藥物分析學(xué)課件：第3章 供試品前處理與測定方法效能指標(biāo)

1、第三章 供試品前處理與測定方法效能指標(biāo)1. 定量分析樣品的前處理方法 1. 概述含鹵素藥物與芳環(huán)連接,牢固；與脂肪鏈C連接,不牢固。含金屬 藥物金屬鹽或配位化合物,如酒石酸銻鉀等,不牢固；金屬原子直接與碳原子結(jié)合,如卡巴胂,牢固。2. 不經(jīng)有機破壞的分析方法 (1)直接測定法：金屬原子不直接與碳原子相連，如富馬酸亞鐵； (2)直接回流后水解測定法： 含鹵素藥物 +NaOH回流間接銀量法測定(加過量AgNO3再用NH4SCN返滴定)(3)硫酸水解后測定法(4) 氧化還原后測定法a. 堿性還原后測定法，如泛影酸的測定Na I + AgNO3 AgI +NaNO3 NaOH+Zn粉回流，+NaIb.

2、 酸性還原后測定法，如碘番酸的測定碘番酸 +HAc +Zn I- 銀量法測定c. 汞齊化法：d. 利用藥物中可游離的金屬離子的氧化性測定含量 Sb5+ Sb3+ + I2 +2K+ H+KIFe3+ Fe2+ +I2 H+KI3. 經(jīng)有機破壞的分析方法有機破壞 方法4. HNO3-HClO4 法 適用于血、尿、組織等4. HNO3-H2SO4 法 不適用于含堿土金屬有機藥物3. H2SO4 -硫酸鹽法 含砷、銻有機藥物2. 灼燒（干法） 420 0C1. 氧瓶燃燒法 不適用于含易揮發(fā)性金屬有機藥物 氧瓶燃燒法 硬質(zhì)瓶(測F時用石英瓶) 稱樣 先通氧氣后點火 吸收液(H2O或H2O+NaOH等)

3、碘苯酯氧瓶燃燒I2(I-)NaOHI- Br2+HAcIO3- KII2S2O32- 滴定 三氯叔丁醇膽影酸泛影酸碘他拉酸碘番酸碘苯酯鹽酸胺碘酮諾氟沙星醋酸氟輕松磺溴酞鈉葡萄糖酸銻鈉富馬酸亞鐵酒石酸銻鉀汞撒利卡巴胂2. 生物樣品分析的前處理技術(shù)目的：(1) 藥物進入體內(nèi)后，經(jīng)吸收、分布、代謝，然后排出體外。在體 液、組織和排泄物中除了游離型藥物之外，還有藥物的代謝物、 藥物與蛋白質(zhì)形成的結(jié)合物、以及藥物或其代謝物與內(nèi)源性物 質(zhì) (如葡萄糖醛酸、硫酸形成的葡萄糖醛酸苷、硫酸酯綴合物)等 多種形式存在，需要分離后測定藥物及代謝物；(2) 生物樣品的介質(zhì)組成比較復(fù)雜，主要影響是蛋白質(zhì)。1. 常用樣品

4、的種類、采集和貯藏 1. 血樣血漿的制備：將采取的血液置含有抗凝劑(肝素、草酸鹽、枸櫞酸鹽、 EDTA、氟化鈉等)的試管中，混合后，以25003000rpm 離心5min使與血細胞分離，分取上清液即得。獲取量大血清的制備：將采取的血樣在室溫下至少放置30min到1hr，待凝結(jié) 出血餅后，用細竹棒或玻璃棒輕輕地剝?nèi)パ?，然?以2000 3000rpm離心分離5 10min，分取上清液即 得。 獲取量少藥物結(jié)合型游離型能到達靶器官，有療效 OK!不能通過血管壁保存：短期4 0C 長期-20 0C(1) 唾液由腮腺、頜下腺、舌下腺和口腔粘膜內(nèi)許多散在的小腺體分泌液混合組成。 1.0031.008

5、pH 6.27.6用唾液作為樣品 測定藥物濃度 的優(yōu)點 不受時間、地點限制，可反復(fù)采集 無痛苦、無危險 有些唾液中藥物濃度可以反映血漿 中游離型藥物濃度(2) 尿液水尿素鹽主要成分采集方式隨時尿晨尿白天尿夜間尿時間尿自然排尿立即測定，超過24hr應(yīng)加防腐劑(苯、甲苯、醋酸、濃HCl)2. 生物樣品分析前處理技術(shù) 根據(jù)生物樣品的類型進行分離、純化。如血漿或血清需除蛋白，使藥物從蛋白質(zhì)結(jié)合物中釋放；唾液樣品則主要采用離心沉淀除去粘蛋白；尿液樣品常采用酸或酶水解使藥物從綴合物中釋出，當(dāng)原型藥物排泄在尿中時，可簡單地用水稀釋一定倍數(shù)后進行測定。 樣品處理步驟與分析方法的選擇(1) 去除蛋白質(zhì)： a.

6、加入與水相混溶的有機溶劑，如乙睛、甲醇、乙醇、 丙醇、丙酮、四氫呋喃，使蛋白質(zhì)分子內(nèi)及分子間 的氫鍵發(fā)生變化而使蛋白質(zhì)凝聚，使與蛋白質(zhì)結(jié)合 的藥物釋放出來； b. 加入中性鹽，使溶液的離子強度發(fā)生變化，使蛋白 質(zhì)脫水而沉淀，如飽和硫酸銨、硫酸鈉、鎂鹽、磷 酸鹽及枸櫞酸鹽等； c. 加入強酸，使蛋白質(zhì)形成不溶性鹽而沉淀，如 10%三氯醋酸，6%高氯酸、硫酸-鎢酸混合液及5% 偏磷酸等； d. 加入含鋅鹽及銅鹽的沉淀劑，分取上清液，如 CuSO4-Na2WO4、ZnSO4-NaOH等； e. 酶解法：加蛋白水解酶中的枯草菌溶素，既可使組 織酶解，又可使藥物析出。pH等電點pH等電點(2) 綴合物的

7、水解：尿中藥物多數(shù)呈綴合狀態(tài) 酸水解（HCl） 酶水解(葡萄糖醛酸苷酶或硫酸酯酶)(3) 分離、純化與濃集： a. 液-液提取法(乙醚或氯仿) b. 液-固提取法(小規(guī)模的柱色譜法，用青 水性硅藻土和疏水性活性炭、聚苯乙烯等)(4) 化學(xué)衍生化： a. 使藥物變成具有能被分離的性質(zhì)； b. 提高檢測的靈敏度； c. 增強藥物的穩(wěn)定性； d. 提高對光學(xué)異構(gòu)體分離的能力。3. 測定方法的效能指標(biāo)精密度、準(zhǔn)確度、檢測限、定量限、選擇性、線性與范圍、重現(xiàn)性、耐用性等(1) 精密度(Precision):測定同一勻質(zhì)樣品的一組測量值彼此符合程度衡量方法批內(nèi)精密度 5%批間精密度 15%生物樣品分析要求

8、(2) 準(zhǔn)確度(Accuracy)：測定結(jié)果與真實值接近的程度85 115%(樣品濃度200g/l)80 120%(樣品濃度200g/l)要求(3) 檢測限(Limit of Detection): 指分析方法能夠從背景信號中區(qū)分 出藥物時，所需樣品中藥物的最低 濃度，無需定量測定。LOD(4) 定量限(Limit of Quantitation): 指在保證具有一定可靠性(一定準(zhǔn) 確度和精密度)的前提下，分析方 法能夠測定出的樣品中藥物的最 低濃度。LOQ(5) 選擇性(Selectivity):指在樣品介質(zhì)中有其他組分共存時該分析方法對供試物質(zhì)準(zhǔn)確而專屬的測定能力。 專屬性一種方法僅對一種

9、分析成分產(chǎn)生唯一信號；選擇性則可對多種化學(xué)成分產(chǎn)生不同響應(yīng)，而主要成分的響應(yīng)可與其他響應(yīng)區(qū)分。 線性與范圍(Linearity and Range): (6) 線性：在給定范圍內(nèi)獲取與樣品中供試物濃度成正比的 試驗結(jié)果的 能力 (7) 范圍：利用同一種方法取得精密度、準(zhǔn)確度均符合要求的試驗結(jié)果， 而且成線性的供試物濃度的變化范圍，其最大量與最小量之 間的間隔，可用 mg/l mg/ l或 g/l g/l 表示。 Y=a+bx r0.9900 重現(xiàn)性(再現(xiàn)性) (Ruggedness):不同人、不同實驗室、不同儀器，共同對同一樣品的某物理量進行反復(fù)測量，其結(jié)果接近的程度 重復(fù)性同一人、同一實驗室、同一儀器，對同一樣品反復(fù)測量，測量值之間接近的程度。評價其保持不受參數(shù)微小變化影響的能力，并可作為正常使用的一個可靠性指標(biāo)。(8) 耐用性(粗放度)(Robustness): 與參比方法測得結(jié)果的相關(guān)程度的比較： 要求：r 0.95 b 1 xyY=a+bx舊方法測得含量新方法測得含量藥典要求的檢驗項目和驗證內(nèi)容 項目 內(nèi)容 鑒別雜質(zhì)測定含量測定及溶出度測定定量限度準(zhǔn)確度不做做不做做精密度 重復(fù)性不做做不做做 中間精密度不做做不做做專屬性做做做做檢測限不做不做做不做定量限不做做不