教案開題報(bào)告

1、課題來(lái)源課題來(lái)源選題依據(jù)和背景情況近年來(lái)，海洋環(huán)境 嚴(yán)重污染，水體富營(yíng)養(yǎng)化程度日趨嚴(yán)重，有害赤潮在 赤潮產(chǎn)生的藻毒素成為污染海水養(yǎng)殖環(huán)境的新要素，嚴(yán)重 水產(chǎn)品食用安全（周名江等，2007。 甲藻赤潮所占比例和通過(guò)食物鏈傳遞導(dǎo)致高營(yíng)養(yǎng)級(jí)生物以及人類 ，嚴(yán)重的可致 。由 甲藻康也形成了潛在的 。氮雜螺環(huán)酸(iracid,)是一類由環(huán)胺藻屬(Azadiium)和 hidoma languida藻產(chǎn)生的脂溶性聚醚類生物毒素其 癥狀與腹瀉性貝毒 S ish ning, )引起的 癥狀非常相似，表現(xiàn)為 、 、嚴(yán)重腹瀉和胃腸部痙攣等癥狀。 甲藻亞胺毒（s,M是一組具有環(huán)狀亞胺醚或聚醚大環(huán)結(jié)（含有螺環(huán)中心的海

2、洋脂溶性貝類毒素屬于環(huán)胺類毒素（Cyclic Imies, CIs是一種“快速作用毒素。目前，在我國(guó)尚未關(guān)于A 與M的 ，但二者的產(chǎn)毒藻在我國(guó)海域都有分布et al., 2013; ang t l, 2017，并且在多個(gè)沿海城市的貝類中檢測(cè)出 A 或 M故而不能完全排除我國(guó)將來(lái)受到這兩種毒素危害的可能因此研究與 M 進(jìn)入食物鏈后的生物轉(zhuǎn)化機(jī)制對(duì)于開發(fā)解毒劑和快速脫毒技術(shù)具有重要的科學(xué)意義。課題研究目的及理論意義本課題旨在通過(guò)模擬貝類濾食AZA產(chǎn)毒藻腹孔環(huán)胺（Azadiniumpoporum）和GYM 產(chǎn)毒藻鞍狀凱倫藻（Kareniaselliformis）的過(guò)程，使用LC-MS/MS 方法測(cè)定

3、毒素在貝類體內(nèi)的代謝轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，以期闡釋AZA 與GYM 在貝類體內(nèi)的代實(shí)際應(yīng)用實(shí)際應(yīng)用價(jià)值A(chǔ)ZAGYM在貝類體內(nèi)的代謝輪廓及毒素與代謝產(chǎn)物對(duì)貝類的毒性據(jù)統(tǒng)計(jì)，海據(jù)統(tǒng)計(jì)，海洋中可以產(chǎn)生毒素的藻類約有 90 種，其中甲藻約 70 種，但是隨著對(duì)赤潮藻的深入研究以及技術(shù)的不斷發(fā)展， 藻類的數(shù)目很有可能繼續(xù)增加，同時(shí) 藻產(chǎn)生的毒素以及其它海洋生物毒素已經(jīng)成為水產(chǎn)品中重要的污染6組：大田軟海綿酸毒素組(okadaiccid,OA)、 毒素PTXYTX（azaspiracid, AZA、環(huán)亞胺類毒素（cyclic imines, CIs）和短 甲藻毒素組 B（/I/W, 20041. 氮雜螺環(huán)酸(Azas

4、piracidAZA 是近幾年來(lái)在歐洲發(fā)現(xiàn)的一類新型聚醚類生物毒素，1995 年在愛爾蘭 Killary 海灣的紫貽貝中首次被檢測(cè)到（McMahon and Silke, 1996; Satake et al., 199840個(gè)碳原子 ，分子中有 20 9 個(gè)環(huán)，具有獨(dú)特的 6,5,6-三螺環(huán)和環(huán)胺結(jié)構(gòu)，化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖 1，屬于氨代螺旋酸類貝類毒素（Satake et al., 1998。目前已經(jīng)確定產(chǎn) AZA 藻類主要有 Azadinium. spinosum，Azadinium.poporumAzadinium.obesum。隨著 研究的深入，AZA的分布范圍不斷擴(kuò)大，在 西海岸、 、亞洲以

5、及南美等地區(qū)都有分布。 AZAAZAAZA1AZA3后的生物轉(zhuǎn)化過(guò)程與機(jī)體免疫系統(tǒng)AZA 毒素的解毒機(jī)制具有重要意義。1 氮雜螺環(huán)酸毒素（AZA）1.0mol/L 150 min 后其毒性沒有明顯變化，在冷藏條件下可長(zhǎng)期 。由此看來(lái)，AZA 毒素是一類化學(xué)性質(zhì)相對(duì)穩(wěn)定的化合物。AZA 引起的臨床DSP引起的acidOA)組，初步確定了貝類毒素急性致毒的參考劑量(reference dose，RfD)，其中 AZA1的RfD0.04g/kg(OA的RfD0.33 g/kg貝組織Toyofuku,2006)。AZA1、AZA2AZA3對(duì)小鼠腹腔注射致死劑 1999 2011 具 （Michaele

6、tal.,2008。研究發(fā)現(xiàn)，AZA點(diǎn)，使得 肌動(dòng)蛋白發(fā)生重排，從而改變細(xì)胞骨架（李愛峰等2008。還有研AZA的毒性效應(yīng)與其化學(xué)結(jié)構(gòu)有關(guān)，不同衍生物引起的效應(yīng)差別較大（Alfonso et al., 2006甲藻亞胺毒素（Gymnodimines,1994年，從新西蘭FoveauxStrait 的牡蠣（Tiostreachilensis）中首次分離發(fā)現(xiàn)了GYM(Sekiet al., 1995)。GYM是螺旋形的環(huán)亞胺結(jié)構(gòu)，屬于CIs毒素組。亞胺是GYM的毒理功能 ，具有很高的致毒性，屬于“快速作用毒素（Fastacting toxins，T，化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖2 所示。目前已發(fā)現(xiàn)了5 種結(jié)構(gòu)（

7、et 200320022GYM2GYM研究表明 GYM 對(duì) 和周圍神經(jīng)系統(tǒng)的 乙酰膽堿受體（nicotinic mAChRs）有抑制作用（Mundayetal.,2008）GYM-A 與海蝸牛（Aplysia californica）乙酰膽堿結(jié)合蛋白（acetylcholine-bindingprotein,AChBP）復(fù)合物的 AChGYM 與該五聚體蛋白具有高度3GYM-A 與海蝸牛（Aplysiacalifornica）乙酰膽堿結(jié)合蛋白（acetylcholine-bindingprotein,AChBP）復(fù)合物的X射線晶體結(jié)構(gòu)俯視圖（左）和側(cè)視圖（右），GYM-A（綠色球體）Aplys

8、iaAChBP表面GYM 的毒性根據(jù)小鼠生物測(cè)定結(jié)果，無(wú)論選擇哪種施用途徑（例如，腹腔注射，管飼或喂食施用），CIs中最小的一種。GYM-A 對(duì)雌性瑞8096 g /kg b.w.。GYM-A GYM-B 10 80 800 g/kg （Kharratet（Kharratetal.,2008）。而腦室注射半致死劑量為3g/kgb.w.，毒性是腹腔注射的近30 倍（Takadaetal.,2001）。這表明GYM-A 首先影響嚙齒動(dòng)物的中樞神經(jīng)系統(tǒng)進(jìn)一步突出了高濃度的CIs 在貝類中積累時(shí)對(duì)人類健康可能存在的風(fēng)險(xiǎn)。 GYM-A 和 GYM-B 注射15 min 內(nèi)出現(xiàn)急性剖無(wú)異常。亞致死劑量出現(xiàn)

9、虛脫和呼吸窘迫癥狀，30min 內(nèi)恢復(fù)正常，在隨后的 21天觀察期未見異常（Mundayetal.,2004）。小鼠通過(guò)灌胃法口服GYM-A 的半致死劑量是腹腔注射的8 倍( 755 g/kg b.w.) 。而以食物添加的方式給藥在濃度高達(dá) 7 500 g /kg（Munday et al., 2004）時(shí)，沒有重量的變化。目前，尚未有人因食用 GYM 染毒貝亞胺毒素作用具有一定的不可逆性如果長(zhǎng)期積累，同樣可能產(chǎn)生神經(jīng)毒性甚Alfonso A, Vieytes M R, Ofuji K, et al. Azaspiracids modulate racellular pH levels in

10、human lymphocytes J. Biochemical and biophysical research communications, 2006, 346(3): 1091-1099.er ernmental Oceanographic Commis of UNESCO/World Health anization), Report of the Jo , 2004R.GuAlfonso A, Vieytes M R, Ofuji K, et al. Azaspiracids modulate racellular pH levels in human lymphocytes J.

11、 Biochemical and biophysical research communications, 2006, 346(3): 1091-1099.er ernmental Oceanographic Commis of UNESCO/World Health anization), Report of the Jo , 2004R.GuH,LuoZ,KrockB,etal.Morphology,phylogenyandazaspiracidprofileofAzadiniumpoporum (Dinophyceae) from theJ. Harmful Algae, 2013, 2

12、1: 64-75.JiangT,LiuL,LiY,etal.Occurrenceofmarinealgaltoxinsinoysterandphytopl tons lesin Daya Bay, SouthJ. Chemosphere, 2017, 183: 80-88.Kharrat R, Servent D, Girard E, et al. The marine phycotoxin gymnodimine s muscular and neuronalnicotinicacetylcholinereceptorsubtypeswithhighaffinityJ.Journalofne

13、urochemistry,2008, 107(4): 952-963.Haywood A J, Steidinger K A, Truby E W, et al. Comparative morphology and molecular phylogenetic ysis of three new species of tus Karenia(dinophyceae)fromNewZealand1J. Journal of Phycology, 2004, 40(1): 165-179.MacKenzie L, Holland P, McNabb P, et al. Complex toxin

14、 profiles in phytoplton and Greens s(Perna iculus),revealedbyysisJ.Toxicon,2002,40(9):1321-Mcmahon T, Silke J. Wer toxicity of unknown a etiologys J. HarmfulAlgae News, 1996, 14:2.Michael J., Nils Rehmann, et a1. Azaspiracid Sfish Poisoning: A Review on the Chemistry, Ecology, and Toxicology win Emp

15、hasis on Human Health Impacts J. Mar. Drugs 2008, 6, 39-72.CO,WilkinsAL,Munday R,etal.Isolationofpectenotoxin-2fromDinophysisacutaandits conver to pectenotoxin-2 secoacid, and preliminary assess-ment of their acute toxicities. Toxicon, 2004, 43: 1-9. CO, Wilkins AL, Stirling DJ, et al. Gymnodimine C

16、, an isomer of gymnodimine B, from Karenia selliformis. JAgric Food Chem, 2003,51: 4838-40.Munday R,Towers NR, Mackenzie L, et al. Acute toxicity of gymnodimine to mice. Toxicon, 2004, 44: 173-178.Munday R, Towers N R, Mackenzie L, et al.Acute toxicity of gymnodimine to miceJ. 2004,44(2):173-anizati

17、on of the United FAO/IOC/WHO (Food and Munday R. Toxicology of Cyclic Imines M Seafood and Freshwater Toxins: Pharmacology, Physiology, and Detection, Second Edition. CRC Press, 2008: 581-594.Ofujik, Satake M, Mcmahon T, et al. TwoMunday R. Toxicology of Cyclic Imines M Seafood and Freshwater Toxins

18、: Pharmacology, Physiology, and Detection, Second Edition. CRC Press, 2008: 581-594.Ofujik, Satake M, Mcmahon T, et al. Two ogs of azaspiracid isolated from mu s, Mytilus edulis, involved in human oxication in Ireland J. Natural Toxins, 1999, 7(3):99-102.Ofujik, Satake M, Mcmahon T, et al. Structure

19、s of azaspiracid ogs, azaspiracid-4 and azaspiracid-5, causative toxins of azaspiracid poisoning in Europe J. Bioscience Biotechnology, and Biochemistry, 2001, 65(3):740-742.Satake, M., Ofuji, K., Naoki, H., James, K.J., Furey, A., McMahon, T., Silke, J., Yasumoto, T. Azaspiracid,anewmarinetoxinhavi

20、nguniquespiroringassemb s,isolatedfromIrishmu s,Mytilus edulisJ. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 1998, 120, 99679968.SekiT,SatakeM,MackenzieL,etal.Gymnodimine,anewmarinetoxinofunprecedentedstructure isolated from New Zealand oysters and the dinoflagellate, Gymnodinium spp J. Tetrahedron letters, 1995, 36

21、(39): 7093-7096.Toyofuku HJo FAO/ WHO/IOC activities to provide scientific advice on marine biotoxins (research report) JMar Poll Bull, 2006, 52 (12): l 735-1745.李愛峰, 韓剛, 于仁成原多甲藻酸貝類毒素的研究進(jìn)展J中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)2008,15(1):183- 劉仁沿, 高春蕾, 梁玉波, 等. Gymnodimine, 首次在我國(guó)北海緣齒牡蠣中發(fā)現(xiàn)的一種腹瀉性 貝毒組分J. 海洋學(xué)報(bào), 2008, 30(6): 171-176.吳海燕

22、, 郭萌萌, 譚志軍, 等. 環(huán)亞胺毒素研究進(jìn)展J. 中國(guó)漁業(yè)質(zhì)量與標(biāo)準(zhǔn), 2012, 2(3): 周名江, 于仁成有害赤潮的形成機(jī)制、危害效應(yīng)與防治對(duì)策J所閱文獻(xiàn)的查閱范圍通過(guò)學(xué)校 館典藏 及專業(yè) 等查閱相關(guān)知識(shí)，通過(guò)導(dǎo)師介紹書籍進(jìn)行閱讀，通過(guò) 中文以及外文文獻(xiàn)進(jìn)行閱讀學(xué)習(xí)，包括：中國(guó)知網(wǎng)、 Elsevier期刊、谷歌學(xué)術(shù)、萬(wàn)方 庫(kù)、EnvironmentalScience&TechnologyEnvironmental Forensics 等。1本課題通過(guò)在 內(nèi)大體積培養(yǎng)含有 1本課題通過(guò)在 內(nèi)大體積培養(yǎng)含有 AZA2 GYMA 的產(chǎn)毒藻，通過(guò)AZAGYM在AZA在 內(nèi)，以產(chǎn)生 AZA2A

23、ZFC22作為餌料，用于喂養(yǎng)扇LC-MS/MSAZA毒素及其代AZA 在不同貝類體內(nèi)的轉(zhuǎn)化過(guò)程及代謝物的變化情況和產(chǎn)生速率。同時(shí) 貝類樣品，監(jiān)測(cè)扇貝、貽貝 （ROS（SOD（CT（GPX）AZA通過(guò)已完成的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，AZA2 在扇貝與貽貝體內(nèi)具有不同的代謝途徑，AZA2 的新型代謝產(chǎn)物AZA-886。通過(guò)在 內(nèi)進(jìn)行為期 15 天的扇貝濾食 AZFC22 模擬實(shí)驗(yàn)重復(fù)驗(yàn)證其存在并通過(guò) HR-MS 和 NMRHPLCGYM內(nèi)，以產(chǎn)生 GYMA 和痕量 GYMB 的鞍狀凱倫藻（Karenia 扇貝、貽貝體內(nèi)GYM毒素及其代謝物的含量，探討GYM 在不同貝類體內(nèi)的（ROS（SOD（CT酶活性的變化，探

24、討GYM 毒素積累過(guò)程中機(jī)體抗氧化系統(tǒng)的響應(yīng)。擬解決22（AZFC22selliformis）以及無(wú)毒球等鞭金藻（I.gal 3011；毒素的測(cè)定：使用甲醇提取毒素，通過(guò)液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)新型代謝產(chǎn)物AZA-886HR-MS 和 NMR HPLC 技術(shù)對(duì)新型AZAAZAGYM的室內(nèi)培養(yǎng)方法以 多年培養(yǎng)的可產(chǎn)生 AZA2 的腹孔環(huán)胺藻（AZFC22）GYM3-5 天（不喂食F/2 20L 的光照反應(yīng)器中大批量培養(yǎng)產(chǎn)毒 貝類的培養(yǎng)及樣品產(chǎn)毒甲藻。選擇60 只健康的貝放于裝有60 L 過(guò)濾海水的培養(yǎng)箱（配有溢水 72h、96h、122h、144h 和168h 后，分別從培養(yǎng)箱內(nèi)隨機(jī)取出5 只貝，進(jìn)行毒

25、素分析和酶活性測(cè)定。連續(xù)投喂 96h 后停止染毒，繼續(xù)加入過(guò)濾海水直至 168h 實(shí)驗(yàn)結(jié)束。開收集。解剖過(guò)程在冰上進(jìn)行，并及時(shí)進(jìn)行毒素的提取，或放在-80100%用組織勻漿器均質(zhì)化并用超聲波細(xì)胞破碎儀進(jìn)行提取，最后用超濾離心膜進(jìn)行過(guò)濾，分析貝的組織 素組成與含量。稱取混合均勻的貝類樣品 0.5 RO-80性測(cè)試。1.0g 3mL 甲醇提取 3 次，混合提取溶液后定容至 10mL。將毒素提取溶液過(guò) 0.22m 有機(jī)系濾膜，Agilent6430串聯(lián)四極桿質(zhì)譜、Agilent1290高效液相色譜USA，a C18（502.1 mm, 3m）色譜的LC-MS/MS系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè) 相B有機(jī)系（95%乙腈溶液2mM 有機(jī)系（95%乙腈溶液2mM 50mM 甲酸，進(jìn)行梯度洗脫。電噴霧離子