布氏鏡檢查丁酸鈉阻礙HT

1、布氏鏡檢查丁酸鈉阻礙HT劉成霞張尚忠劉宗印 黃麗華張孝衛(wèi)【關(guān)鍵詞】多功能透射顯微鏡 ( 布氏鏡 ) ；丁酸鈉； HT【摘要】 目的 觀看丁酸鈉對(duì)結(jié)腸癌 HT細(xì)胞形態(tài)和生物學(xué)特性的阻礙。方式 多功能透射顯微鏡 ( 布氏鏡 ) 動(dòng)態(tài)觀看丁酸鈉作用前后 HT細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)及貼壁進(jìn)程的轉(zhuǎn)變。結(jié)果 丁酸鈉 5 mmol/L 作用 24 h 后， HT細(xì)胞數(shù)量明顯減少，細(xì)胞巢變小，巢內(nèi)細(xì)胞數(shù)減少； 細(xì)胞變成圓形 ，細(xì)胞大小趨于一致； 細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)呈塊狀聚集，折光性降低，呈現(xiàn)出凋亡細(xì)胞形態(tài)；貼壁進(jìn)程明顯變緩。結(jié)論 丁酸鈉能夠改變 HT的生長(zhǎng)狀態(tài)，抑制其生長(zhǎng)；布氏鏡能夠動(dòng)態(tài)地觀看藥物作用前后培育細(xì)

2、胞的形態(tài)、微細(xì)結(jié)構(gòu)及運(yùn)動(dòng)的轉(zhuǎn)變，是一項(xiàng)先進(jìn)的、具有有效價(jià)值的檢查技術(shù)?！娟P(guān)鍵詞】多功能透射顯微鏡 ( 布氏鏡 ) ；丁酸鈉； HT細(xì)胞株【 bstract】 bjective To investigate the effect ofsodium butyrate on theappearance and bionomics ofcolon cancerline HT ethodsViewing theeffect ofsodium butyrate ondifferences of the growth,as well as the cell movement,and theadherence

3、 procedure ofHT withbradfordvariableprojectivemicroscopy (BVPM). esultsfter 24 hours of coincubation ofHTand sodium butyrate (5mmol/L),it was showed that theamount of HT decreased,the cell nests shrank,and the cellpopulation of each cellnestdiminished;mostofthe HT29 changedintoglobular,andthebulkofH

4、Tlookedwelldistibuted;chromatingathereduneven,andtherefractionweaken,many ofthemlooked asapoptosiscells;adherenceprocedure of HT stepped down obviously.onclusion Sodiumbutyrate may inhibit HT growth and monitoring the changesof cultured consecutively technique.cells in cytomorph ，fine structure and

5、its movement with BVPMis an advanced and practical examination【 eywords】 brafordvariableprojectivemicroscopy(BVPM), sodium butyrate,cell line對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行體外培育，同時(shí)給予藥物干與是目前研究和挑選抗腫瘤藥物的要緊方式之一。但關(guān)于藥物對(duì)培育的活體腫瘤細(xì)胞形態(tài)、結(jié)構(gòu)的動(dòng)態(tài)轉(zhuǎn)變研究尚未見(jiàn)報(bào)導(dǎo)。本研究應(yīng)用布氏鏡對(duì)丁酸鈉作用前后HT細(xì)胞形態(tài)和微細(xì)結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)變進(jìn)行動(dòng)態(tài)圖像掃描與分析，清楚地觀看到 HT細(xì)胞形態(tài)學(xué)和生物學(xué)行為的動(dòng)態(tài)轉(zhuǎn)變和丁酸鈉對(duì)腫瘤細(xì)胞的阻礙。材料和方式

6、1 布 氏 鏡 (bradfordvariableprojectivemicroscopy,BVPM, 可變投射顯微鏡的簡(jiǎn)稱)BVPM型，美國(guó)生物公司生產(chǎn)。 細(xì)胞株結(jié)腸癌 HT細(xì)胞株， 購(gòu)自山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院。 藥物和標(biāo)本制備1 丁酸鈉 (Sodium Butyrate): 購(gòu)于 Sigma 公司，用PBS配制成 01 mol/L 的貯存液， 4 保留備用。臨用前用培育液稀釋成實(shí)驗(yàn)所需濃度。132 細(xì)胞培育方式和標(biāo)本制備：將15 mm15 mm大小的蓋玻片常常規(guī)泡酸、清洗、高壓消毒處置后備用。結(jié)腸癌HT細(xì)胞培育于含 10%小牛血清 ( 杭州四季青生物制品公司) 的 RPMI1640(Hyclon

7、e),在 37、5%的 CO、飽和濕度的培育箱中培育。 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，用 025%的胰蛋白酶消化，用含 10%小牛血清的 RPMI1640培育液制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為 5 ml。將細(xì)胞接種到預(yù)先放置蓋玻片的培育皿中，每孔接種 6 ml 。置 37 、 5%CO恒溫培育箱中培育 3 d ，待細(xì)胞接近長(zhǎng)成單層，改換培育液，加入丁酸鈉，使終濃度為 5 mmol/L，對(duì)照組加入等量的 PBS。經(jīng)丁酸鈉作用 24 h 后，終止培育。掏出蓋玻片，布氏鏡觀看。結(jié)果2 丁酸鈉對(duì) HT細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)的阻礙常規(guī)培育 24 h觀看，處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HT細(xì)胞呈巢狀生長(zhǎng)，巢內(nèi)細(xì)胞密集，細(xì)胞間連接緊密，細(xì)胞界

8、限不清。細(xì)胞巢較大，多見(jiàn)80個(gè)細(xì)胞組成的大細(xì)胞巢。巢內(nèi)細(xì)胞呈梭形或長(zhǎng)圓形，細(xì)胞大小差異，可見(jiàn)處于不同割裂期的細(xì)胞及雙核、多核細(xì)胞，細(xì)胞表現(xiàn)出活躍的生物學(xué)狀態(tài)。丁酸鈉 5 mmol/L 作用 24 h 后觀看，細(xì)胞明顯減少，細(xì)胞巢變小，巢內(nèi)細(xì)胞數(shù)多在 20，巢內(nèi)細(xì)胞松散，單個(gè)細(xì)胞界限清楚。視野內(nèi)幾乎見(jiàn)不到梭形細(xì)胞，細(xì)胞變成圓形，細(xì)胞大小趨于一致。 丁酸鈉對(duì) HT細(xì)胞形態(tài)的阻礙 正常培育 24 h 觀看，處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的 HT細(xì)胞核大，核漿比例可達(dá) 1，部份細(xì)胞表現(xiàn)為核漿比例倒置。細(xì)胞核形狀、大小不一，核仁清楚，核內(nèi)染色質(zhì)豐碩，積聚于核膜周圍。丁酸鈉 5 mmol/L 作用 24 h 后觀看，細(xì)胞

9、核內(nèi)染色質(zhì)呈塊狀聚集，折光性降低，呈現(xiàn)出凋亡細(xì)胞形態(tài)。正常培育的 HT細(xì)胞膜表現(xiàn)為明顯的不規(guī)那么性， 細(xì)胞呈不定形。 每一個(gè)細(xì)胞可見(jiàn) 20個(gè)胞質(zhì)突起，呈指狀、球狀或不規(guī)那么形，可見(jiàn)偽足的形成及迅速變形，形態(tài)多樣、多變。丁酸鈉5 mmol/L 作用24 h 后動(dòng)態(tài)觀看，每一個(gè)細(xì)胞可見(jiàn)3個(gè)球狀突起，轉(zhuǎn)變緩慢。 丁酸鈉對(duì) HT細(xì)胞貼壁運(yùn)動(dòng)的阻礙取經(jīng)胰酶消化的正常 HT單細(xì)胞懸液，滴于載玻片上，再加蓋玻片后當(dāng)即觀看。腫瘤細(xì)胞在貼壁生長(zhǎng)的進(jìn)程中胞漿豐碩，呈流動(dòng)性，細(xì)胞原生質(zhì)伸展和收縮，使細(xì)胞伸出偽足，細(xì)胞變形，以阿米巴樣運(yùn)動(dòng)完成貼壁事后繼續(xù)生長(zhǎng)。布氏鏡 6000 倍距離 1 min 持續(xù)記錄下的 HT細(xì)

10、胞的貼壁進(jìn)程，可見(jiàn)細(xì)胞貼壁迅速。丁酸鈉 5 mmol/L 作用 24 h 后，觀看 HT 細(xì)胞的胞漿流動(dòng)性減慢，偽足、突起較少，貼壁進(jìn)程明顯變緩。討論腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)特性與腫瘤細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)緊密相關(guān)。細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)，第一是伸出胞質(zhì)突， 胞漿隨之進(jìn)入胞質(zhì)突， 形成阿米巴樣運(yùn)動(dòng)。在體內(nèi)，當(dāng)腫瘤細(xì)胞離開(kāi)原發(fā)灶后，必需借助本身的阿米巴樣運(yùn)動(dòng)侵入細(xì)胞外基質(zhì)，進(jìn)而侵入繼發(fā)部位形成轉(zhuǎn)移瘤，完成體內(nèi)侵襲和轉(zhuǎn)移的進(jìn)程。體內(nèi)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移與腫瘤細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)性增強(qiáng)有關(guān)。而體外培育細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)那么表此刻細(xì)胞貼壁和生長(zhǎng)進(jìn)程中， 細(xì)胞膜的迅速轉(zhuǎn)變，細(xì)胞漿的快速流動(dòng)預(yù)示著細(xì)胞的生長(zhǎng)代謝活躍。丁酸鈉是一種組蛋白去乙?；敢种苿?/p>

11、通過(guò)抑制組蛋白去乙?；傅幕钚?，誘導(dǎo)腫瘤抑制基因的轉(zhuǎn)錄，增進(jìn)細(xì)胞分化，抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。由于其具有毒性小、抗腫瘤作用好的特點(diǎn)，最近幾年來(lái)被普遍用于白血病、胃癌、大腸癌、前列腺癌、乳腺癌和頭頸部腫瘤的研究 。本研究發(fā)覺(jué)， 丁酸鈉能夠抑制HT29細(xì)胞的運(yùn)輸能力，減弱其胞漿流動(dòng)，從而抑制HT29的貼壁進(jìn)程，丁酸鈉作用后，HT細(xì)胞形態(tài)變圓，細(xì)胞膜突起變少，細(xì)胞異型性減輕，細(xì)胞割裂減慢，明顯阻礙細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)。另外，由于用藥前細(xì)胞割裂活躍，處于割裂期的大細(xì)胞較多，細(xì)胞大小差異，致使細(xì)胞平均體積較大。丁酸鈉作用后，細(xì)胞大小趨于一致，細(xì)胞平均體積較用藥前減少約1，與李春蕊等6研究結(jié)果一致?？紤]可能與丁酸鈉

12、誘導(dǎo)p21WAF1等細(xì)胞周期調(diào)控基因的表達(dá)有關(guān)。但李豐等7在一般光鏡下觀看了丁酸鈉對(duì)低分化人結(jié)腸癌Clone2A 細(xì)胞形態(tài)的阻礙，發(fā)覺(jué)經(jīng)2 mmol/L丁酸鈉處置 4 d 后，細(xì)胞變長(zhǎng)，并伸出較長(zhǎng)的突起，趨向于成纖維細(xì)胞形態(tài)轉(zhuǎn)變。為何不同細(xì)胞對(duì)丁酸鈉表現(xiàn)不同的反映，機(jī)制不清，推測(cè)不同細(xì)胞株對(duì)藥物的靈敏性不同，也可能與丁酸鈉的濃度和作歷時(shí)刻有關(guān)。觀看藥物作用前后腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)變是體外評(píng)判藥物抗癌成效的重要指標(biāo)。一般光學(xué)顯微鏡只能觀看固定在載玻片上的細(xì)胞，不能進(jìn)行動(dòng)態(tài)觀看；倒置顯微鏡盡管能夠觀看到培育細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)，但因其放大倍數(shù)有限 ( 一樣放大倍數(shù)為40倍 ) ，不能清楚的觀看活細(xì)胞的微細(xì)結(jié)構(gòu)和

13、細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)狀態(tài)。電子顯微鏡在觀看細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)方面具有其他顯微鏡無(wú)可比擬的優(yōu)勢(shì)，但不能對(duì)活細(xì)胞進(jìn)行觀看，且標(biāo)本制作費(fèi)時(shí)、 復(fù)雜。布氏鏡具有 40 0 倍的持續(xù)調(diào)劑功能，同時(shí)具有相差、暗視野、微分干與分析、中密度及偏振光等多種功能，應(yīng)用布氏鏡對(duì)體外培育的細(xì)胞進(jìn)行動(dòng)態(tài)圖像掃描，能清楚、直觀地觀看到活細(xì)胞的微細(xì)結(jié)構(gòu)和動(dòng)態(tài)轉(zhuǎn)變。 通過(guò)丁酸鈉作用前后 HT29 細(xì)胞的轉(zhuǎn)變，能夠更直觀地觀看丁酸鈉對(duì) HT細(xì)胞生物學(xué)行為的阻礙。檢查只需將細(xì)胞培育在蓋玻片上，或?qū)⒓?xì)胞懸液直接滴于載玻片上直接觀看，無(wú)需固定、染色等處置，方式簡(jiǎn)便，圖像直觀。本研究發(fā)覺(jué)， HT呈巢狀生長(zhǎng)， 細(xì)胞割裂旺盛、 運(yùn)動(dòng)增強(qiáng)、貼壁進(jìn)程迅速，

14、 呈現(xiàn)十分活躍的生物學(xué)特性； 丁酸鈉能夠改變 HT的生長(zhǎng)狀態(tài)，抑制其生長(zhǎng)；布氏鏡能夠動(dòng)態(tài)地觀看藥物作用前后細(xì)胞形態(tài)、微細(xì)結(jié)構(gòu)及運(yùn)動(dòng)的轉(zhuǎn)變，是一項(xiàng)先進(jìn)的、具有有效價(jià)值的檢查技術(shù)。參考文獻(xiàn)陳意生，史景泉腫瘤分子細(xì)胞生物學(xué)北京：人民軍醫(yī)出版社， 2002 illenwater A,Zou CP,Zhong M， et of sodiumbutyrate on growth,differentiation,and apoptosis in head andnecksquamouscarcinomacelllineseadNeck,2000,22(3):247new strategyeidle U,Grossmann of histone deacetylases:ato targetepigeneticmodificationsforanticancertreatment nticancer Res,2000,20(3A):1471itvakDA,HwangKO,Evers BM,et ofapoptosisinhuman gastriccancerby sodium butyrate nticancerRes,2000,20(2A):779 noue H,Shiraki K,Ohmori S,et deacetylase inhibitors sensitiz