紅曲霉中藥合生元制劑中酶活力大小的分析研發(fā)

1、紅曲霉 中藥合生元制劑中酶活力大小的研究摘 要 試驗(yàn)選取培養(yǎng) 15 、 21 和 20 d 的成熟紅曲霉 中藥合生元制劑干粉和 培養(yǎng) 20 d 的成熟紅曲霉 中藥合生元制劑濕粉作為樣品，每組做 3 個(gè)重復(fù)，取平均值。利用紫外分光光 度法分別測(cè)定不同培養(yǎng)時(shí)間下 紅曲霉粉中的淀粉酶活力、蛋白酶活力和纖維素酶活力。研究結(jié)果表明 : 淀粉酶 活力相對(duì)較高，且略有隨培 養(yǎng)天數(shù)增加而升高的趨勢(shì)，蛋白酶活力很低，纖維素酶活力較低。關(guān)鍵詞 紅曲霉 中藥合生元制劑 淀粉酶活力 蛋白酶活力 纖維素酶活力1 材料與方法儀器DK 8D 型電熱恒溫水槽，上海精宏試驗(yàn)設(shè)備 有限公司 ; UV759CRT 紫外可見光分光光

2、度計(jì)，上 海佑科儀器儀表有限公司?；瘜W(xué)試劑 可溶性淀粉溶液、 pH 為 6. 0 的磷酸鉀鹽緩沖 液、pH為5. 0 的磷酸鈉鹽緩沖液、稀碘液、酪蛋 白溶液、 0. 4 mol/L 三氯乙酸、 0. 4 mol/L Na 2CO3福林試劑、 1 % 羧甲基纖維素鈉、 3， 5 二硝基水 楊酸、葡萄糖溶液和酪氨酸溶液。試驗(yàn)方法樣品選擇 : A 組為培養(yǎng) 15 d 的紅曲霉 中藥合 生元制劑干粉， B 組為培養(yǎng) 21 d 的紅曲霉 中藥合 生元制劑干粉， C 組為培養(yǎng) 20 d 的紅曲霉 中藥合 生元制劑干粉， D 組為培養(yǎng) 20 d 的紅曲霉 中藥合 生元制劑濕粉，經(jīng)測(cè)定 D 組樣品含水量為 2

3、9. 5 % 。紅曲霉 中藥合生元的制作 先將山楂、紅棗和山藥等按照一定比例與大米 混合蒸熟備用，將 250 mL 三角燒瓶放入高壓滅菌 鍋內(nèi)，高壓滅菌 30 min ，取出，將蒸熟的大米平鋪于 三角燒瓶底部，約45 cm,封口，高壓滅菌30 min , 同時(shí)用滅菌好的無(wú)菌水配制 0. 2 % 冰乙酸待用，待 培養(yǎng)基冷卻后，用接種環(huán)挑取耐中藥的紅曲霉菌株 10 12 次稀釋于 30 mL 0. 2 % 的冰乙酸溶液中，每 個(gè)三角燒瓶中接種 1 1. 5 mL ，接種量隨培養(yǎng)基厚 度自行調(diào)整。放入培養(yǎng)箱中，32 C培養(yǎng)1417 d , 培養(yǎng)好后，用玻璃棒轉(zhuǎn)移至托盤中，40 C鼓風(fēng)烘干 24 h

4、即可，然后粉碎制成粉末備用。粗酶液的制備發(fā)酵成熟的紅曲霉 中藥合生元制劑，經(jīng) 40 C 恒溫烘干后，準(zhǔn)確稱取 1. 000 g 樣品，以 5mL 緩沖 溶液溶解，加95 mL 40 C溫水，40 C浸提6 h，以 脫脂棉過濾備用。淀粉酶活力測(cè)定在 20 mL 試管中，加入 5. 0 mL 0. 5 % 可溶性淀 粉及1. 0 mL 磷酸緩沖液，于40 C恒溫水浴中預(yù)熱 5 min ，然后加入 1. 0 mL 待測(cè)酶液，搖勻，準(zhǔn)確反 應(yīng)1 h，取出，吸取70. 0卩L該反應(yīng)液于3. 0 mL 稀 碘液中，用分光光度計(jì)在 660 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定其光 密度 ( OD) 值，測(cè)定酶活力。酶活力定義

5、: 1 g 固體酶粉，于 40 C 及 pH 為6. 0 條件下 1 h 液化 1 g 可溶性淀粉，即為 1 個(gè)淀粉酶活力單位，以 U/g 表示。飼料添加劑26 飼料研究 FEED RESEARCH NO01 ，2013 淀粉標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 : 分別配制質(zhì)量濃度為0. 1 % 、0. 2 % 、0. 3 % 、0. 4 % 和 0. 5% 的可溶性淀 粉溶液，各取 5. 0 mL ，加 1. 0 mL 磷酸緩沖液，于40 C恒溫水浴中預(yù)熱5 min，然后加入1. 0 mL 去離 子水，搖勻，準(zhǔn)確反應(yīng)1 h，取出，吸取70. 0卩L該 反應(yīng)液于 3. 0 mL 稀碘液中，用分光光度計(jì) 660 nm

6、 波長(zhǎng)下測(cè)定其 OD 值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。蛋白酶活力測(cè)定在 20 mL 試管中，加入 1. 0 mL 待測(cè)酶液，置于40 C 水浴中預(yù)熱2 min，再加入1. 0 mL 預(yù)熱的2 % 酪蛋白，精確保溫 10 min ，立即加入 2. 0 mL 0. 4 mol/L 三氯乙酸，保溫 20 min ， 3 000 r/min 離心 2 min ，吸 取 1. 0 mL 上清液，加 5. 0 mL 0. 4 mol/L Na2CO3和1.0 mL福林試劑，40 C水浴保溫發(fā)色20 min，于660 nm 下測(cè)定其 OD 值，測(cè)定酶活力。酶活力定義：在40 C，每分鐘水解酪蛋白產(chǎn)生1卩g酪氨酸，定義為1

7、個(gè)蛋白酶活力，以U / g 表示。酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 ： 分別配制質(zhì)量濃度為 20 、40、60、80和100卩g / mL 的酪氨酸溶液，各取 1.0 mL ， 加 5. 0 mL 0. 4 mol/L Na2CO和 1. 0 mL 福林試劑，40 C水浴保溫發(fā)色20 min，于660 nm 下測(cè)定其OD 值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。纖維素酶活力測(cè)定取 20 mL 試管，加 2. 0 mL 1 % 羧甲基纖維素鈉，于50 C水浴中預(yù)熱23 min，加0. 5 mL 待測(cè) 酶液，加入 1 mL pH 5. 0 的磷酸鈉鹽緩沖液，保溫30 min ，取出加入 2. 5 mL 3 ， 5 二硝基水楊酸，沸

8、水浴煮沸 5 min ，冷卻后，分光光度計(jì) 530 nm 處測(cè) 定其 OD 值，測(cè)定酶活力。酶活力定義：在50C及pH為5.0條件下，30min水解羧甲基纖維素鈉生成1卩g葡萄糖的酶量，為1 個(gè)纖維素酶活力單位，以 U/g 表示。葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 ： 分別配制質(zhì)量濃度為 40 、60、80、100、150、160、200、210 和 300 卩 g / mL 的葡 萄糖溶液，加入 2 mL 去離子水和 1 mL pH 5. 0 的磷 酸鈉鹽緩沖液，保溫 30 min ，取出后加入 2. 5 mL 3 ，5 二硝基水楊酸，沸水浴煮沸 5 min ，冷卻后，分 光光度計(jì) 530 nm 處測(cè)定其

9、OD 值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。2 結(jié)果與分析2.1 淀粉酶活力淀粉標(biāo)準(zhǔn)曲線為 y = 3 399. 5x + 0. 018 3， R20. 997 4 。表 1 不同培養(yǎng)時(shí)間紅曲霉粉淀粉酶活力大小組別 淀粉加入量/g淀粉反應(yīng)量/g淀粉剩余量/g淀粉酶活力/( U g 1A 組 0. 025 0. 024 463 0. 000 537 244. 63B 組 0. 025 0. 024 413 0. 000 587 244. 13C 組 0. 025 0. 024 429 0. 000 570 244. 29D 組 0. 025 0. 024 226 0. 000 774 242. 26 從表 1 可見

10、 : A 、 B 和 C 組樣品中淀粉酶活力 均在244245 U/g，處于相對(duì)較高水平，D組樣品 淀粉酶活力值為 242. 26 U/g ，較其他 3 組活力低的 原因是由于 D 組樣品為紅曲霉 中藥合生元制劑濕 粉，含水量為 29. 5 % ，造成酶活力值偏低。 淀粉酶屬于一種水解酶類，是催化淀粉、糖原 和糊精中糖苷鍵的一類酶的總稱。廣泛分布于自然 界，幾乎所有微生物、動(dòng)物和植物都含有淀粉酶， 是一種來(lái)源和用途都非常廣泛的酶類。淀粉酶是最 早實(shí)現(xiàn)工業(yè)生產(chǎn)并且迄今為止用途最廣且產(chǎn)量最大 的酶制劑品種，約占酶制劑市場(chǎng)份額的 25 %，在 食品、發(fā)酵、紡織、造紙業(yè)、制藥業(yè)和化學(xué)藥品工 業(yè)等領(lǐng)域都

11、有廣泛應(yīng)用，還將擴(kuò)展到其他領(lǐng)域，所 以，測(cè)定紅曲霉 中藥合生元制劑中淀粉酶的含量 和活力大小，具有較為實(shí)際的應(yīng)用價(jià)值，還可進(jìn)一 步篩選高產(chǎn)淀粉酶的紅曲霉菌株，為在更廣泛的領(lǐng) 域中應(yīng)用紅曲霉奠定基礎(chǔ)。蛋白酶活力 酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線為 : y = 0. 016 6x 0. 000 2 ，R2= 0. 999 4 。表 2 不同培養(yǎng)時(shí)間紅曲霉粉蛋白酶活力大小組別0D值酶液對(duì)照值 蛋白對(duì)照值 蛋白酶活力/( U g)A 組 0. 903 0. 220 0. 626 0. 172B 組 0. 914 0. 237 0. 626 0. 154C 組 0. 920 0. 237 0. 626 0. 172D 組

12、 0. 782 0. 097 0. 626 0. 178 從表 2 可見: 4 組樣品的蛋白酶活力都很低， 幾乎為零，由于培養(yǎng)基為大米培 養(yǎng)基， 蛋白質(zhì)含量 較低，所以得出此組數(shù)據(jù)為正常值。 由于蛋白酶應(yīng)用于洗滌及皮革等行業(yè)中較多， 且用量大，市場(chǎng)上常有供不應(yīng)求的現(xiàn)象，當(dāng)前，國(guó) 內(nèi)外主要對(duì)蛋白酶高產(chǎn)菌株和微生物菌種進(jìn)行定向 選育，目的性強(qiáng)，技術(shù)也很成熟，徐子淵等和鄭鐵 曾等都對(duì)如何提高菌體蛋白酶產(chǎn)量做了大量工作， 結(jié)果表明 : 利用誘變育種等手段可以顯著提高蛋白 酶產(chǎn)量，對(duì)于紅曲霉 中藥合生元制劑的蛋白酶產(chǎn) 量，是否可以通過改變培養(yǎng)基成分 ( 下轉(zhuǎn)第 31 頁(yè)) 飼料添加劑 飼料研究 FEED

13、 RESEARCH NO01，2013 31 表 6 不同水平底料組成和接種量對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物中植酸酶活性的影響 項(xiàng)目E 接種量 / ( mL- 100 g 1)F底物比例(棉粕：玉米)顯著水平1 3 5 7 9 SEM 100 ： 0 90： 10 80： 20 70： 30 60： 40 SEM 植酸酶活性 /( U-g 1 )63. 687 9aA 62. 101 1aA59. 774 5aA 74. 468 7aA71. 471 7aA1. 11 71. 748 9aA72. 928 9aA63. 282 8aA64. 2674aA59. 275 9aA1. 11PE0. 002 5PEX

14、PF0. 999 80. 005 2注同表 3表 7 不同水平底料組成和接種量對(duì)優(yōu)化發(fā)酵產(chǎn)物中的枯草芽孢桿菌菌數(shù)的影響 項(xiàng)目E 接種量 / （ mL 100 g 1）F底物比例（棉粕：玉米）顯著水平1 3 5 7 9 SEM 100 ： 0 90： 10 80： 20 70： 30 60： 40 SEM 枯草芽孢桿菌 /（10 萬(wàn) CFUg1）23. 321 7cC34. 2333bcBC49. 144 7bB95. 611 3aA49. 099 7bB1. 11 52. 966 7aA63. 922aA59. 677 7aA 48. 833 aAB26. 011 3 bB 1. 11 P E

15、0. 022 5PEX PF0. 000 1PF0. 388 93 結(jié)論 產(chǎn)植酸酶枯草芽孢桿菌生物飼料發(fā)酵參數(shù)的優(yōu) 化組合為 14 ( A3B4C1D3)，即溫度37 C,時(shí)間周底料期 72 h ，底物初水分 30 %，初始 pH 為 7. 0底料組成和接種量的優(yōu)化結(jié)果為 E4 F2，即底料組成為棉粕 90 % ，玉米 10 %; 接種量為 7. 0 mL/100 g 。 通信地址 : 新疆石河子大學(xué)北區(qū)動(dòng)物科技學(xué)院14 號(hào)樓 404 室4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪4 4 4 4 4

16、4 4 4 4 4 4 4 4檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪832003（ 上接第 26 頁(yè) ） 和其他手段進(jìn)行篩選育種，從而得到高產(chǎn)菌株還有 待進(jìn)一步研究。2.3 纖維素酶活力葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線為 : y = 0. 002 8x 0. 029 9 ，R2= 0. 996 1 。表 3 不同培養(yǎng)時(shí)間紅曲霉粉纖維素酶活力大小 組別 OD 值 羧甲基纖維素 鈉對(duì)照值 酶液對(duì)照值3，5 二硝基水 楊酸對(duì)照值 酶活力/（U g)A 組 1. 774 0. 071 1. 728 0. 1 22. 5B 組 1. 769 0. 071 1. 706 0. 1 31. 0C 組 1. 772 0. 071 1. 7

17、14 0. 1 28. 5 D 組 1. 491 0. 071 1. 438 0. 1 26. 0 從表 3 可見 : 在消除了羧甲基纖維素鈉、粗酶 液和 3，5 二硝基水楊酸的影響后，對(duì)應(yīng)葡萄糖標(biāo) 準(zhǔn)曲線，計(jì)算出的纖維素酶活力分別為 22. 5 、31. 0 、 28. 5 和 26. 0 U / g ，可以看出，在一定范圍內(nèi)，隨著 培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，纖維素酶活性有升高的趨勢(shì)，具 體趨勢(shì)如何，有待進(jìn)一步試驗(yàn)驗(yàn)證。 自然界中，纖維素類物質(zhì)是一類最廉價(jià)且最豐 富的可再生資源，如果天然存在的這些纖維素可以 有效降解，在化石能源日益枯竭的今天，對(duì)解決能 源危機(jī)和環(huán)境污染等社會(huì)焦點(diǎn)問題具有重大的現(xiàn)實(shí) 意義，利用纖維素酶的水解作用水解纖維素就是一 條很好的環(huán)保無(wú)污染的利用纖維