蒲公英總DNA的提取及其RAPDPCR反應(yīng)條件的優(yōu)化

1、蒲公英總DNA的提取及其RAPD-PCR反響條件的優(yōu)化【摘要】目的建立并優(yōu)化蒲公英樣品總DNA提取方法及其RAPD-PR反響體系。方法采用改進的TAB法提取基因組DNA，對蒲公英RAPD-PR反響體系中各個主要影響因子進展了優(yōu)化和篩眩結(jié)果建立了多態(tài)性高、重復(fù)性好、可用于蒲公英RAPD分析的最正確反響體系。25l反響體系中含有：1Taqixbuffer，50ngDNA模板，0.4l/L引物，1.5l/Lg2+，0.25l/LdNTPs，1.25UTaq酶。擴增程序為：94預(yù)變性5in；94變性1in，38復(fù)性1in，72延伸2in，共40個循環(huán)；72延伸10in，反響完畢后，4保存。結(jié)論這一優(yōu)化

2、體系的建立為今后利用RAPD標(biāo)記技術(shù)進展蒲公英鑒定及種質(zhì)資源遺傳多樣性分析奠定了基?！娟P(guān)鍵詞】蒲公英；基因組DNA提??；隨機擴增多態(tài)性DNA技術(shù)蒲公英為菊科植物蒲公英TaraxaungliuHand.-azz.，堿地蒲公英TaraxausiniuKitag.或同屬數(shù)種植物的枯燥全草，具有清熱解毒、消腫散結(jié)、利尿通淋之成效，主要用于乳癰、肺癰、腸癰、痄腮、咽痛、濕熱黃疸、熱淋澀痛等癥1。蒲公英品種繁多，資源豐富且來源復(fù)雜，目前對其鑒別一直沿用經(jīng)典的性狀鑒定、顯微鑒定及理化鑒定等方法。而這些方法的鑒定標(biāo)識建立在個體形態(tài)和客觀觀測程度上，在生物學(xué)上為物種的遺傳表現(xiàn)型，受到遺傳因素、生物體的生長發(fā)育階

3、段、環(huán)境條件、人類活動如引種馴化、加工炮制等影響，具有很大的變異性，存在主觀性強、重復(fù)性和穩(wěn)定性差等缺點。隨機擴增多態(tài)性DNArandaplifiedplyrphisDNA，RAPD技術(shù)是由美國杜邦公司的科學(xué)家illiasJGK和加利福尼亞生物研究所elshJ指導(dǎo)的兩個研究小組在1990年同時推出的，該技術(shù)根據(jù)PR原理，以隨機設(shè)計的寡核苷酸引物擴增DNA中的一些片段。短短幾年，此方法已成功地應(yīng)用于遺傳多樣性檢測2、基因定位、品系鑒定3、遺傳圖譜構(gòu)建和系統(tǒng)學(xué)研究等諸多領(lǐng)域。但RAPD擴增易受多種因素的影響，如模板DNA濃度、引物濃度及Taq酶濃度等，擴增條件的變化會對RAPD圖譜產(chǎn)生較大的影響，

4、從而影響RAPD分析的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性，因此為了獲得重復(fù)性和可靠性高的RAPD圖譜，對蒲公英進展PR擴增條件的優(yōu)化和引物退火溫度確實定非常必要。本研究討論了蒲公英RAPD-PR反響的優(yōu)化條件，以期建立可用于蒲公英RAPD-PR分析的最正確反響體系和擴增程序，為深化開展蒲公英鑒定及種質(zhì)資源遺傳多樣性分析奠定基矗1材料與儀器1.1材料1.2試劑TAB(十六烷基三甲基溴化銨)：上海山浦化工；Tris(三羥甲基氨基甲烷)：美國Siga公司；EDTA(乙二胺四乙酸二鈉鹽)：美國Ares公司；DL15000bp、DL2000bpDNAarker：大連TaKaRa公司；2TaqPRasterix：北京TIAN

5、GEN公司；10er隨機引物：上海英駿生物技術(shù)合成；其余化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。1.3儀器DYY-6型電泳儀：北京市六一儀器廠；GelD2000T型凝膠圖像分析儀：美國BI-RAD公司；梯度PR儀：德國Bietra公司；GR22G型高速低溫離心機：日本日立公司；微量移液器：德國eppendrf公司。2方法2.1蒲公英葉基因組總DNA的提取和檢測在經(jīng)典的TAB法的根底上加以改進：稱取0.5g樣品參加10%的PVP一起在冰上用玻璃砂在研缽中研磨，磨碎后轉(zhuǎn)移至10l離心管中，參加10倍體積的冰預(yù)冷的洗滌緩沖液(250l/L氯化鈉，250l/LTris-HlpH=8.0,50l/LEDTApH=8.0

6、，5%PVP)，冰浴10in，10000r/in離心5in，棄上清液，再用洗滌緩沖液洗滌沉淀1次。參加1l2TAB提取緩沖液(100l/lTris-HlpH=8.0，20l/LEDTApH=8.0，1.4l/L氯化鈉，2%TAB，5%PVP)，100l-巰基乙醇，65溫育3h，不時振遙412000r/in離心10in，取上清液于另一離心管中，參加適量的RNaseA酶，37溫育45in，參加等體積氯仿異戊醇(241)抽提3次，412000r/in離心10in。取上清液分裝于1.5lEP中，參加等體積預(yù)冷的異丙醇，混勻，于-20靜置30in或過夜，412000r/in離心15in，小心棄去上清液，

7、用75%乙醇洗滌沉淀兩次，412000r/in離心5in，在室溫下枯燥。將枯燥的DNA沉淀溶解于100lTE緩沖液(10l/LTris-HlpH=8.0，1l/LEDTApH=8.0)中，4保存。經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳分析，GelD2000T型凝膠圖像分析系統(tǒng)拍照，于蛋白核酸測定儀上測定其原始濃度，最后統(tǒng)一稀釋成終濃度20ng/l，保存-20備用。2.2RAPD-PR初始擴增體系參照常規(guī)的PR反響中各組分的量及相關(guān)研究論文，確定蒲公英RAPD-PR初始的反響體系為：反響總體積25l，內(nèi)含1.2Taqixbuffer(鎂離子1.8l/L、Taq酶1.5U、dNTPs0.3l/L)、模板DNA5

8、0ng、隨機引物0.2l/L。根據(jù)預(yù)試驗的結(jié)果，以S36(AGA-GGAA)為引物，對蒲公英RAPD反響體系中的5種主要反響成分分別進展單因素試驗，每一個適宜條件確定后作為后續(xù)研究的一個條件。轉(zhuǎn)貼于論文聯(lián)盟.ll.擴增程序定為94預(yù)變性5in；然后進展40個循環(huán)：94變性1in，37復(fù)性1in，72延伸1.5in；循環(huán)后72延伸10in；4保存。PR擴增產(chǎn)物在1.2%瓊脂糖凝膠中電泳檢測，電壓5V/，電泳完畢后，在GelD2000T型凝膠圖像分析儀上觀察并照相記錄。2.3退火溫度確實定采用梯度PR儀，設(shè)定退火溫度最低31.0和最高43.0，擴增儀自動生成8個溫度梯度，分別為：31.0，32.1

9、，34.0，36.0，38.0，40.0，41.9，43.0。2.4隨機引物的挑選及RAPD優(yōu)化體系的驗證采用優(yōu)化出的PR反響體系對100條RAPD隨機引物進展初步挑選，最終從中選出可以穩(wěn)定擴增出條帶明晰、多態(tài)性明顯的引物。分別采用挑選出的不同隨機引物應(yīng)用優(yōu)化好的PR體系對其它樣品個體進展RAPD擴增。3結(jié)果3.1蒲公英葉片基因組DNA的提取采用改進的TAB法所提DNA為白色，經(jīng)蛋白核酸測定儀檢測，其平均D260/280值為1.832，說明所提DNA無蛋白質(zhì)和RNA污染，純度較高。同時將所提的DNA進展瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果顯示所得總DNA均有一條約15kb明晰亮堂的主帶，無拖尾或彌散現(xiàn)象，完好

10、性較好。結(jié)果見圖1。3.2蒲公英葉RAPD反響體系的優(yōu)化3.2.1模板濃度確定適宜的模板量是保證特異性擴增的前提，模板量過多會降低特異性效率，增加非特異性產(chǎn)物。本實驗設(shè)置了10，20，40，50，60，80，100，120，140，160ng共10個模板梯度，結(jié)果見圖2，從中可以看出，DNA模板量在10160ng，擴增程度及擴增條帶數(shù)無明顯差異，濃度過高擴增條帶較少或不穩(wěn)定甚至無產(chǎn)物。因此，本研究將蒲公英擴增體系中模板參加量定為50ng，擴增結(jié)果較好。3.2.2引物濃度選擇引物濃度關(guān)系到擴增產(chǎn)物的質(zhì)量，濃度太低不能進展有效的擴增，濃度太高會增加引物二聚體的形成，導(dǎo)致條帶不穩(wěn)定及明晰度下降。在優(yōu)

11、化其反響體系過程中設(shè)置了0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1.0l/L共10個濃度程度。結(jié)果見圖3，引物濃度為0.1l/L時，擴增條帶少而弱，0.20.5l/L之間擴增條帶數(shù)和亮度根本一致，引物濃度高于0.6l/L時非特異性擴增條帶增加。根據(jù)實驗結(jié)果，本研究選擇引物濃度為0.4l/L。3.2.32TaqPRasterixBuffer用量選擇所用PRbuffer內(nèi)含g2+，TaqDNA聚合酶，dNTPs三種成分，含量分別為：3.0l/Lg2+，0.1U/lTaq酶、0.5l/LdNTPs。Taq酶的種類以及使用量直接影響擴增反響的成功與否，dNTPs是PR反

12、響的原料，其用量與PR產(chǎn)物產(chǎn)量直接相關(guān)。底物dNTPs濃度過高，會導(dǎo)致DNA聚合酶錯誤插入，背景模糊，濃度過低，又會影響合成效率，甚至?xí)騞NTPs過早消耗而使產(chǎn)物單鏈化，影響擴增結(jié)果。為此，本研究對2TaqPRasterixBuffer用量共設(shè)置了5.0，7.5，10.0，12.5，15.0，17.5，20.0l共7個梯度。結(jié)果見圖4。結(jié)果顯示，參加量過少或過多都會造成擴增條帶少而弱。本研究選擇參加量為12.5l，即在25l反響體系中，g2+濃度為1.5l/L，dNTPs濃度為0.25l/L，Taq酶1.25U。3.3引物退火溫度的考察PR反響中，退火溫度的上下直接影響到引物與模板DNA的特

13、異性結(jié)合。利用上面優(yōu)化的最正確條件，針對引物的T值進展梯度退火實驗。結(jié)果見圖5。在3640范圍內(nèi)，都能擴增出主要條帶，但比擬看出，在38擴增的條帶明晰且穩(wěn)定性高，為此，本研究選擇38作為蒲公英RAPD反響的最適退火溫度。通過對上述條件的優(yōu)化，挑選出合適于蒲公英RAPD-PR的反響體系，25l的體系中含有：1TaqPRasterixBuffer(1.5l/Lg2+，0.25l/LdNTPs，1.25UTaq酶)，50ng模板DNA和0.4l/L引物。擴增程序為：94預(yù)變性5in；94變性1in，38復(fù)性1in，72延伸2in，共40個循環(huán)；72延伸10in，反響完畢后，4保存。3.4隨機引物的初

14、步挑選及RAPD優(yōu)化反響體系的驗證經(jīng)過大量的試驗，最終選出了10條擴增出條帶明晰、多態(tài)性明顯的引物。引物及其序列見表2。利用挑選出的隨機引物S36及優(yōu)化的PR反響體系對不同居群蒲公英樣品DNA進展擴增，結(jié)果均獲得了背景明晰、多態(tài)性高、穩(wěn)定性好的DNA擴增片段，可用于蒲公英品種鑒別及遺傳多樣性分析，PR擴增結(jié)果見圖6。表2挑選出的局部引物略4討論從蒲公英葉片中提取總DNA的關(guān)鍵是如何有效地去除多糖、生物堿及其它次生代謝產(chǎn)物。葉片在液氮中研磨是為了降低DNA酶的活性，防止DNA在溶出時發(fā)生降解。TAB是一種去污劑，既能裂解細胞，又能有效沉淀多糖。在提取緩沖液中參加5%PVP和100l-巰基乙醇也是為了防止多酚類物質(zhì)的氧化、褐變。用氯仿異戊醇(241)抽提能較好的除去蛋白質(zhì)，經(jīng)反復(fù)試驗，抽提23次即可到達要求。同時為了除去可能殘留在DNA沉淀中的無機鹽及有機溶劑，采用75%的乙醇洗滌沉淀兩次。結(jié)果說明，采用改進的TAB法進展蒲公英葉基因組總DNA的提取，獲得了高質(zhì)量的DNA。Taq酶依賴于g2+，而g2+又受到dNTPs影響，dNTPs濃度過高那么會與Taq酶競爭g2+，從而影響到Taq酶的活性。為了獲得重復(fù)性和穩(wěn)定性較好的RAPD譜帶，進步分析的準(zhǔn)確度，本研究對影響PR的主要5種反響組分進展了