實(shí)驗(yàn)二PCR(不跑電泳)

1、PCR的種類和PCR儀普通PCR梯度PCR實(shí)時(shí)熒光定量PCRLong GeneABIBio-radEppendorf第一頁，共三十頁。全觸摸屏PCR儀（Bio-Rad）第二頁，共三十頁。什么是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）？ 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (Polymerase Chain Reaction，PCR）是模擬DNA的復(fù)制過程，在體外特異性擴(kuò)增DNA片段的方法，從而獲得大量的同一序列DNA。每經(jīng)過一輪擴(kuò)增，模板分子數(shù)增加一倍，經(jīng)過n次循環(huán)后，模板分子數(shù)變?yōu)樵瓉淼?n倍。第三頁，共三十頁。Khorana (1971)等最早提出核酸體外擴(kuò)增的設(shè)想：“經(jīng)DNA變性，與合適的引物雜交，用DNA聚合酶延伸引物，

2、并不斷重復(fù)該過程便可合成tRNA基因?！?985年，Kary Mullis在Cetus公司工作期間，發(fā)明了PCR。Mullis要合成DNA引物來進(jìn)行測(cè)序工作，卻常為沒有足夠多的模板DNA而煩惱。1983年4月的一個(gè)星期五晚上，他開車去鄉(xiāng)下別墅的路上,猛然閃現(xiàn)出“多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)”的想法。1983年12月，Mullis用同位素標(biāo)記法看到了10個(gè)循環(huán)后的49 bp長(zhǎng)度的第一個(gè)PCR片段；1985年10月25日申請(qǐng)了PCR的專利，1987年7月28日批準(zhǔn)（專利號(hào)4,683,202 ），Mullis是第一發(fā)明人；1985年12月20日在Science雜志上發(fā)表了第一篇PCR的學(xué)術(shù)論文，Mullis是共同

3、作者；1986年5月，Mullis在冷泉港實(shí)驗(yàn)室做專題報(bào)告，全世界從此開始學(xué)習(xí)PCR的方法。第四頁，共三十頁。第五頁，共三十頁。20212223N: Molecular numberN0: Original numbern: Cycles E: efficiencyN= N0X2n PCR的指數(shù)擴(kuò)增N= N0X（1+e)n第六頁，共三十頁。第七頁，共三十頁。PCR擴(kuò)增過程DNA模板變性退火: 引物 + 模板新鏈延伸50607230-40次循環(huán)引物耐熱的DNA聚合酶退火溫度：45-60 延伸時(shí)間：1-2kb/min循環(huán)數(shù)：30-40第八頁，共三十頁。PCR試劑的作用及使用濃度范圍1、DNA模板(

4、template)： 噬菌體的質(zhì)粒DNA(幾納克幾微克)2、dNTP: 4種dNTP混和物。20-200umolL。大于50mmol/L可抑制Taq酶的活性。3、10 PCR緩沖液(buffer): 組分如下: 15mmol/L MgCl2（影響引物退火和解鏈的溫度，影響產(chǎn)物的特異性，影響引物二聚體的形成。濃度范圍：。濃度太低無PCR擴(kuò)增，太高則會(huì)出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增） 500mmol/LKCl(有利于引物與模板退火，濃度太高則抑制酶活性)、 100mmol/L Tris.HCl (pH8.3)（緩沖PH） 0.1%明膠（穩(wěn)定酶的活性）4、引物(primer): 上游引物（M13 F），下游引物（

5、M13 R）（引物終濃度：）6、Taq DNA聚合酶第九頁，共三十頁。分子克隆3提供的PCR 標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)條件：模板1pg-1g引物1mol/LDNA 聚合酶15 單位Mg2 1.5mmol/LdNTPs 200mol/LKCl 50 mmol/L第十頁，共三十頁。影響PCR反應(yīng)的關(guān)鍵因素1. 引物的質(zhì)量與特異性；2. PCR循環(huán)條件（退火溫度）；3. Mg2+濃度；4. 模板DNA的質(zhì)量；5. 酶的質(zhì)量。第十一頁，共三十頁。DNA模板模板濃度：0.01-1 ng （plasmid , phage）； 0.1-1 ug （genomic DNA）；10倍稀釋（cDNA）;模板中是否含有蛋白質(zhì)雜質(zhì)模

6、板中是否含有Taq酶抑制劑（苯酚）第十二頁，共三十頁。Enzyme concentration Taq DNA polymerase is between 1 and 2.5 units. 催化一典型的PCR反應(yīng)約需酶量2.5U(指總反應(yīng)體積為100ul時(shí))，濃度過高可引起非特異性擴(kuò)增，濃度過低則合成產(chǎn)物量減少dNTP A working stock containing 1 mM each dNTP is recommended dNTP的質(zhì)量與濃度和PCR擴(kuò)增效率有密切關(guān)系，多次凍融會(huì)使dNTP降解。第十三頁，共三十頁。Mg2+濃度： 0.5 - 2.5 mM較合適。Mg2+濃度過高，反應(yīng)

7、特異性降低，出現(xiàn)非特異擴(kuò)增，濃度過低會(huì)降低Taq DNA聚合酶的活性，使反應(yīng)產(chǎn)物減少。 Mg2+對(duì)PCR擴(kuò)增的特異性和產(chǎn)量有顯著的影響，在一般的PCR反應(yīng)中，各種dNTP濃度為200umol/L時(shí)，Mg2+濃度為1.52.0mmol/L為宜。引物濃度： 引物的濃度會(huì)影響特異性。最佳的引物濃度一般在0.1到0.5M。較高的引物濃度會(huì)導(dǎo)致非特異性產(chǎn)物擴(kuò)增。第十四頁，共三十頁。變性溫度和時(shí)間 ： 94-95 C for 30 seconds。 變性不完全,往往使PCR 失敗 ，但變性溫度過高或時(shí)間過長(zhǎng)都會(huì)導(dǎo)致酶活性的損失 。退火溫度： 通常PCR的退火溫度選擇為Tm- 5 oC ; 退火溫度越高,所

8、得產(chǎn)物的特異性越高。有些反應(yīng)甚至可將退火與延伸兩步合并，完成整個(gè)擴(kuò)增循環(huán), 既省時(shí)間又提高了特異性。 引物為20mer以下時(shí)： Tm=2(A+T)+4(G+C) 引物為20mer以上時(shí)： Tm=81.5十0.41(GC)- 600/L 其中L為引物的長(zhǎng)度。 第十五頁，共三十頁。 延伸時(shí)間： 1-2kb/min. 延伸時(shí)間過長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)物非特異性增加。但對(duì)很低濃度的目的序列, 則可適當(dāng)增加延伸反應(yīng)的時(shí)間。一般在擴(kuò)增反應(yīng)完成后,都需要一步較長(zhǎng)時(shí)間(10min)的延伸反應(yīng),以獲得盡可能完整的產(chǎn)物。 循環(huán)數(shù)： 35 cycles 循環(huán)次數(shù)過多，會(huì)使PCR 產(chǎn)物中非特異性產(chǎn)物大量增加。 第十六頁，共三十頁

9、。退火溫度對(duì)PCR產(chǎn)物量和特異性的影響第十七頁，共三十頁。PCR常見問題假陰性： 無擴(kuò)增條帶（漏加模板、引物或酶；酶失效等；引物不合適）假陽性： 非特異性擴(kuò)增帶（退火溫度偏低；引物不合適；Mg2+濃度不合適）； 第十八頁，共三十頁。為什么可以通過PCR擴(kuò)增得到特異片段模板DNA1st2nd3rd特異性擴(kuò)展片段%= 0%特異性擴(kuò)展片段%= 25%特異性擴(kuò)展片段%= 50%4th特異性擴(kuò)展片段%= 68.75% .第十九頁，共三十頁。PCR的特點(diǎn)簡(jiǎn)便、快速一次性加好反應(yīng)液，13 小時(shí)完成擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物一般用電泳方法即可檢測(cè)分析對(duì)標(biāo)本的要求低血液、體腔液、洗嗽液、毛發(fā)、細(xì)胞、活組織等的粗提DNA靈敏

10、度高 理論上13個(gè)DNA分子經(jīng)PCR擴(kuò)增可獲得百萬以上個(gè)相同的DNA分子特異性強(qiáng)擴(kuò)增的產(chǎn)物與模板分子特異區(qū)域完全相同第二十頁，共三十頁。PCR的應(yīng)用研究基因克隆，DNA測(cè)序，分析突變?cè)\斷細(xì)菌、病毒、寄生蟲檢測(cè)，腫瘤檢測(cè)和診斷，轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的檢測(cè)，動(dòng)植物檢疫法醫(yī)犯罪現(xiàn)場(chǎng)標(biāo)本分析其他第二十一頁，共三十頁。實(shí)驗(yàn)材料與試劑1、DNA模板(template)： 噬菌體的質(zhì)粒DNA2、dNTP: 4種dNTP混和物3、10 PCR緩沖液(buffer): 組分如下: 15mmol/L MgCl2 500mmol/LKCl 100mmol/L Tris.HCl (pH8.3) 0.1%明膠4、引物(prime

11、r): 上游引物（M13 F），下游引物（M13 R）（見“實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)”）6、Taq DNA聚合酶 (Taq polymerase) 第二十二頁，共三十頁。PCR的基本步驟1、PCR反應(yīng)體系的建立取0.2ml的薄壁離心管，按表1順序加入試劑稍混勻，短暫離心把溶液甩至管底。2、PCR的變溫程序（熱循環(huán)反應(yīng)）按表2設(shè)置PCR反應(yīng)的變溫程序把離心管放進(jìn)PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后低溫保存或檢測(cè)3、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳檢測(cè) (下次實(shí)驗(yàn))第二十三頁，共三十頁。PCR的基本步驟1、PCR反應(yīng)體系的建立（2人一組）取0.2ml的薄壁離心管，按表1順序加入試劑稍混勻，短暫離心把溶液甩至管底。試劑標(biāo)記成份1份體積(

12、l)H2OddH2O17.3Buffer10反應(yīng)緩沖液2.5dNTPdNTPs (2.5mM each)2P1引物1（10uM）1P2引物2（10uM）1DNADNA1rTaqrTaq酶0.2總體積25表1 PCR 反應(yīng)體系第二十四頁，共三十頁。2、PCR的變溫程序（熱循環(huán)反應(yīng)） 按表2設(shè)置PCR反應(yīng)的變溫程序把離心管放進(jìn)PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后低溫保存或檢測(cè)反應(yīng)階段循環(huán)數(shù) 溫度持續(xù)時(shí)間11 94 （預(yù)變性） 3min235 94（變性） 30s 52 （退火） 30s 72 （延伸） 30s31 72 （補(bǔ)充延伸）10min 41 12置于12 可短時(shí)間保存PCR產(chǎn)物；若需長(zhǎng)時(shí)間保存取出后置-20 保存表2 PCR反應(yīng)的變溫程序第二十五頁，共三十頁。引物設(shè)計(jì)第二十六頁，共三十頁。PCR引物設(shè)計(jì)的原則引物長(zhǎng)度：16-30nt (202nt)G+C%：40-60%四種堿基應(yīng)隨機(jī)分布，在3末端不存在連續(xù)3個(gè)G或C在引物內(nèi)，尤其是在3端不應(yīng)存在二級(jí)結(jié)構(gòu)（引物內(nèi)互補(bǔ)配對(duì)）兩個(gè)引物之間，尤其是3端不能互補(bǔ)。兩引物間最好不存