核酸的研究方法課件

1、核酸的研究方法課件核酸的研究方法課件第一節(jié) 核酸的分離、提純和定量測定第一節(jié) 核酸的分離、提純和定量測定核酸制備的原則核酸制備中共同需要注意的問題是防止核酸的降解和變性，要制備天然狀態(tài)的核酸，必須采用溫和的條件，防止過酸、過堿、避免劇烈攪拌，尤其重要的是防止核酸酶的作用。 核酸制備的原則核酸制備中共同需要注意的問題是防止核酸的降解和一、DNA的分離 1. 濃鹽法：SDS-濃鹽buffer破碎細胞離心，取上清加水，使DNP沉淀酚/氯仿去蛋白，純化一、DNA的分離 1. 濃鹽法：SDS-濃鹽buffer破碎二、RNA的分離 制備RNA通常需要注意3點：所有用于制備RNA的玻璃器皿都要經(jīng)過高溫焙烤，

2、塑料用具經(jīng)過高壓滅菌，不能高壓滅菌的用具要用0.1焦碳酸二乙酯(DEPC)處理，再煮沸以除凈DEPC。DEPC能使蛋白質(zhì)乙基化而破壞RNase活性。在破碎細胞的同時加入強變性劑(如胍鹽)使RNase失活。在RNA的反應體系內(nèi)加入RNase的抑制劑(如RNasin)。二、RNA的分離 制備RNA通常需要注意3點：常用的制備RNA方法 （1）不同功能RNA常分布于細胞的不同部位，分離這些RNA常需先用差速離心法，將細胞核、線粒體、葉綠體、胞質(zhì)體等各部分分開，再從這些部分中分離出RNA。（2）分離方法：用異硫氰酸胍苯酚氯仿抽提。（3）分離poly(A) mRNA通常采用寡聚胸腺嘧啶核苷酸(oligo

3、(dT)親和層析法 常用的制備RNA方法 （1）不同功能RNA常分布于細胞的不同三、核酸含量的測定法 1.紫外分光光度法（260nm）2.定磷法先用濃硫酸或過氯酸將有機磷水解成無機磷。在酸性條件下磷酸與鉬酸作用生成磷鉬酸，在還原劑存在下被還原成鉬藍（660nm），通過測定磷含量計算出核酸含量 三、核酸含量的測定法 1.紫外分光光度法（260nm）3.定糖法（1）當RNA與鹽酸共熱時核糖轉(zhuǎn)變?yōu)榭啡?，它與甲基苯二酚(地衣酚)反應呈鮮綠色（670nm），反應需要三氯化鐵作催化劑 （2）DNA在酸性溶液中與二苯胺共熱，其脫氧核糖可參與反應生成藍色化合物，最大吸收峰在595 nm處 3.定糖法第二節(jié) 核

4、酸的凝膠電泳第二節(jié) 核酸的凝膠電泳常用的凝膠電泳有瓊脂糖(agarose)凝膠電泳和聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）?？梢栽谒交虼怪钡碾娪静壑羞M行。 常用的凝膠電泳有瓊脂糖(agarose)凝膠電泳和聚丙烯酰胺 一、瓊脂糖凝膠電泳 常用于分析DNA和RNA。由于瓊脂糖制品中往往帶有核糖核酸酶雜質(zhì)，所以用于分析RNA時，必須加入蛋白質(zhì)變性劑，如甲醛等 ；電泳完畢后，將膠在熒光染料溴化乙錠的水溶液中染色 ；經(jīng)紫外光照射可發(fā)射出紅橙色熒光 一、瓊脂糖凝膠電泳 常用于分析DNA和RNA。由于瓊脂糖制瓊脂糖凝膠電泳的應用1. 可以確定是否存在核酸物質(zhì)。2.可以近似測定DNA片段的分子大小和含量3.凝膠上

5、的樣品可以回收，以供進一步研究 2000bp1500bp1000bp750bp500bp250bp瓊脂糖凝膠電泳的應用1. 可以確定是否存在核酸物質(zhì)。2000二、聚丙烯酰胺凝膠電泳 聚丙烯酰胺凝膠的孔徑比瓊脂糖膠要小，所以可用于分析相對分子質(zhì)量小于1 000 bp的DNA片段和RNA的電泳。聚丙烯酰胺中一般不含有RNase，用于RNA的分析不會分解樣品 二、聚丙烯酰胺凝膠電泳 聚丙烯酰胺凝膠的孔徑比瓊脂糖膠要小，第三節(jié) 核酸的核苷酸序列測定 第三節(jié) 核酸的核苷酸序列測定 一、酶法測序 Sanger于1975年設計，又稱為“加減法” 工作原理：先隨機合成片段，然后除去4種dNTP分為8份只加一種

6、一、酶法測序 Sanger于1975年設計，又稱為“加減法”PAGE膠電泳ATGCTGTACGACTACGACTACGTACGTATGCTGTACGATACGATATATA對照-C -T -A -G +C +T +A +GPAGE膠電泳ATGCTGATGCTG對照-C 1977年Sanger又提出了 “終止法”共分4組，每組按一定比例加入一種2，3雙脫氧核苷三磷酸；能隨機摻入合成的DNA鏈，一旦摻入DNA合成即終止 ；經(jīng)變性膠電泳，可從自顯影圖譜上直接讀出DNA序列 1977年Sanger又提出了 “終止法”二、DNA的化學法測序 化學法測序由Maxam和Gilbert于1977年所發(fā)明?；?/p>

7、原理：用特異的化學試劑作用于DNA分子中不同堿基，然后用哌啶切斷反應堿基的多核苷酸鏈。用4組不同的特異反應，就可以使末端標記的DNA分子切成不同長度的片段，其末端都是該特異的堿基。經(jīng)變性膠電泳和放射自顯影得到測序圖譜。 二、DNA的化學法測序 化學法測序由Maxam和Gilbe 4組特異的反應如下：(1) G反應 用硫酸二甲酯使鳥嘌呤上的N7原子甲基化，加熱引起甲基化鳥嘌呤脫落，多核苷酸鏈可在該處斷裂。(2) G+A反應 用甲酸使A和G嘌呤環(huán)上的N原子質(zhì)子化，從而使其糖苷鍵變得不穩(wěn)定，再用哌啶使鍵斷裂。(3) T+C反應 用肼使T和C的嘧啶環(huán)斷裂，再用哌啶除去堿基。(4) C反應 當有鹽存在時

8、，只有C與肼反應，并被哌啶除去。哌啶促使修飾堿基脫落，并使去掉堿基的磷酸二酯鍵斷裂。 4組特異的反應如下：第四節(jié) DNA聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction; PCR) 第四節(jié) DNA聚合酶鏈反應(polymerase c聚合酶鏈式反應(PCR)是利用單鏈寡核苷酸引物對特異DNA片段進行體外快速擴增的一種方法。該反應是一指數(shù)式反應，其可在短時間內(nèi)使目的片段的擴增量達到106倍，可從極微量的DNA乃至單細胞含有的DNA起始，擴增出ug級的PCR產(chǎn)物。自20世紀80年代中期PCR技術(shù)問世以來，迅速滲透到了分子生物學的各個領域，現(xiàn)已在基因克隆、外源基因的整合檢測、物種起源、生物進化等方面得到了廣泛應用。聚合酶鏈式反應(PCR)是利用單