分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)PCR擴(kuò)增目的基因

1、分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn) PCR擴(kuò)增目的基因?qū)嶒?yàn)?zāi)康?(1)PCR擴(kuò)增目的基因紅細(xì)胞生成因子nap基因 部分片段；(2)掌握PCR擴(kuò)增原理；(3)學(xué)習(xí)并熟悉PCR操作實(shí)驗(yàn)原理(1)PCR反應(yīng)原理溫度（）時(shí)間（min）94726094變性（1min）60 退火（1min）72 延伸（1.5min）循環(huán)1 循環(huán)2 循環(huán)3模板核酸 （ template如：人基因組DNA 0.1ug)擴(kuò)增引物 （primer一對(duì),各0.25umol/L）TaqDNA聚合酶（2.5U）dNTP （四種：各200umol/L)標(biāo)準(zhǔn)的緩沖液 10X buffer（KCl、Tris-HCl、 MgCl2、BSA或明膠）無(wú)菌雙蒸水或三蒸

2、水石蠟油或礦物油 3050ul（封閉、防止高溫時(shí)液體的 揮發(fā)）(2)PCR反應(yīng)體系總體系一般采用25或50ul 實(shí)驗(yàn)步驟(1)配制PCR反應(yīng)體系 25 l 10X PCR Buffer 2.5dNTP 2Primer F 1Primer R 1Template 1Taq 0.5H20 17(2)設(shè)置PCR反應(yīng)條件 95 5min 94 30 sec 55 30sec 72 30sec 72 5min33cycles實(shí)驗(yàn)結(jié)果瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR反應(yīng)結(jié)果，在500bp左右有明顯擴(kuò)增條帶。實(shí)驗(yàn)二質(zhì)粒DNA的堿法小量制備 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?學(xué)習(xí)利用堿法小量制備質(zhì)粒實(shí)驗(yàn)原理(一) 細(xì)菌培養(yǎng)物的生長(zhǎng) 從瓊脂平

3、板上挑取一個(gè)單菌落，接種到培養(yǎng)物中(有含有行當(dāng)抗生素的液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng))，然后從中純化質(zhì)粒。 (二) 細(xì)菌的收獲和裂解(1)大質(zhì)粒(大于15kb)容易受損，故應(yīng)采用漫和裂解法從細(xì)胞中釋放出來(lái)。 (2)可用更劇烈的方法來(lái)分離小質(zhì)粒 在加入EDTA后，有時(shí)還在加入溶菌酶后讓細(xì)菌暴露于去污劑，通過(guò)煮沸或堿處理使之裂解。這些處理可破壞堿基配對(duì)，故可使宿主的線狀染色體DNA變性，但閉環(huán)質(zhì)粒DNA鏈由于處于拓?fù)淅p繞狀態(tài)而不能彼此分開(kāi)。當(dāng)條件恢復(fù)正常時(shí)，質(zhì)粒DNA鏈迅速得到準(zhǔn)確配置，重新形成完全天然的超螺旋分子。實(shí)驗(yàn)步驟(一) 細(xì)菌的收獲和裂解1. 收獲(1)將2ml含相應(yīng)抗生素的加入到容量為15ml 并通

4、氣良好（不蓋緊）的試管中，然后接入一單菌落，于30劇烈振搖下培養(yǎng)過(guò)夜。(2) 將1.5ml培養(yǎng)物倒入微量離心管中，用微量離心機(jī)于4以12000g離心30秒，將剩余的培養(yǎng)物貯存于4。(3) 吸去培養(yǎng)液，使細(xì)菌沉淀盡可能干燥。除去上清的簡(jiǎn)便方法是用一次性使用的吸頭與真空管道相連，輕緩抽吸，并用吸頭接觸液面。當(dāng)液體從管中吸出時(shí)，盡可能使吸頭遠(yuǎn)離細(xì)菌沉淀，然后繼續(xù)用吸頭通過(guò)抽真空除去附于管壁的液滴。2. 堿裂解法 (1)將細(xì)菌沉淀，所得重懸于100l用冰預(yù)冷的溶液中，劇烈振蕩。 溶液50mmol/L葡萄糖25mmol/L Tris-Cl(pH8.0)10mmol/L EDTA(pH8.0) 溶液可成批

5、配制，每瓶約100ml,在10lbf/in2(6.895104Pa) 高壓下蒸氣滅菌15分鐘，貯存于4。須確使細(xì)菌沉淀在溶液中完全分散，將兩個(gè)微量離心管的管底部互相接觸震蕩，可使沉淀迅速分散。 (2) 加200l新配制的溶液。 溶液0.2mol/L NaOH（臨用前用10mol/L貯存液現(xiàn)用現(xiàn)稀釋?zhuān)?%SDS 蓋緊管口，快速顛倒離心管次，以混合內(nèi)容物。應(yīng)確保離心管的整個(gè)內(nèi)表面均與溶液接觸。不要振蕩，將離心管放置于冰上。(3) 加150l用冰預(yù)冷的溶液 溶液5mol/L乙酸鉀 60ml冰乙酸 11.5ml水 28.5ml所配成的溶液對(duì)鉀是3mol/L，對(duì)乙酸根是5mol/L。 蓋緊管口，將管倒置

6、后和地振蕩10秒鐘溶液在粘稠的細(xì)菌裂解物中分散均勻，之后將管置于冰上分鐘。(4) 用微量離心機(jī)于412 000g離心5分種，將上清轉(zhuǎn)移到另一離心管中。(5) 可做可不做：加等量酚：氯念， 振蕩混勻， 用微量離心機(jī)于4 以12000g離心2分鐘，將上清轉(zhuǎn)移到另一良心管中。(6) 用2倍休積的乙醇于室溫沉淀雙錠DNA。振蕩混合, 于室溫放置2分鐘。(7) 用微量離心機(jī)于4以12 000g離心分鐘。(8) 小心吸去上清液，將離心管倒置于一張紙巾上，以使所有液體流出。再將附于管壁的液滴除盡。除去上清的簡(jiǎn)便方法是用一次性使用的吸頭與真空管道相連，并用吸頭接觸液面。當(dāng)液體從管中吸出時(shí)，盡量使吸頭遠(yuǎn)離核酸沉

7、淀，然后繼續(xù)用吸頭通過(guò)抽真空除去附于管壁的液滴。實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論 質(zhì)粒制備后，實(shí)驗(yàn)結(jié)果要通過(guò)普通瓊脂糖凝膠電泳來(lái)分析。由于一般質(zhì)粒提取后可能存在的超螺旋、線狀和開(kāi)環(huán)三種形態(tài)，使具有相同分子質(zhì)量，因構(gòu)型不同也會(huì)造成電泳時(shí)受到的阻力不同，最終造成泳動(dòng)速率的不同。 常規(guī)電泳中質(zhì)粒DNA分子的3種構(gòu)型泳動(dòng)速率：超螺旋最快、線狀分子次之，開(kāi)環(huán)分子最慢。細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)密度梯度離心法提取葉綠體一、實(shí)驗(yàn)原理 用低溫研磨的方法將植物組織、細(xì)胞破碎，細(xì)胞內(nèi)不同的組分游離在酸堿度和滲透壓與親體狀態(tài)下均接近的勻漿介質(zhì)中。將上述含細(xì)胞不同組分的勻漿介質(zhì)加入到預(yù)先鋪制好的蔗糖密度梯度介質(zhì)中，低溫高速離心后，在離心力的作用下

8、，沉降系數(shù)不同的組分，就會(huì)出現(xiàn)在離心管內(nèi)不同的位置，達(dá)到分離、制備的目的。二、目的和要求通過(guò)此試驗(yàn)，使學(xué)生學(xué)習(xí)密度梯度離心法提取植物葉綠體的技術(shù)，鞏固掌握非染色法觀察細(xì)胞器的方法。三、實(shí)驗(yàn)材料和儀器新鮮菠菜葉子組織搗碎器、普通離心機(jī)、高速冷凍離心機(jī)、離心管、燒杯、漏斗、紗布、載玻片、蓋玻片、顯微鏡、剪刀、滴管。四、藥品及試劑配制蔗糖、三羥甲基甲胺（Tris）、HCl。勻漿介質(zhì)（0.5M蔗糖、0.05M Tris-HCl緩沖液PH7.4）：稱(chēng) 85.55克蔗糖、6.05克Tris，溶解在近800毫升蒸餾水中，加入4.25毫升0.2NHCl，加蒸餾水到100毫升。五、實(shí)驗(yàn)步驟1.洗凈菠菜葉，盡可能

9、使它干燥，去除葉柄、主脈后，稱(chēng)取5克，剪碎。2.加入預(yù)冷到接近0的勻漿介質(zhì)20毫升，高速搗碎2分鐘。3.用雙層紗布過(guò)濾。4.濾液500rpm離心5分鐘，去沉淀。5.在離心管內(nèi)依次加入50%、15%蔗糖溶液制成梯度。6.在梯度液面上輕輕加入樣品。7. 8000rpm,低溫離心20分鐘。8.葉綠體在梯度液中間形成帶，用滴管輕輕吸出滴于載玻片上，蓋上蓋玻片，顯微鏡下觀察葉綠體的形態(tài)。六、注意事項(xiàng)1、配制勻漿介質(zhì)和離心介質(zhì)時(shí)要準(zhǔn)確。過(guò)高或過(guò)低的酸堿度和滲透壓可能造成細(xì)胞內(nèi)組分的裂解。2、各實(shí)驗(yàn)步驟中要盡量在低溫下進(jìn)行，高溫同樣造成細(xì)胞內(nèi)組分的裂解。3、蔗糖密度梯度鋪制時(shí)要小心，防止因用力過(guò)猛使上、下層

10、離心介質(zhì)混合，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。七、作業(yè)1.繪制你看到的葉綠體形態(tài)。2.你分離的葉綠體是否純凈？試分析原因。生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康牧私饪捡R斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白質(zhì)的原理掌握考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度的操作步驟二、實(shí)驗(yàn)原理根據(jù)蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)，有多種蛋白質(zhì)定量方法?？捡R斯亮藍(lán)G-250（Coomassie brilliant blue G-250）染料，在游離狀態(tài)下溶液呈棕紅色，當(dāng)它與蛋白質(zhì)結(jié)合后變?yōu)樗{(lán)色。蛋白質(zhì)含量在01000g范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)-色素結(jié)合物在595nm下的吸光度與蛋白質(zhì)含量成正比，故可用比色法進(jìn)行定量分析?？捡R斯亮藍(lán)G-250法（Bradford法）是比色法與色

11、素法相結(jié)合的復(fù)合方法，簡(jiǎn)便快捷，靈敏度高，穩(wěn)定性好，是一種較好的蛋白質(zhì)常用分析方法。考馬斯亮藍(lán)G-250法有常量法和微量法兩種。Bradford法的突出優(yōu)點(diǎn)是：（1）靈敏度高：蛋白質(zhì)染料復(fù)合物具有很高的消光系數(shù)，因此蛋白質(zhì)測(cè)定的靈敏度較高，最低檢出量為1ug蛋白質(zhì)。據(jù)估計(jì)比Lowry法約高四倍， （2）測(cè)定快速、簡(jiǎn)便：染料與蛋白質(zhì)的結(jié)合，大約只需2分鐘，結(jié)合物的顏色在1小時(shí)內(nèi)是穩(wěn)定的。因而完全不用像Lowry法那樣費(fèi)時(shí)和嚴(yán)格地控制時(shí)間。（3）干擾物質(zhì)少。如干擾Lowry法的K+、Na+、Mg2+離子、Tris緩沖液、糖和蔗糖、甘油、巰基乙醇、EDTA等均不干擾此測(cè)定法。 三、儀器和試劑1儀器：

12、 0.1ml、1ml、5ml移液管；試管14個(gè)；分光光度計(jì)等。2試劑： （1）0.9% NaCl溶液； （2）標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液：稱(chēng)取10mg 牛血清白蛋白，溶于蒸餾水并定容至100ml，制成0.1mg/ml 的原液。 （3）考馬斯亮藍(lán)G-250（0.01%）染液：稱(chēng)取0.1g考馬斯亮藍(lán)G-250，溶于50ml 90%乙醇中，加入85%（m/v）的磷酸100ml，最后用蒸餾水定容至1000ml。 （4）樣品液：健康人血清。四、操作步驟10100gmL標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作： 取14支具塞試管，分成兩組，編號(hào)后，按下表加入試劑（6-11管與0-5管重復(fù)），將各試管中溶液混勻，室溫靜置5min后，以管0為空白對(duì)照，在595nm下比色測(cè)定。以標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)含量（g）為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線。表1 各管加入的各種試劑量：管號(hào)012345蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液（ml）00.10.20.30.40.60.9%NaCl溶液（ml）1.00.90.80.70.60.4考馬斯亮藍(lán)染液555555蛋白質(zhì)含量（g）01020304060A595 2樣品中蛋白質(zhì)含量的測(cè)定 另取兩支干凈的試管（做一重復(fù)），加入合適濃度的待測(cè)樣品，使其測(cè)定值在標(biāo)準(zhǔn)曲線的范圍內(nèi)，測(cè)定方法同上，由樣品液的吸光度查標(biāo)準(zhǔn)曲線即可求出含量。計(jì)算 樣品的蛋白質(zhì)含量（g/g鮮重）=查得的蛋白質(zhì)含量（g） / 樣品鮮重（g）五、注意事項(xiàng)1.