核酸檢測(cè)培訓(xùn)

1、 核 酸 檢 測(cè)北京萬(wàn)泰研發(fā)中心2010.04.12 主要內(nèi)容 為什么要做核酸檢測(cè)？ 核酸是什么？ 怎樣進(jìn)行核酸檢測(cè)？ 市場(chǎng)狀況為什么要做核酸檢測(cè)？ 核酸檢測(cè)（基因檢測(cè)） 現(xiàn)知人類(lèi)的疾病都與基因有直接或間接的關(guān)系。醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室所要檢測(cè)和分析的核酸既包括人體本身的基因(DNA ) 以及反映基因轉(zhuǎn)錄水平的mRNA , 也包括侵入人體的致病微生物等所攜帶的外源性基因(DNA/RNA )。 傳統(tǒng)檢測(cè)試劑（酶免ELISA）技術(shù)特點(diǎn)： 檢測(cè)目標(biāo)為蛋白, 所檢測(cè)的主要是疾病所引發(fā)的人體抗體而不是病原體本身,是一種間接、滯后的檢測(cè)方式。易操作，成本低。 固有不足：不能夠消除對(duì)“窗口期”標(biāo)本(抗體陰性,核酸陽(yáng)性)

2、的漏檢難于檢測(cè)病原體的不同亞型及突變型不典型血清陽(yáng)轉(zhuǎn)對(duì)免疫逃避或免疫沉寂的標(biāo)本產(chǎn)生漏檢核酸檢測(cè)顯著縮短窗口期:HIV窗口期縮短45%，HCV縮 短89%，HBV縮短50%。提 高 靈 敏 度:理論上擴(kuò)增體系中單拷貝的模板 也能被檢測(cè)出。特 異 性 好:使用熒光探針技術(shù)的PCR檢測(cè)， 幾乎沒(méi)有方法學(xué)的假陽(yáng)性。直接揭示病原體的存在 對(duì)操作者及檢測(cè)環(huán)境的要求較高檢測(cè)成本相對(duì)較高輸血中可傳染病原體的“窗口期”病毒種類(lèi)ELISA檢測(cè)項(xiàng)目窗口期HCV抗-HCV 2.0/3.0 EIA 8-10周HIV抗-HIV-1/2 EIA and HIV-1 抗原 EIA 2-4周HBVHBVsAg EIA and

3、HBVcAg EIA 6-8周HTLV抗-HTLV I/II EIA 8-10周CMV抗-CMV EIA 3-5 周窗口期檢測(cè)率國(guó)家或地區(qū)HBVHCVHIV加拿大1:153000(1/15萬(wàn))1:2300000(1/230萬(wàn))1:7800000(1/780萬(wàn))法國(guó)1:640000(1/64萬(wàn))1:10000000(1/1000萬(wàn))1:3150000(1/315萬(wàn))德國(guó)1:230000(1/23萬(wàn))1:670000(1/67萬(wàn))1:2770000(1/277萬(wàn))日本（50混）1:51988(1/5.2萬(wàn))1:348091(1/35萬(wàn))1:2668696(1/267萬(wàn))美國(guó)（24混）1:18000

4、0(1/18萬(wàn))1:230000(1/23萬(wàn))12:37164054(1/309萬(wàn))香港1:32786(1/3.3萬(wàn))1:5456(1/0.5萬(wàn))1:222(1/0.02萬(wàn))核酸檢測(cè)在臨床診斷中的應(yīng)用定性診斷 血液篩查 病原體篩查診斷 SNP和耐藥突變?cè)\斷 基因型分型 遺傳病診斷 個(gè)體用藥診斷 基因鑒定和配型 定量檢測(cè) 病情的評(píng)估和預(yù)后判斷 抗病毒藥物療效的觀察 新藥驗(yàn)證 癌基因表達(dá)差異 核 酸 是 什 么？ 核酸（Nucleic Acid）是一種主要位于細(xì)胞核內(nèi)的生物大分子，其充當(dāng)著生物體遺傳信息的攜帶和傳遞。核酸廣泛存在于所有動(dòng)物、植物細(xì)胞、微生物內(nèi)。 現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)近2000種遺傳性疾病都和D

5、NA結(jié)構(gòu)有關(guān)。腫瘤的發(fā)生、病毒的感染、射線對(duì)機(jī)體的作用等都與核酸有關(guān)。 核酸分類(lèi)：DNA、RNA；DNA：dATP（A）、dTTP（T）、 dCTP（C）、dGTP（G）；RNA：ATP、UTP、CTP、GTP；35磷酸鍵DNA結(jié)構(gòu)單鏈DNA形成雙鏈的原則 堿基互補(bǔ)配對(duì)： G-C T-A外部為磷酸和戊糖形成的骨架內(nèi)部為堿基互補(bǔ)形成的共價(jià)結(jié)合區(qū)域螺旋結(jié)構(gòu)核酸在體內(nèi)的復(fù)制DNA的熱變性DNA受熱，會(huì)解開(kāi)雙鏈互補(bǔ)狀態(tài)，形成單鏈；降溫會(huì)恢復(fù)雙鏈狀態(tài)怎樣進(jìn)行核酸檢測(cè)？核酸檢測(cè)的一般流程核酸樣品的制備： 從血液、體液、組織中提取或PCR擴(kuò)增樣品的檢測(cè)： 核酸雜交、PCR、熒光定量PCR、PCR-ELISA

6、等 結(jié)果判讀： 電泳、膜、熒光定量PCR儀等核 酸 雜 交 核酸雜交是從核酸分子混合液中檢測(cè)特定大小的核酸分子的傳統(tǒng)方法。其原理是核酸變性和復(fù)性理論。即雙鏈的核酸分子在某些理化因素作用下雙鏈解開(kāi)，而在條件恢復(fù)后又可依堿基配對(duì)規(guī)律形成雙邊結(jié)構(gòu)。雜交通常在一支持膜上進(jìn)行，因此又稱(chēng)為核酸印跡雜交。根據(jù)檢測(cè)樣品的不同又被分為DNA印跡交（Southern blot hybridization ）和RNA印跡雜交（Northern blot hybridization）。核酸提取PCR擴(kuò)增探針點(diǎn)膜交聯(lián)雜交顯色結(jié)果判讀PCR聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction)，簡(jiǎn)稱(chēng)PCR，

7、是一種分子生物學(xué)技術(shù)，用于放大特定的DNA片段?？煽醋魃矬w外的特殊DNA復(fù)制。DNA的復(fù)制是生物進(jìn)化和傳代的重要途徑。雙鏈DNA在多種酶的作用下可以變性解鏈成單鏈，在DNA聚合酶的參與下，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則復(fù)制成同樣的兩分子挎貝。在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，DNA在高溫時(shí)也可以發(fā)生變性解鏈，當(dāng)溫度降低后又可以復(fù)性成為雙鏈。因此，通過(guò)溫度變化控制DNA的變性和復(fù)性，加入設(shè)計(jì)引物，DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的體外復(fù)制。 PCR的產(chǎn)生實(shí)時(shí)熒光PCR 在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)累積實(shí)現(xiàn)了實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，對(duì)起始模板進(jìn)行分析的方法,可以進(jìn)行定量和定性檢測(cè)。熒光閾值是在熒光擴(kuò)增

8、曲線上人為設(shè)定的一個(gè)值，它可以設(shè)定在熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段任意位置上，一般熒光域值的設(shè)置是 基線（背景）熒光信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差的 10 倍。每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)被稱(chēng)為 CT 值（ threshold value ）。 熒光定量PCR標(biāo)記方法內(nèi)摻式染料SYBR Green I序列特異性探針Taqman Molecular Beacons Dual Probes(FRET)引物特異性探針 Amplifluor (Intergen)SYBRGREEN 雙探針雜交分子信標(biāo) Taqman 引物特異探針 性質(zhì) 可逆熒光 積累熒光 熔點(diǎn)分析 能不能特異性 引物（非特異性擴(kuò)增或引物二

9、聚體有影響） 引物2探針 引物探針 引物探針 引物（非特異性擴(kuò)增或引物二聚體有影響） 探針無(wú)有有有無(wú)通用性通用專(zhuān)用專(zhuān)用專(zhuān)用專(zhuān)用探針特點(diǎn)SYBR Green 融解曲線分析SYBR Green法優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn):對(duì)DNA模板沒(méi)有選擇性適用于任何DNA使用方便-不必設(shè)計(jì)復(fù)雜探針?lè)浅ｌ`敏便宜TaqMan探針?lè)═aqMan法優(yōu)缺點(diǎn)市 場(chǎng) 狀 況生產(chǎn)廠家檢測(cè)項(xiàng)目使用技術(shù)使用儀器達(dá)安基因HBV、HIV、HCV、HPV 、TB、HCMV、淋球菌、解脲脲原體、肺炎支原體、沙眼衣原體、單純皰疹病毒型、地中海貧血、缺失型-地中海貧血、淋球菌、血篩試劑PCR熒光探針?lè)≒CR-反向點(diǎn)雜交法熒光定量PCR儀PCR儀上海科華HB

10、V、HCV、新型冠狀病毒、血篩試劑PCR熒光探針?lè)≒CR-酶免熒光定量PCR儀酶免相關(guān)儀器匹基HBV、HIV、HPV、TB、HCV、沙眼衣原體、新型冠狀病毒PCR熒光探針?lè)晒舛縋CR儀上海華美HBV、HCV、TB、沙眼衣原體、新型冠狀病毒PCR熒光探針?lè)晒舛縋CR儀上?？寺BV、TB、HPVPCR熒光探針?lè)晒舛縋CR儀凱普、港龍以HPV檢測(cè)為主。浩源血篩試劑已進(jìn)入審批階段。羅氏、生物梅里埃公司有HIV檢測(cè)試劑盒，均以各自公司的專(zhuān)利技術(shù)為主研發(fā)?，F(xiàn)狀和趨勢(shì)1、現(xiàn)狀：公司多、競(jìng)爭(zhēng)激烈、同質(zhì)化；手工操作為主；缺乏規(guī)范；核心技術(shù)少；2、趨勢(shì)：管理部門(mén)逐漸加強(qiáng)管理，相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)制訂中；進(jìn)口試劑以全自動(dòng)診斷平臺(tái)為主在國(guó)內(nèi)推廣，國(guó)內(nèi)廠家漸進(jìn)推出自動(dòng)化核酸提取儀器進(jìn)入市場(chǎng)；實(shí)時(shí)熒光PC