀察給藥前后實(shí)驗(yàn)兔的一般情況和體溫變化，連續(xù)觀察3h。計(jì)算發(fā)熱峰值：發(fā)熱時(shí)最高體溫減去基礎(chǔ)體溫；180min時(shí)體溫差：180min時(shí)試劑體溫與基礎(chǔ)體溫的差值；發(fā)熱指數(shù)（TRI）：指體溫反應(yīng)曲線(xiàn)與基線(xiàn)之間的面積，橫坐標(biāo)1cm表示30min，縱坐標(biāo)1cm代表0.2。升溫率（最大升溫0.6動(dòng)物的百分率）。1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件，所有數(shù)據(jù)均用（SEM）表示，組間比較采用LSD-t檢驗(yàn)。2.結(jié)果2.1實(shí)驗(yàn)

15、兔的一般情況空白對(duì)照組全過(guò)程未見(jiàn)明顯的異常狀態(tài)，給予1.25EU/kg 和2.5EU/kg 的細(xì)菌內(nèi)毒素劑量組實(shí)驗(yàn)兔的精神狀況尚可，但呼吸有所加快；而5.0EU/kg 和10 EU/kg 的細(xì)菌內(nèi)毒素劑量組實(shí)驗(yàn)兔出現(xiàn)呼吸加快明顯、變淺、耳廓紅熱，精神相對(duì)有所萎靡。2.2不同劑量細(xì)菌內(nèi)毒素所致不同性別WHBE兔和日本大耳白兔發(fā)熱峰值的影響與空白對(duì)照組比，給予1.2510 EU/kg的細(xì)菌內(nèi)毒素后，不同性別的WHBE兔和日本大耳白兔的發(fā)熱峰值均呈劑量依賴(lài)性的升高，其中給予5.0 EU/kg和10 EU/kg的細(xì)菌內(nèi)毒素組雌性和雄性WHBE兔發(fā)熱峰值均升高顯著（P0.01）；另外，5.0 EU/kg

16、和10 EU/kg的細(xì)菌內(nèi)毒素組雌性JW兔發(fā)熱峰值升高顯著（P0.01），且雄性JW兔給予2.510EU/kg 的細(xì)菌內(nèi)毒素后發(fā)熱峰值亦顯著升高（P0.05，P0.05），見(jiàn)圖1。從升溫率看，1.25EU/kg和2.5EU/kg的細(xì)菌內(nèi)毒素對(duì)不同性別的WHBE兔或日本大耳白兔的升溫率均為0%，但5EU/kg的細(xì)菌內(nèi)毒素對(duì)雌雄和雄性WHBE兔的升溫率分別為57.1%、64.3%，對(duì)日本大耳白兔的升溫率分別為42.9%、35.7%；10EU/kg的細(xì)菌內(nèi)毒素對(duì)雌雄和雄性WHBE兔的升溫率分別為92.9%、92.9%，對(duì)日本大耳白兔的升溫率分別為85.7%、78.6%。注：與空白對(duì)照（control

17、）組比，*P0.05，* P0.01；雌性與雄性間比，# P0.05，# P0.01.Note: compared with control, *P0.05, * P0.01; compared between female and male, # P0.05, # P0.01.圖1 不同劑量細(xì)菌內(nèi)毒素所致不同性別WHBE兔和JW兔的發(fā)熱峰值的影響Fig.1 The effects of different doses of bacterial endotoxin on fever peak in different gender of WHBE rabbits and JW rabbits2

18、.3不同劑量細(xì)菌內(nèi)毒素所致WHBE兔和日本大耳白兔升溫反應(yīng)的比較1.2510 EU/kg的細(xì)菌內(nèi)毒素所致WHBE兔和日本大耳白兔升溫反應(yīng)強(qiáng)度隨劑量的升高而逐漸升高，見(jiàn)圖2。與空白對(duì)照組比，除1.25EU/kg 的細(xì)菌內(nèi)毒素劑量組外，其它劑量的細(xì)菌內(nèi)毒素所致WHBE兔和日本大耳白兔發(fā)熱高峰值、180min時(shí)體溫差均顯著高于空白對(duì)照組（P0.05，P0.01），且5 EU/kg 和10 EU/kg 的細(xì)菌內(nèi)毒素劑量組的發(fā)熱指數(shù)均顯著高于空白對(duì)照組（P0.01）。與日本大耳白兔比較，5 EU/kg 的細(xì)菌內(nèi)毒素劑量組的WHBE兔180min時(shí)體溫差和發(fā)熱指數(shù)均顯著高于日本大耳白兔（P0.05，P0.

19、01），并且10 EU/kg 的細(xì)菌內(nèi)毒素劑量組的WHBE兔的發(fā)熱高峰值亦顯著高于日本大耳白兔（P0.01），5EU/kg和10EU/kg的細(xì)菌內(nèi)毒素所致WHBE兔的升溫率分別為60.7%和92.9%，日本大耳白兔的升溫率分別為39.3%和82.1%，見(jiàn)表1。圖2 不同劑量的細(xì)菌內(nèi)毒素所致WHBE兔和JW兔的體溫反應(yīng)變化Fig.2 The changes of temperature response induced by different doses of bacterial endotoxin in WHBE rabbits and JW rabbits表1 不同劑量的細(xì)菌內(nèi)毒素所致WH

20、BE兔和JW兔體溫差、發(fā)熱指數(shù)和升溫率的影響Tab.1 The effects of different doses of bacterial endotoxin on temperature difference, temperature response index and heating rate in WHBE rabbits and JW rabbits品系組別動(dòng)物數(shù)（只）發(fā)熱高峰值（）180min時(shí)體溫差（）發(fā)熱指數(shù)（cm2）升溫?cái)?shù)（升溫率）WHBE兔空白對(duì)照組120.1200.025-0.0750.0503.0000.598-細(xì)菌內(nèi)毒素1.25 EU/kg120.1030.027

21、-0.2110.0202.3690.1940（0%）2.5EU/kg180.2340.029*0.1080.049*3.4550.4340（0%）5EU/kg280.6200.033*0.4430.036*12.0180.657*17（60.7%）10 EU/kg280.7760.036*0.4400.032*13.9510.764*26（92.9%）JW兔空白對(duì)照組120.1160.031-0.0240.0422.6950.468-細(xì)菌內(nèi)毒素1.25 EU/kg120.1670.0220.0580.0592.5700.3880（0%）2.5EU/kg180.2540.037*0.1350.0

22、38*4.2430.6270（0%）5EU/kg280.4990.035*#0.3110.039*#8.8070.738*#11（39.3%）10 EU/kg280.6670.030*#0.4700.044*12.8250.637*23（82.1%）注：與空白對(duì)照（control）組比，*P0.05，*P0.01；與JW兔比，# P0.05，# P0.01.Note: compared with control, *P0.05, * P0.01; compared between female and male, # P0.05, # P0.01.2.4 細(xì)菌內(nèi)毒素對(duì)WHBE兔和日本大耳白兔發(fā)

23、熱閾值的影響靜脈注射不同劑量的細(xì)菌內(nèi)毒素后所致WHBE兔和日本大耳白兔升溫反應(yīng)的關(guān)系方程分別為：WHBE兔 T=0.3473Ln(E)-0.0054，R2=0.960；JW 兔 T=0.2518Ln(E)+0.0786，R2=0.972，其中T和E分別表示升溫值和細(xì)菌內(nèi)毒素的劑量，見(jiàn)圖3。由此算出T=0.6時(shí)，WHBE兔和日本大耳白兔的發(fā)熱閾值分別為5.72EU/kg和 7.93 EU/kg。圖3 細(xì)菌內(nèi)毒素對(duì)WHBE兔和日本大耳白兔發(fā)熱閾值的影響Fig.3 Effect of bacterial endotoxin on pyrogenic threshold doses in WHBE r

24、abbits and JW rabbits3. 討論近來(lái)研究表明，不同品種、來(lái)源的家兔對(duì)熱原的敏感性存在差異4,5，甚至相差10倍6，同時(shí)，實(shí)驗(yàn)兔對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素的敏感性直接決定了結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性，且關(guān)系到臨床用藥的安全，因此，篩選和使用高敏感性的實(shí)驗(yàn)兔，對(duì)保障臨床用藥安全具有重要作用。另外，也有學(xué)者發(fā)現(xiàn)熱原檢查中使用基礎(chǔ)體溫低于38.4的家兔易出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果7。因此，在本試驗(yàn)中根據(jù)WHBE兔的體溫范圍，選擇體溫為38.439.5的試驗(yàn)兔，并將檢測(cè)環(huán)境溫度控制在2123，避免了試驗(yàn)兔本身、環(huán)境因素的影響，確保研究結(jié)果的準(zhǔn)確性。但亦有研究顯示，不同家兔性別對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素的敏感性可能存在差異8，本試

25、驗(yàn)的結(jié)果顯示，不同性別的WHBE兔和日本大耳白兔對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素的敏感性未見(jiàn)明顯的差異，這可能與實(shí)驗(yàn)兔的來(lái)源有關(guān)，因?yàn)楸驹囼?yàn)的兔子均來(lái)自同一來(lái)源場(chǎng)地，有著良好的管理和飼養(yǎng)環(huán)境，確保試驗(yàn)兔的健康狀態(tài)一致性，同時(shí)，結(jié)果顯示雌性或雄性試驗(yàn)兔對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素的致熱反應(yīng)均呈劑量依賴(lài)性的升高，均表現(xiàn)出良好的致熱反應(yīng)，可見(jiàn)，在確保健康的試驗(yàn)兔下，性別因素對(duì)熱原檢測(cè)的差異反應(yīng)不明顯。從細(xì)菌內(nèi)毒素的劑量所致兔的熱效應(yīng)來(lái)看，1.25 EU/kg的細(xì)菌內(nèi)毒素對(duì)實(shí)驗(yàn)兔的致熱反應(yīng)不明顯，而2.5 EU/kg的細(xì)菌內(nèi)毒素對(duì)實(shí)驗(yàn)兔的致熱反應(yīng)雖有明顯升高，但存在個(gè)體差異大的特點(diǎn)，這也表明低劑量的細(xì)菌內(nèi)毒素所致實(shí)驗(yàn)兔熱原反應(yīng)的不穩(wěn)定性

26、；但是給予5 EU/kg和10 EU/kg的細(xì)菌內(nèi)毒素后，對(duì)實(shí)驗(yàn)兔的致熱效應(yīng)的一致性明顯增強(qiáng)，表明細(xì)菌內(nèi)毒素的濃度越高，實(shí)驗(yàn)兔的升溫幅度也增強(qiáng)，具有一定的劑量依賴(lài)性。另外，從致熱時(shí)間來(lái)看，WHBE兔和日本大耳白兔的最大升溫時(shí)間一般在1.02.0h，在2.03.0h升溫反應(yīng)降低，表明細(xì)菌內(nèi)毒素靜脈注射后升溫維持的時(shí)間較短，這與文獻(xiàn)報(bào)道較為一致9，這也表明藥典中規(guī)定熱原檢查采用靜脈給藥的方式較為合理，可縮短試驗(yàn)時(shí)間，提高檢測(cè)效率。此外，結(jié)果亦顯示W(wǎng)HBE兔對(duì)5 EU/kg和10 EU/kg的細(xì)菌內(nèi)毒素致熱反應(yīng)程度均高于日本大耳白兔，其中5 EU/kg的細(xì)菌內(nèi)毒素對(duì)WHBE兔的發(fā)熱峰值、180min

27、體溫差和發(fā)熱指數(shù)均顯著高于日本大耳白兔；而且5 EU/kg和10 EU/kg的細(xì)菌內(nèi)毒素劑量所致WHBE兔的升溫?cái)?shù)和升溫率均明顯高于日本大耳白兔，這些結(jié)果表明WHBE兔比日本大耳白兔更具有對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素的敏感性。由于受給藥方式、兔的質(zhì)量和來(lái)源、細(xì)菌內(nèi)毒素的效價(jià)等多因素的影響，關(guān)于家兔的發(fā)熱閾值均無(wú)統(tǒng)一的結(jié)論。但在2010年版中國(guó)藥典附錄中規(guī)定細(xì)菌內(nèi)毒素致熱閾值5EU/kg/h10，即人靜脈注射細(xì)菌內(nèi)毒素的量大于5EU/kg/h時(shí)，則判定為樣品不合格；而在熱原檢查中是以兔體溫升高大于0.6時(shí)，作為判定樣品不合格的標(biāo)準(zhǔn)。本試驗(yàn)通過(guò)曲線(xiàn)擬合回歸分析，當(dāng)WHBE兔體溫升高0.6時(shí)細(xì)菌內(nèi)毒素的量為5.72EU/kg，日本大耳白兔體溫升高0.6時(shí)細(xì)菌內(nèi)毒素的量為7.9