臨床生物化學(xué)：第21章 臨床生化檢驗方法與試劑盒評價

1、臨床生化檢驗方法與試劑盒評價第2頁教學(xué)目標與要求 掌握校準品的分類和正確使用；測定系統(tǒng)的概念和比對；試劑盒的性能指標和評價方法。 熟悉方法學(xué)性能指標和評價；量值溯源和量值傳遞的概念；液體雙試劑的優(yōu)點。 了解試劑盒的分類和發(fā)展趨勢。第3頁第3頁第3頁 臨床生化檢驗方法的性能評價 臨床生化檢驗試劑盒的性能評價 臨床生化檢驗方法分級和標準品 主要內(nèi)容第4頁臨床生化檢驗方法分級 一 二 三第一節(jié) 臨床生化檢驗方法分級和標準品 臨床生化檢驗的參考物質(zhì)和校準品 量值溯源檢測系統(tǒng)的比對 四第5頁 是指準確度最高，系統(tǒng)誤差最小，經(jīng)過詳細的研究，沒有發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生誤差的原因或在某些方面不夠明確的方法。決定性方法參考方

2、法 是指準確度與精密度已經(jīng)充分證實的分析方法，干擾因素少，系統(tǒng)誤差與重復(fù)測定的隨機誤差相比可以忽略不計，有適當?shù)撵`敏度、特異性及較寬的分析范圍。常規(guī)方法 是指性能指標符合臨床或其他目的需要，有足夠的精密度、準確度、特異性和適當?shù)姆治龇秶?，而且?jīng)濟實用。 一臨床生化檢驗方法分級第6頁決定性方法（definitive method）也稱為一級參考方法（primary reference method)參考方法（reference method）也稱為二級參考方法（secondary reference method）常規(guī)方法（routine method） 推薦方法（recommended met

3、hod） 第7頁表21-1 臨床生化檢驗項目的決定性方法、參考方法、常規(guī)方法 項目決定性方法 參考方法 常規(guī)方法鈣ID-MS原子吸收分光光度法鄰甲酚酞絡(luò)合酮法、偶氮胂法氯ID-MS、中子活化法庫侖分析法硫氰酸汞法、選擇性電極法鎂ID-MS原子吸收分光光度法MTB 法鉀ID-MS、中子活化法火焰光度法離子選擇電極法、火焰光度法鈉中子活化法火焰光度法離子選擇電極法、火焰光度法清蛋白-免疫化學(xué)法溴甲酚綠法總蛋白-凱氏定氮法雙縮脲法肌肝ID-MS離子交換層析法苦味酸法、酶法第8頁表21-1臨床生化檢驗項目的決定性方法、參考方法、常規(guī)方法 項目決定性方法 參考方法 常規(guī)方法尿素ID-MS尿素酶法二乙酰一

4、肟法、酶法尿酸ID-MS尿酸酶法（紫外）磷鎢酸比色法膽紅素-重氮反應(yīng)法J-G 法、釩酸鹽氧化法葡萄糖ID-MS已糖激酶法葡萄糖氧化酶法膽固醇ID-MSAbell-Kendall 法酶法第9頁 （primary reference materials）也稱一級標準品，與決定性方法平行，用于驗證決定性方法、評價與校準參考方法，以及為二級標準品定值。 原級參考物質(zhì)次級參考物質(zhì) （secondary reference materials）也稱二級標準品 ，二級標準品的定值源于一級標準品和參考方法，主要用于評價常規(guī)方法，也可為質(zhì)控物定值。 常規(guī)校準品 常規(guī)校準品除少數(shù)項目如電解質(zhì)用純物質(zhì)水溶液外，大多

5、數(shù)采用混合血清基質(zhì)。 二臨床生化檢驗的參考物質(zhì)和校準品 第10頁校準（calibration）是一個測試和調(diào)整儀器、試劑盒或者檢測系統(tǒng)，以提供檢測反應(yīng)和所測物質(zhì)之間的已知關(guān)系的過程電解質(zhì)、酶類、其他生化指標應(yīng)合理選擇校準品第11頁標準品校準品質(zhì)控品一級標準品用高純化學(xué)物質(zhì)（純度99.98%）直接通過稱重配制的溶液。一般由國家標準計量局出具證書。二級標準品某種成分的濃度可用公認的參考方法測定。由參考實驗室或權(quán)威學(xué)術(shù)組織出具證書，如SRM、BCR、IFCC。標準品(standard）可用做校準品(calibrater)考慮血清成分復(fù)雜、難以避免基質(zhì)效應(yīng) ，建議用與新鮮血清相似的介質(zhì)做校準品，校準品

6、的量值應(yīng)有溯源性，不同測定系統(tǒng)賦值不同。質(zhì)控品多是成分相對穩(wěn)定的混合血清，分為定值和非定值、凍干或液體，添加了防腐劑和保護劑等。定值往往由試劑盒供應(yīng)商委托幾家實驗室在特定測定系統(tǒng)上測得的均值和標準差。第12頁標準品與校準品大多數(shù)定量的方法（分光光度法、電化學(xué)、免疫定量）都需要用標準品校準，即通過標準比較來計算。用什么“標準”來校準？羅氏公司的C.f.a.s （calibrator for automation system），屬于多項校準品，因使用方便，很多實驗室都在使用。但前提是“指定的測定系統(tǒng)”。第13頁圖21-1 各級參考物質(zhì)和校準品的關(guān)系及其量值傳遞過程第14頁三量值溯源溯源性溯源性(

7、traceability）是指通過一條具有規(guī)定不確定度（uncertainty）的不間斷的比較鏈，使測量結(jié)果或測量標準的值能夠與規(guī)定的參考標準（通常是國家或國際測量標準）聯(lián)系起來的特性，稱為溯源性。其不間斷的比較鏈稱為溯源鏈第15頁測量不確定度測量不確定度是指表征合理地賦予被測之值的分散性。是與測量結(jié)果相聯(lián)系的參數(shù)，可理解為排除系統(tǒng)誤差之外的所有隨機誤差的合成方差。第16頁圖21-2 量值溯源和量值傳遞途徑理想的量值溯源的理想情況是可溯源至國際單位制（SI）單位第17頁四檢測系統(tǒng)的比對完成一個項目檢驗所涉及的儀器、試劑、校準品、質(zhì)控品、操作程序、質(zhì)量控制、保養(yǎng)計劃等的組合稱為檢測系統(tǒng)（test

8、ing system）。常規(guī)檢測系統(tǒng)有配套檢測系統(tǒng)和自建檢測系統(tǒng)。檢測系統(tǒng)的概念第18頁 .配套檢測系統(tǒng) 自建檢測系統(tǒng) （一）檢測系統(tǒng)的分類整個檢測系統(tǒng)涉及的各個部分完全按照指定廠商要求配套使用。若該系統(tǒng)已經(jīng)國家法定部門認證,則使用這樣的檢測系統(tǒng)對臨床樣品進行檢驗，其結(jié)果具溯源性。實驗室自行建立的檢測系統(tǒng)，如A制造商的試劑盒、B制造商的校準品、C制造商分析儀的組合。第19頁（二）檢測系統(tǒng)比對的實施步驟1. 制訂分析質(zhì)量目標 臨床實驗室根據(jù)臨床需求和實際能力制訂，包括允許不精密度、允許偏倚和允許總誤差，可參照1988年美國臨床實驗室修正案（clinical laboratory improvem

9、ent amendment,CLIA88）。第20頁2.對儀器性能進行評價 保證儀器處于良好的工作狀態(tài)，具備可接受的精密度和準確度。3. 確定對比檢測系統(tǒng) 比如具有溯源文件的HK法測定血糖的配套檢測系統(tǒng)，并對該檢測系統(tǒng)的性能進行驗證，核實其準確度和精密度。第21頁4. 評價檢測系統(tǒng)的分析性能 評價內(nèi)容至少包括精密度、準確度、可報告范圍、分析靈敏度、分析特異性和參考區(qū)間等，應(yīng)符合試劑盒制造商規(guī)定的要求。5.比對 同時用兩個系統(tǒng)測定同一批臨床樣品和質(zhì)控品，樣品數(shù)量以40-100例為宜，每個樣品平行測定2次，樣品被分析物濃度應(yīng)覆蓋可報告范圍的上限和下限。第22頁6.可接受性判斷 按照美國國家臨床和實

10、驗室標準研究院(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)建議的EP5-A和EP9-A2方案，對兩個系統(tǒng)進行精密度評價和方法對比及偏差評估，并對可接受性進行判斷。若符合分析質(zhì)量目標，則該檢測系統(tǒng)可以應(yīng)用于臨床。否則需對自建檢測系統(tǒng)修改后重新比對。第23頁制訂分析質(zhì)量目標 儀器性能評價 確定對比檢測系統(tǒng) 內(nèi)容初步評價檢測系統(tǒng)比對允許不精密度、允許偏倚和允許總誤差 準確度和精密度 參考系統(tǒng)或公認的測定系統(tǒng)性能指標40-100例（二）檢測系統(tǒng)比對的實施步驟可接受性判斷步驟第24頁測定系統(tǒng)方法學(xué)操作程序校準品儀器試劑配方和來源測定系統(tǒng)的關(guān)鍵要素第

11、25頁 1 2統(tǒng)一方法：以方法學(xué)評價為基礎(chǔ)，提出參考方法或推薦方法。統(tǒng)一試劑的主要成分和測定條件。實施機構(gòu)：國際臨床化學(xué)學(xué)會、臨檢中心逐級溯源：常規(guī)校準品應(yīng)向二級標準品、一級標準溯源。實施機構(gòu)：ISO、國家標準計量局、參考實驗室、試劑盒供應(yīng)商、臨床實驗室全球性可比性戰(zhàn)略實施33保證儀器良好的工作狀態(tài)、嚴格的操作規(guī)程和質(zhì)量控制、實驗室內(nèi)部測定系統(tǒng)的比對、實驗室間的比對第26頁方法學(xué)的性能指標 一 二 三第二節(jié) 臨床生化檢驗方法的性能評價 方法學(xué)性能評價的內(nèi)容 方法學(xué)評價試驗 臨床生物化學(xué)方法學(xué)性能判斷 四第27頁 可靠性 實用性 一 方法學(xué)性能指標準確度精密度方便性 經(jīng)濟性安全性 簡單快速可測范

12、圍第28頁 準確度（accuracy）的傳統(tǒng)定義是指測定值與“真值”的接近程度。是指一次測定的結(jié)果與被測物真值的接近程度。 準確度正確度 “正確度”（trueness），是指一系列測定結(jié)果得到的均值與“真值”的接近程度。通常以偏倚（bias）來表示 精密度 精密度（precision）是指在規(guī)定條件下，相互獨立的檢測結(jié)果間的一致程度。不精密度（imprecision）通常用標準差（S）和變異系數(shù)（CV%）來表示 第29頁表21-3 臨床生化檢驗方法的誤差及評價方法系統(tǒng)誤差誤差分類評價試驗評價指標理想結(jié)果比例系統(tǒng)誤差回收試驗回收率95-105%恒定系統(tǒng)誤差干擾試驗干擾值接近0比例系統(tǒng)誤差方法對比

13、試驗Y=a+bXb接近1.0恒定系統(tǒng)誤差a接近0隨機誤差重復(fù)性試驗（批內(nèi)、批間、日間）、總不精密度CV3%二 方法學(xué)性能評價內(nèi)容第30頁三 方法學(xué)評價實驗 美國國家臨床實驗室標準委員會（NCCLS）于2005年更名為臨床和實驗室標準研究院（CLSI）。制訂了一系列評價方案（evaluation protocols，EP），包括:臨床化學(xué)設(shè)備精密度評價（EP5-A）定量分析方法的線性評價（EP6-A）干擾試驗（EP7-A）方法對比評價及偏差評估（EP9-A2）定量方法的初步評價（EP10-A2）定性方法的評價（EP12-A）基質(zhì)效應(yīng)評價（EP14-A）、。EP不僅可用來評價臨床生物化學(xué)檢驗方法性

14、能，也可用以評價試劑盒和分析儀器的性能。第31頁回收試驗 干擾試驗 線性試驗 重復(fù)性試驗對比試驗檢測限與檢測范圍批內(nèi)批間 日內(nèi)日間總不精密度三 方法學(xué)評價實驗準確度第32頁（一）重復(fù)性試驗1.試驗樣品 一般選擇2個，一個在參考區(qū)間附近，另一個為異常值2.初步的批內(nèi)精密度評價：即一個樣品重復(fù)測定20次，計算出均值，標準差和變異系數(shù)。用2個樣品每天測定2批，批間測定間隔不得少于2h，每批平行測定2份，至少共測定20天，80個數(shù)據(jù)。每對結(jié)果間的差（共40個）代表批內(nèi)差；2批均值之間的差（共20個）代表批間差；每天4個結(jié)果的均值（共20個）代表日間差。每批測定至少做一個質(zhì)控。第33頁（二）回收試驗 所

15、謂回收即評定方法正確測定加入常規(guī)樣品中的純分析物的能力。 即在未知濃度的常規(guī)樣品中加入一定量的待測組分，檢測加入前后該組分的增加量，實際增加量與理論加入量的比值就是回收率。 目的是測定比例系統(tǒng)誤差 。 第34頁3. 回收率計算 加入濃度= 標準液濃度 回收濃度 = 分析樣品測得濃度 基礎(chǔ)樣品測得濃度回收率（%）= 一般要求回收率95-105% 第35頁（三）干擾試驗干擾是指在測定某分析物時，受其他非分析物的影響而導(dǎo)致測定結(jié)果增高（正干擾）或降低（負干擾）。根據(jù)干擾的產(chǎn)生原因分為：基質(zhì)效應(yīng)、非特異反應(yīng)、外部干擾物等。干擾試驗的設(shè)計同回收試驗，即將不同濃度的干擾物代替純標準品。一般規(guī)定只對膽紅素、

16、血紅蛋白、脂類做干擾試驗。干擾值加入干擾物后的測定值基礎(chǔ)測定值 第36頁（四）線性試驗線性試驗用來評價劑量和反應(yīng)之間的線性關(guān)系，并把呈直線部分確定為線性范圍（linear range）。線性范圍指檢測信號與被測物濃度呈線性時的被測物濃度范圍。 1.樣品濃度 線性評價至少應(yīng)有5個不同濃度，可選擇低值和高值樣品各一份，低值樣品和高值樣品分別按體積3：1混勻、等份混勻、1:3 混勻，形成5個不同濃度。2.試驗方法 將不同濃度的樣品（X），隨機排列，每個樣品重復(fù)測定4次（Y），并要求在當天完成所有分析。 第37頁 濃度范圍應(yīng)以分析項目的線性要求為準。 線性評價應(yīng)有5個不同濃度，可選擇低值和高值標本各一

17、個，低值標本為1號，高值標本為5號，二者3:1混勻為2號，等份混勻為3號，1:3混勻為4號，2-4號標本的濃度按下式計算： C2 = 3/4C1 +1/4C5 C3 = 1/2C1 +1/2C5 C4 = 1/4C1 +3/4C5第38頁繪圖 在坐標圖紙上繪制X-Y（濃度-吸光度）關(guān)系圖，觀察線性關(guān)系。線性擬合 直線擬合方程為Y=b0+b1X； 拋物線反應(yīng)曲線的擬合方程為Y= b0+b1X+b2X2； “S”形反應(yīng)曲線擬合方程為Y= b0+b1X+ b2X2+b3X3數(shù)據(jù)整理與離群點檢查線性失擬誤差檢查或非線性度計算 第39頁（五）對比試驗對比試驗是指分別用兩種方法測定一組不同濃度和病理情況的

18、臨床樣品，測定結(jié)果進行回歸分析。比較方法應(yīng)選擇參考方法或公認的常規(guī)方法，測定偏差主要來源于評價方法。1.試驗樣品 應(yīng)收集新鮮的正常和異常的臨床樣品，應(yīng)有足夠?qū)挼臐舛确秶?，各濃度樣品?shù)量應(yīng)有合適的比例。2.樣品測定 樣品數(shù)至少為40個，每個樣品用2種方法分別作雙份測定。每天測定8個樣品，雙份測定時第一次按順序1，27，8，第二次8，72，1，共測試5天。第40頁（六）檢測限檢測低限通常是指能與適當?shù)摹翱瞻住弊x數(shù)相區(qū)別的待測物的最小量。方法是做空白平行試驗（一般20次），以蒸餾水調(diào)零，讀取各次吸光度，計算均值（Ab）和標準差(S)。以Ab+3S表示與“空白”讀數(shù)相區(qū)別的最小吸光度，將其換算成濃度，

19、作為該法的檢測低限臨床實驗室以生物檢測限更為重要，需采用接近檢測低限的生物檢測限樣品來確定，能更真實地反映實際檢測限水平樣品測定的不確定度。第41頁四 方法學(xué)性能判斷在坐標圖紙上繪制X-Y（濃度-吸光度）關(guān)系圖，觀察線性關(guān)系。第42頁臨床生化試劑盒的質(zhì)量標準 一 二 三第三節(jié) 臨床生化檢驗試劑盒的性能評價 臨床生化檢驗試劑盒的分類 臨床生化試劑盒的性能指標及評價 臨床生化試劑盒的發(fā)展趨勢 四第43頁體外診斷試劑體外診斷試劑（in vitro diagnosis reagents）用于完成一個特定體外診斷檢驗，而包裝在一起的一組組分。試劑盒組分可包括抗體、酶、緩沖液、稀釋液、校準物、控制物或其它

20、物品和材料。 第44頁 一 臨床生化試劑盒的質(zhì)量標準臨床化學(xué)體外診斷試劑（盒）通用技術(shù)要求2006臨床化學(xué)體外診斷試劑(盒)產(chǎn)品技術(shù)審評規(guī)范2011第45頁 單液體型 液體雙試劑 二 臨床生化試劑盒的分類單液體型特別適用于半自動生化分析儀和小型自動生化分析儀。穩(wěn)定性較差1.穩(wěn)定性能好 2.可消除樣品自身空白 3.提高抗干擾能力 4預(yù)反應(yīng)多項同測組合試劑 濃縮試劑 第46頁1.試劑空白吸光度 2.試劑空白變化速率 3.分析靈敏度4.線性范圍5.重復(fù)性7.穩(wěn)定性 8.臨床試驗 三 試劑盒性能指標和評價試劑盒6.準確度第47頁第48頁（一）試劑空白吸光度用蒸餾水調(diào)零，用指定的空白液加入試劑作為樣品測

21、試，在測試主波長下，記錄測試啟動時的吸光度（A1）和約5分鐘后的吸光度（A2），A2測試結(jié)果即為試劑空白吸光度測定值。 是判定試劑質(zhì)量的一個有效指標 改良賴氏法測定ALT NADH底物 色素原底物 第49頁第50頁（二）試劑空白變化速率對于速率法試劑盒，用指定的空白液加入試劑作為樣品測試時，在測試主波長下，記錄測試啟動時的吸光度（A1）和約5分鐘(T)后的吸光度（A2），計算試劑空白吸光度變化率（A/min）。測定試劑空白吸光度變化（A/min），用來檢查試劑在工作狀態(tài)下的穩(wěn)定性。但事實上，試劑空白吸光度變化速率無法反映試劑盒的穩(wěn)定性，試劑空白吸光度變化速率主要反映干擾程度和儀器的穩(wěn)定性。 第

22、51頁（三）分析靈敏度用吸光度差值（A）或吸光度變化（A/min）來表示單位濃度的被測物反應(yīng)所引起的信號變化，其含義類似摩爾消光系數(shù)。 分析靈敏度不是越高越好，以適合待測物檢測范圍為原則。分析靈敏度一般用于批間比較，較能反映制造商的配方、原料的一致性。 第52頁（四）線性范圍取高濃度樣品和低濃度樣品按不同比例混合成5個濃度做線性試驗。 試劑（盒）的線性范圍越寬，臨床復(fù)測幾率越小，但與樣品/試劑比例成反比 第53頁（五）重復(fù)性用質(zhì)量控制血清測試33（3個批號，每個批號取3瓶）批間差，較能反映制造商的配方、原料的一致性。干粉或凍干試劑還需測定批內(nèi)瓶間差，測定同一批號的試劑20瓶，用變異系數(shù)（CV）

23、來表示。 第54頁（六）準確度1.相對偏差 直接用試劑盒測定參考物質(zhì)（平行3次），評價測定均值與靶值的偏離程度。也可用由參考方法定值的高、中、低三個濃度的人混合血清，用試劑盒平行測定3次，計算均值與定值的相對偏差。 3.比對試驗 既無參考物質(zhì)、參考血清，也無標準品，也可用比對試驗來驗證準確度。 2.回收試驗 測定試劑盒若有標準品，也可用回收率衡量比例系統(tǒng)誤差。第55頁（七）穩(wěn)定性1.效期穩(wěn)定性 取已到效期的試劑盒按以上評價方法對試劑盒性能指標進行評價?？勺鳛閷徟囊罁?jù)，但對該批次的試劑盒的穩(wěn)定性意義不大。2.熱穩(wěn)定性試驗 對同批次試劑盒穩(wěn)定性目前沒有很好的評價方法。生化試劑盒一般置2-8保存，

24、為了快速有效地評價試劑盒的穩(wěn)定性，可以用加速試驗來估計。 3.開瓶穩(wěn)定性 也稱在倉穩(wěn)定性，是指試劑盒置分析儀試劑倉在使用過程中的穩(wěn)定性。 第56頁（四）臨床試驗1.要有臨床機構(gòu)倫理委員會確認的文件；2.在兩家省級醫(yī)療衛(wèi)生單位完成臨床研究；3.新診斷試劑（盒）應(yīng)與該診斷疾病的金標準針對臨床樣本進行盲法同步比較，應(yīng)與已批準上市產(chǎn)品針對臨床樣本進行比對試驗。4臨床樣本的要求：綜合不同地區(qū)人種、流行病學(xué)背景、病原微生物的特性等因素選擇研究單位，癥狀典型和非典型的，一般臨床研究的總樣本數(shù)至少為200例，新診斷試劑（盒）1000例。第57頁適應(yīng)生化分析儀的要求 酶法分析的應(yīng)用 免疫比濁法的應(yīng)用 四 臨床生化試劑盒的發(fā)展趨勢高靈敏度試劑盒的應(yīng)用 提