檢測(cè)技術(shù)及梅毒實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)2021優(yōu)質(zhì)課件

1、檢測(cè)技術(shù)及梅毒實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)2021優(yōu)質(zhì)檢測(cè)技術(shù)及梅毒實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)2021優(yōu)質(zhì)試驗(yàn)室假陰性報(bào)告的原因分析窗口期非典型血清學(xué)轉(zhuǎn)換病毒變異實(shí)驗(yàn)室誤差實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行艾滋病抗體篩查很很多的原因可能造成漏檢, 曾經(jīng)有文獻(xiàn)具體分析過造成漏檢的原因, 主要原因有因?yàn)榇翱谄诘脑蛟斐陕z, 因?yàn)椴《咀儺愐约皩?shí)驗(yàn)室誤差等原因造成的漏檢. 其中最主要的原因是因?yàn)榇翱谄诘膯栴}造成的漏檢. 占整體比例的93.7%. 試驗(yàn)室假陰性報(bào)告的原因分析窗口期非典型血清學(xué)轉(zhuǎn)換病毒變異實(shí)驗(yàn)篩 查 試 驗(yàn)復(fù) 核 檢 測(cè)確 證 試 驗(yàn)檢測(cè)程序及流程圖篩 查 試 驗(yàn)復(fù) 核 檢 測(cè)確 證 試 驗(yàn)檢測(cè)程序及流程圖 HIV抗體篩查檢測(cè)流程樣品初

2、篩試驗(yàn)篩查試劑陽性反應(yīng)陰性反應(yīng)復(fù)檢試驗(yàn)原有試劑+另一不同原理（或廠家）試劑或另外兩種不同原理（或廠家）試劑均陽性反應(yīng)一陰一陽均陰性反應(yīng)確證試驗(yàn)報(bào)告陰性 HIV抗體篩查檢測(cè)流程樣品初篩試驗(yàn)篩查試劑陽性反應(yīng)陰性反酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）化學(xué)發(fā)光法快速檢測(cè)及其它檢測(cè) 明膠顆粒凝集試驗(yàn)（PA） 免疫滲濾試驗(yàn)：斑點(diǎn)ELISA和斑點(diǎn)免疫膠體金（或膠體硒）快速試驗(yàn)電化學(xué)發(fā)光試驗(yàn)其它快速篩查試驗(yàn)方法艾滋病唾液尿液檢測(cè)試劑初篩檢測(cè)方法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）初篩檢測(cè)方法酶聯(lián)免疫試驗(yàn) ( ELISA ) 最早用于檢測(cè)血清中HIV抗體的有效篩檢方法； 很高的敏感性和特異性； HIV抗體檢測(cè)試劑根據(jù)其抗原

3、的來源和檢測(cè)方式可分為四代； 根據(jù)檢測(cè)方法，可分成四類間接法、雙抗原夾心法、競(jìng)爭(zhēng)法和捕獲法。酶聯(lián)免疫試驗(yàn) ( ELISA ) 最早用于檢測(cè)血清中HIV（1）膠體金（膠體硒）法（2）明膠凝集法（3）斑點(diǎn)印跡試驗(yàn)（4）電化學(xué)發(fā)光法快速檢測(cè)方法（1）膠體金（膠體硒）法快速檢測(cè)方法（1）膠體金法原理：采用雙抗原夾心法免疫測(cè)定原理，使用純化HIV-1/2基因重組抗原，分別固定于硝酸纖維膜上，作為檢測(cè)線，并且用這些抗原標(biāo)記膠體金。當(dāng)待檢樣本中存在HIV抗體時(shí)，先和金標(biāo)記抗原結(jié)合，由于層析作用向前移動(dòng)，當(dāng)遇到膜上固定的抗原時(shí)，形成Ag-Ab-Ag-AU復(fù)合物而富集在包被線上，形成一條或二條紅色線，是陽性結(jié)果

4、。反之，若標(biāo)本中不存在HIV抗體，則不會(huì)出現(xiàn)紅線，是陰性結(jié)果。無論樣本中是否含有HIV抗體，在質(zhì)控線區(qū)域都會(huì)形成另一條紅色線。 T-檢測(cè)線C-質(zhì)控線（1）膠體金法原理：采用雙抗原夾心法免疫測(cè)定原理，使用純化H1.準(zhǔn)備試劑與相關(guān)耗材2.每個(gè)樣本檢測(cè)用一片試劑，標(biāo)上相應(yīng)樣本編號(hào). 3. 加入50 l 全血或血清和血漿4. 5-20分鐘讀取結(jié)果 5.讀取和記錄檢測(cè)結(jié)果. 1.準(zhǔn)備試劑與相關(guān)耗材2.每個(gè)樣本檢測(cè)用一片試劑，標(biāo)上相應(yīng)樣陽性反應(yīng)：在質(zhì)控窗和反應(yīng)窗均顯示紅線。陰性反應(yīng)：只在質(zhì)控窗出現(xiàn)紅線，反應(yīng)窗沒有紅線。無效：在質(zhì)控窗沒有出現(xiàn)紅線，說明檢測(cè)無效，需要重新檢測(cè)。陽性反應(yīng)：在質(zhì)控窗和反應(yīng)窗均顯示

5、紅線。陰性反應(yīng)：只在質(zhì)控窗出第四代試劑聯(lián)合檢測(cè)HIV P24抗原和抗HIV 抗體電化學(xué)發(fā)光法第四代試劑聯(lián)合檢測(cè)HIV P24抗原和抗HIV 抗體電化學(xué)第一代艾滋病抗體檢測(cè)試劑檢測(cè)的是HIV-1 的IgG抗體, 檢測(cè)的窗口期大約是42天. 第二代試劑可以檢測(cè)HIV-1和HIV-2型的IgG抗體窗口期縮短至35天. 第三代的試劑可以同時(shí)檢測(cè)IgG和IgM抗體, 將檢測(cè)的窗口期又縮短至22天. 第四代的可以聯(lián)合檢測(cè)HIV的P24抗原和HIV-1/2型抗體的試劑, 大約平均比較第三代試劑縮短6天時(shí)間. 第一代艾滋病抗體檢測(cè)試劑檢測(cè)的是HIV-1 的IgG抗體, Elecsys HIV Combi 的檢

6、測(cè)原理羅氏第四代HIV Combi試劑檢測(cè)的是HIV P24抗原和HIV-1/HIV-2抗體.檢測(cè)P24抗原使用的是單克隆的HIV 抗體. 檢測(cè)HIV-1/2抗體使用的是大量的重組抗原,來捕捉IGg和IGM 抗體. 釕生物素辣根過氧化物酶標(biāo)記的磁性珠 電化學(xué)發(fā)光Elecsys HIV Combi 的檢測(cè)原理羅氏第四代HI快速檢測(cè)法的優(yōu)先使用 技術(shù)角度需要考慮：需要快速得到結(jié)果、免去試劑和樣本的冷鏈運(yùn)輸環(huán)節(jié)、小空間實(shí)驗(yàn)室的成本效益、檢測(cè)的簡(jiǎn)單性等。 優(yōu)先使用包括：應(yīng)急、門診急診，如VCT、母嬰傳播、臨床評(píng)估、農(nóng)村血檢、術(shù)前檢測(cè)、緊急事件等?？焖贆z測(cè)法的優(yōu)先使用 技術(shù)角度需要考慮：HIV快速檢測(cè)的

7、局限性一般不用于血液篩查有一定的假陽性反應(yīng)窗口期問題：有一定的假陰性反應(yīng)（尤其暴露時(shí)間3個(gè)月）HIV抗體快速檢測(cè)具有快速優(yōu)勢(shì)，但是“快速”并不意味著對(duì)早期感染者的快速診斷，因?yàn)镠IV感染后產(chǎn)生抗體應(yīng)答需要一段時(shí)間，存在窗口期（即從暴露至最早檢測(cè)出的時(shí)間），即使采用分子生物學(xué)試驗(yàn)，也有12周的窗口期。HIV快速檢測(cè)的局限性一般不用于血液篩查熒光螺旋體抗體吸收試驗(yàn)（FTA-ABS ）無論樣本中是否含有HIV抗體，在質(zhì)控線區(qū)域都會(huì)形成另一條紅色線。第二代試劑可以檢測(cè)HIV-1和HIV-2型的IgG抗體窗口期縮短至35天.羅氏第四代HIV Combi試劑檢測(cè)的是HIV P24抗原和HIV-1/HIV-

8、2抗體.Elecsys HIV Combi 的檢測(cè)原理（2）同時(shí)盡快進(jìn)行以下處理：非梅毒螺旋體抗原血清學(xué)試驗(yàn)原理示意圖非梅毒螺旋體抗原血清學(xué)原理篩查檢測(cè)結(jié)果的報(bào)告和處理TPPA 試驗(yàn)結(jié)果判讀僅能通過接種兔睪丸等部位進(jìn)行有限增殖。加樣：吸取50uL血清（漿）與各圈中鹽水作系列稀釋，并涂布整個(gè)圈內(nèi)。梅毒酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ ELISA） 陰性報(bào)告“HIV抗體陰性” 陽性出具“HIV抗體待復(fù)查”報(bào)告（1）不能出陽性報(bào)告。（2）同時(shí)盡快進(jìn)行以下處理： 在廣州市疾病預(yù)防控制中心數(shù)字化信息系統(tǒng)填寫送檢病例信息，打印送檢單，重新采血，兩份血和紙質(zhì)版送檢單一并送篩查中心或確證實(shí)驗(yàn)室； 做檢測(cè)后咨詢； 初篩陽性告

9、知。（注意告知技巧） 篩查檢測(cè)結(jié)果的報(bào)告和處理熒光螺旋體抗體吸收試驗(yàn)（FTA-ABS ） 陰性報(bào)告“H抗體篩查試驗(yàn)的局限性陽性結(jié)果需用其他試劑復(fù)查以及確證。陰性結(jié)果有時(shí)不能排除HIV感染: (1)在感染早期，血清陽轉(zhuǎn)前存在“窗口期”，在感染晚期，某些抗體可能檢測(cè)不到（如p24抗體）。 (2)反應(yīng)中抗體過量，抗原抗體比例不合適而不能形成特定結(jié)構(gòu)，出現(xiàn)凝集抑制。抗體篩查試驗(yàn)的局限性陽性結(jié)果需用其他試劑復(fù)查以及確證。艾滋病實(shí)驗(yàn)室生物安全生物安全細(xì)則職業(yè)暴露的防范艾滋病實(shí)驗(yàn)室生物安全生物安全細(xì)則梅毒實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第五醫(yī)院檢驗(yàn)科詹鈾超梅毒實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第五醫(yī)院檢驗(yàn)科主要內(nèi)

10、容實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)注意事項(xiàng)及臨床意義梅毒實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)策略探討主要內(nèi)容常用梅毒實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法病原學(xué)檢測(cè)血清學(xué)檢測(cè)常用梅毒實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法病原學(xué)檢測(cè)病原學(xué)檢查原理： 一期、二期梅毒時(shí) ，取硬下疳、扁平濕疣、黏膜斑等皮損部位組織液或淋巴結(jié)穿刺術(shù)得到的組織液，在暗視野顯微鏡下，光線從聚光器的邊緣斜射到涂片上的梅毒螺旋體而發(fā)出亮光，從而可根據(jù)其特殊形態(tài)和運(yùn)動(dòng)方式進(jìn)行檢測(cè)。方法：（1）暗視顯微鏡檢查 （ 2）鍍銀染色法 （ 3）核酸檢測(cè)（血液標(biāo)本？）注：梅毒螺旋體目前體外人工培養(yǎng)還沒有獲得成功，僅能通過接種兔睪丸等部位進(jìn)行有限增殖。病原學(xué)檢查原理： 一期、二期梅毒時(shí) ，取硬下疳、扁平濕疣、黏梅毒血清學(xué)檢測(cè)方法1)

11、非梅毒螺旋體抗原血清學(xué)試驗(yàn) （非特異性梅毒抗體）(2) 梅毒螺旋體抗原血清學(xué)試驗(yàn) （特異性梅毒抗體）兩類方法。梅毒血清學(xué)檢測(cè)方法1) 非梅毒螺旋體抗原血清學(xué)試驗(yàn)非梅毒螺旋體抗原血清學(xué)試驗(yàn)原理梅毒螺旋體一旦感染人體，宿主可對(duì)螺旋體表面的脂質(zhì)作出免疫應(yīng)答，產(chǎn)生抗類脂抗原的抗體（非特異性抗體）。未經(jīng)治療的病人，其血清內(nèi)的非特異性抗體可長(zhǎng)期存在。經(jīng)正規(guī)治療后，非特異性抗體可以逐漸減少滴度至轉(zhuǎn)為陰性。非梅毒螺旋體抗原血清學(xué)試驗(yàn)原理梅毒螺旋體一旦感染人體，宿主可HIV感染后的血清學(xué)動(dòng)態(tài)1) 非梅毒螺旋體抗原血清學(xué)試驗(yàn)（注意告知技巧）1 、儀器：水平旋轉(zhuǎn)儀，轉(zhuǎn)速100r/min，轉(zhuǎn)幅約18mm第一代艾滋病抗

12、體檢測(cè)試劑檢測(cè)的是HIV-1 的IgG抗體, 檢測(cè)的窗口期大約是42天.無效：在質(zhì)控窗沒有出現(xiàn)紅線，說明檢測(cè)無效，需要重新檢測(cè)。加入50 l 全血或血清和血漿非梅毒螺旋體抗原血清學(xué)試驗(yàn)原理加樣：吸取血清( 漿) 放在卡片圈中，并均勻地涂布在整個(gè)圈內(nèi)Elecsys HIV Combi 的檢測(cè)原理陰性報(bào)告“HIV抗體陰性”僅能通過接種兔睪丸等部位進(jìn)行有限增殖。（1）不能出陽性報(bào)告。加樣：吸取50uL血清（漿）與各圈中鹽水作系列稀釋，并涂布整個(gè)圈內(nèi)。稀釋夜準(zhǔn)備：在反應(yīng)紙板圈內(nèi) 加入50uL生理鹽水（根據(jù)需要確定圈數(shù)),勿將鹽水涂開檢測(cè)P24抗原使用的是單克隆的HIV 抗體.非梅毒螺旋體抗原血清學(xué)原理

13、方法包括：（1）快速血漿反應(yīng)素環(huán)狀卡片試驗(yàn) (RPR)（2）甲苯胺紅不加熱血清試驗(yàn)（ TRUST ）（3）性病研究實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn) (VDRL) 等?；境煞质切牧字?卵磷脂和膽固醇抗原抗體結(jié)合形成復(fù)合物，凝集成網(wǎng)狀沉淀顆粒被肉眼所見上述方法的敏感性和特異性都基本相似HIV感染后的血清學(xué)動(dòng)態(tài)非梅毒螺旋體抗原血清學(xué)原理方法包括：非梅毒螺旋體抗原血清學(xué)試驗(yàn)原理示意圖非梅毒螺旋體抗原血清學(xué)試驗(yàn)原理示意圖非梅毒螺旋體抗原血清學(xué)試驗(yàn)操作要點(diǎn)1 、儀器：水平旋轉(zhuǎn)儀，轉(zhuǎn)速100r/min，轉(zhuǎn)幅約18mm2、定性試驗(yàn)加樣：吸取血清( 漿) 放在卡片圈中，并均勻地涂布在整個(gè)圈內(nèi)加抗原：將抗原輕輕搖勻，用9號(hào)針頭加1

14、滴抗原（ 60滴/mL，1滴=17ul ）反應(yīng)：水平旋轉(zhuǎn)儀旋轉(zhuǎn)8分鐘(23 - 29 ）亮光下觀察結(jié)果。非梅毒螺旋體抗原血清學(xué)試驗(yàn)操作要點(diǎn)1 、儀器：水平旋轉(zhuǎn)儀，轉(zhuǎn)非梅毒螺旋體抗原血清學(xué)試驗(yàn)操作要點(diǎn)3、定量試驗(yàn)稀釋夜準(zhǔn)備：在反應(yīng)紙板圈內(nèi) 加入50uL生理鹽水（根據(jù)需要確定圈數(shù)),勿將鹽水涂開加樣：吸取50uL血清（漿）與各圈中鹽水作系列稀釋，并涂布整個(gè)圈內(nèi)。下同定性實(shí)驗(yàn)。1:11:21:8非梅毒螺旋體抗原血清學(xué)試驗(yàn)操作要點(diǎn)3、定量試驗(yàn)1:11:21非梅毒螺旋體抗原血清學(xué)試驗(yàn)臨床意義早期梅毒（一期、二期）經(jīng)足量規(guī)則抗梅毒治療后 一期梅毒 1 年后轉(zhuǎn)為陰性 二期梅毒 2 年后轉(zhuǎn)為陰性。 晚期梅毒治

15、療后血清滴度下降緩慢，2年后約50% 病人血清反應(yīng)仍為陽性。非梅毒螺旋體抗原血清試驗(yàn)方法簡(jiǎn)單、快速、敏感性和特異性較好。適用于大量人群的篩查。因治療后血清滴度可下降并陰性，故可作為療效觀察、判愈、復(fù)發(fā)或再感染的指征。非梅毒螺旋體抗原血清學(xué)試驗(yàn)臨床意義非梅毒螺旋體抗原血清學(xué)試驗(yàn)特點(diǎn)假陽性反應(yīng)技術(shù)性假陽性反應(yīng)一般是由于操作錯(cuò)誤引起的假陽性反應(yīng)，經(jīng)過重復(fù)試驗(yàn)即可排除。生物學(xué)假陽性反應(yīng) ( 一般滴度小1:8），應(yīng)采用梅毒螺旋體抗原血清學(xué)試驗(yàn) 如TPPA等進(jìn)行排除。非梅毒螺旋體抗原血清學(xué)試驗(yàn)特點(diǎn)假陽性反應(yīng)梅毒螺旋體抗原血清學(xué)試驗(yàn)原理抗原為梅毒螺旋體特異蛋白（包括螺旋體重組特異抗原），檢測(cè)梅毒患者血中特異

16、性抗梅毒螺旋體抗原的抗體。感染梅毒螺旋體后 ，一旦梅毒螺旋體抗體試驗(yàn)呈陽性，則患者終身陽性。梅毒螺旋體抗原血清學(xué)試驗(yàn)原理抗原為梅毒螺旋體特異蛋白（包括螺梅毒螺旋體抗原血清學(xué)試驗(yàn)方法梅毒螺旋體顆粒凝集試驗(yàn) (TPPA)梅毒螺旋體血球凝集試驗(yàn) (TPHA)梅毒酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ ELISA）化學(xué)發(fā)光免疫分析法（CLIA）梅毒免疫層析法- 梅毒快速檢測(cè) (RT)熒光螺旋體抗體吸收試驗(yàn)（FTA-ABS ）梅毒螺旋體蛋白印跡試驗(yàn)（ WB ）梅毒螺旋體抗原血清學(xué)試驗(yàn)方法梅毒螺旋體顆粒凝集試驗(yàn) (TPPTPPATPPA試驗(yàn)用梅毒螺旋體致敏明膠顆粒人血清中的抗梅毒螺旋體抗體結(jié)合，產(chǎn)生可見的凝集反應(yīng)，具有較高的敏感性和特異性。TPPA是目前WHO公認(rèn)的梅毒抗原血清學(xué)試驗(yàn)的“金標(biāo)準(zhǔn)”，常用于新方法、新試劑的參照標(biāo)準(zhǔn)。TPPATPPA試驗(yàn)用梅毒螺旋體致敏明膠顆粒人血清中的抗梅毒TPPA試驗(yàn)原理示