導(dǎo)論代謝工程

1、代謝工程馮永君Email: 1 生物的細(xì)胞化學(xué)1.1 生物元素生物元素：組成細(xì)胞的化學(xué)元素有機(jī)化合物，水：C H O N P S細(xì)胞質(zhì)離子：Na K Mg Mn Ca Cl酶輔基：Zn Cu Co Ni Mo Se B1.2 水細(xì)菌：75-80；酵母菌：70-85；霉菌：90游離水：自由水，溶劑結(jié)合水：不能作為溶劑，不流動，無滲透性，不揮發(fā)1.3 小分子：單體單體，多聚體：糖與多糖，氨基酸與蛋白質(zhì)，脂肪酸與脂類，核苷酸與核酸1.4 大分子多糖脂類：脂肪，磷脂，蠟，甾醇核酸蛋白質(zhì)：糖蛋白，脂蛋白，酶2 代謝概論2.1 分解代謝大分子物質(zhì)小分子物質(zhì)：產(chǎn)能，用于生物合成，運(yùn)動，運(yùn)輸，發(fā)光，產(chǎn)熱【圖解

2、】2.2 合成代謝小分子物質(zhì)大分子物質(zhì)：耗能【圖解】蛋白質(zhì) 多糖 脂類氨基酸 單糖 甘油 脂肪酸 ATP NADH NADH FADH2NH3 丙酮酸 NADH ATP 乙酰輔酶A 草酰乙酸 TCA 循環(huán) ATP NADH FADH2 分解代謝示意圖 電子傳遞鏈 葡萄糖 6磷酸葡萄糖 磷酸核糖 4磷酸赤蘚糖 磷酸甘油 磷酸丙糖 分支酸 脂類 芳香氨基酸 3磷酸甘油酸 Ser Cys Gly 嘌呤 His 丙酮酸 Ala Lys Ile Leu Val 乙酰輔酶A 脂類嘧啶 Asp 草酰乙酸Thr Ile Asn Lys Met Gln Pro Arg TCA 循環(huán) alpha-酮戊二酸 Glu

3、 卟啉 琥珀酰輔酶A 合成代謝示意圖 3 糖的基本概念糖是多羥基醛或多羥基酮或其衍生物，或水解能產(chǎn)生這類化合物的物質(zhì)糖的相關(guān)概念：單糖、寡糖、多糖Pyranose(吡喃糖) Furanose(呋喃糖) 4 糖的產(chǎn)生：光合作用三種類型光合作用 依賴細(xì)菌葉綠素的光合作用：紫色硫細(xì)菌，綠色硫細(xì)菌，紫色非硫細(xì)菌，綠色非硫細(xì)菌 依賴葉綠素的光合作用：植物、藍(lán)細(xì)菌和藻類 依賴細(xì)菌視紫紅質(zhì)的光合作用：鹽桿菌兩種電子傳遞系統(tǒng)： 環(huán)式電子傳遞鏈：紫色硫細(xì)菌，綠色硫細(xì)菌，紫色非硫細(xì)菌，綠色非硫細(xì)菌光激發(fā)細(xì)菌葉綠素產(chǎn)生高能電子，電子鐵氧還蛋白PQH跨膜（ATP合成）細(xì)胞色素b,c葉綠素。產(chǎn)物：ATP，無NAD(P)

4、H2和O2 非環(huán)式電子傳遞鏈藍(lán)細(xì)菌光系統(tǒng)I，葉綠素P700受光激發(fā)產(chǎn)生高能電子 鐵氧還蛋白NADPH2光系統(tǒng)II，葉綠素P680光解水產(chǎn)生H和O2，高能電子經(jīng)PQ進(jìn)光系統(tǒng)I非環(huán)式電子傳遞鏈【圖解】Fe-S 蛋白 Fd NADP ATP b563 PQ B539 ATP 質(zhì)體藍(lán)素 P700葉綠素a H2O PS1 PSII P680 O2 光 別藻藍(lán)素 藻藍(lán)素/藻紅素 光藍(lán)細(xì)菌非循環(huán)電子傳遞鏈光反應(yīng)PhotonPETC質(zhì)體醌（PQ）細(xì)胞色素（Cyt）質(zhì)體藍(lán)素（PC）鐵氧還蛋白（Fd）Chlorophyll: Like heme, chlorophyll a is a cyclic tetrapy

5、rrole. One of the pyrrole rings (shown in red) is reduced. A phytol chain (shown in green) is connected by an ester linkage. Magnesium ion binds at the center of the structure Electron Chain in the Photosynthetic Bacterial Reaction CenterCO2固定：暗反應(yīng)與Calvin 循環(huán)二磷酸核酮糖（RuBP）：CO2 + (5C) RuBP二磷酸核酮糖羧化酶 （rubi

6、sco）23磷酸甘油酸 (3PG) Calvin CycleEvery 6 turns:Produces 12 (3C) G3P = 36Cof this 30 C Regenerate 6 (5C) RuBP and 6C produce 1 (6C) glucoseAnd uses 18 ATP & 12 NADPH6CO2 + 18 ATP+ 12 NADPH C6H12O6 RubiscoInside plant cells rubisco forms the bridge between life and the lifeless, creating organic carbon f

7、rom the inorganic carbon dioxide in the air Rubisco takes carbon dioxide and attaches it to ribulose bisphosphate, a short sugar with five carbon atoms. Rubisco then clips the lengthened chain into two identical phosphoglycerate pieces (PGA), each with three carbon atoms Phosphoglycerates are famili

8、ar molecules in the cell, and many pathways are available to use it. Most of the phosphoglycerate made by rubisco is recycled to build more ribulose bisphosphate, which is needed to feed the carbon-fixing cycle. But one out of every six molecules is skimmed off and used to make glucose (table sugar)

9、 to feed the rest of the plant, or stored away in the form of starch for later useContains 2992 hydrogen bonds, which force the 16 protein chains to assume 208 helices, 248 beta-strands and 456 turns.Enzyme is composed of two subunits: The small subunit is made up of 123 amino acids. The protein con

10、tains a four-stranded antiparallel sheet, which is flanked by two helices. Some turns stabilize the loops. The large subunit contains 475 amino acids.5 糖酵解EMP途徑1分子葡萄糖酵解產(chǎn)生2分子ATP，2分子NADH2為產(chǎn)能代謝提供準(zhǔn)備HMP途徑單磷酸己糖途徑，磷酸戊糖支路，不是產(chǎn)能途徑1分子葡萄糖, 產(chǎn)生1分子3-磷酸甘油醛，1分子ATP 3分子CO2，6分子NADPH2中間產(chǎn)物 5-磷酸核酮糖：合成核酸，輔酶，組氨酸NADPH2：合成脂肪酸

11、，類固醇，谷氨酸好氧，兼性厭氧微生物均有，與EMP途徑共存葡萄糖 6磷酸葡萄糖 6磷酸果糖 ATP ATP 1, 6磷酸果糖 磷酸二羥丙酮 3磷酸甘油醛 NADH 1, 3磷酸甘油酸 ATP 3磷酸甘油酸 2磷酸甘油酸 磷酸烯醇式丙酮酸 ATP 丙酮酸EMP途徑葡萄糖 6磷酸葡萄糖 6磷酸葡萄糖內(nèi)脂 6磷酸葡糖酸 ATP NADPH NADPHCO25磷酸核糖 5磷酸核酮糖 5磷酸木酮糖 酮醇基 3磷酸甘油醛 7磷酸景天庚酮糖 4磷酸赤蘚糖 6磷酸果糖 3磷酸甘油醛 EMP 丙酮酸 HMP途徑ED途徑嗜糖假單胞菌，其它G假單胞菌，固氮菌關(guān)鍵酶：2-酮-3-脫氧-6-磷酸葡萄糖酸醛縮酶1分子葡萄

12、糖, 產(chǎn)生1分子ATP，1分子NADH2，1分子NADPH2可獨立于EMP、HMP途徑存在磷酸解酮酶途徑磷酸戊糖解酮酶途徑：PK途徑磷酸己糖解酮酶途徑：HK途徑葡萄糖 6磷酸葡萄糖 6磷酸葡萄糖內(nèi)脂 6磷酸葡糖酸 2酮3脫氧6磷酸葡糖酸 2-酮-3-脫氧-6-磷酸葡糖酸醛縮酶 丙酮酸 3磷酸甘油醛 EMPATPNADPHED途徑D核糖 5磷酸核糖 5磷酸核酮糖5磷酸木酮糖 磷酸戊糖解酮酶乙酰磷酸 磷酸甘油醛 乙酸 丙酮酸 乳酸PK途徑 磷酸解酮酶葡萄糖 6磷酸果糖 乙酰磷酸 乙酸 4磷酸赤蘚糖 HMP轉(zhuǎn)醛酶，轉(zhuǎn)酮酶 5磷酸木酮糖磷酸解酮酶 乙醇 乳酸HK途徑6 重要發(fā)酵乙醇發(fā)酵 脫羧酶 乙醇脫

13、氫酶丙酮酸 乙醛 乙醇 NADH酵母菌，根霉，曲霉，細(xì)菌經(jīng)濟(jì)價值：酒精酵母，克魯氏酵母運(yùn)動發(fā)酵單胞菌：ED產(chǎn)丙酮酸，轉(zhuǎn)變?yōu)橐掖?，速率，耐酒精度，菌體體積，厭氧白酒發(fā)酵乳酸發(fā)酵同型乳酸發(fā)酵 乳酸脫氫酶葡萄糖 丙酮酸 乳酸 NADH2乳酸鏈球菌，乳酪鏈球菌，保加利亞乳桿菌， 德氏乳桿菌異型乳酸發(fā)酵過程：利用己糖（葡萄糖），HK途徑生成乳 酸和乙醇 利用戊糖（核糖），PK途徑生成乳 酸和乙酸腸膜明串珠菌，乳桿菌屬部分菌株7 呼吸作用生物在降解底物的過程中，將釋放出的電子交給NAD(P)，F(xiàn)AD或FMN等電子載體，再經(jīng)電子傳遞系統(tǒng)傳給外源電子受體(如氧氣)，生成水或其它還原型產(chǎn)物，并在電子傳遞過程中釋

14、放出能量的過程有氧呼吸：氧氣無氧呼吸：氧化型化合物有氧呼吸TCA循環(huán)【圖解】1分子丙酮酸, 產(chǎn)生1分子GTP，4分子NADH2，1分子FADH2連同酵解, 1分子葡萄糖產(chǎn)生38ATP電子傳遞鏈：高等生物，真菌線粒體TCA循環(huán)氧化磷酸化 Oxidative Phosphorylation8 大分子化合物的水解多糖的水解：淀粉，纖維素，果膠，幾丁質(zhì)，菊糖脂類的水解：脂酶，水解脂類產(chǎn)生甘油和脂肪酸，前者進(jìn)一步氧化生成磷酸二羥丙酮，進(jìn)人EMP 途徑，后者經(jīng)beta-氧化生成乙酰輔酶A進(jìn)入TCA循環(huán)蛋白質(zhì)水解：生物分泌蛋白酶，水解蛋白質(zhì)產(chǎn)生氨基酸蛇毒造成紅細(xì)胞膜溶解強(qiáng)表面活性劑溶血甘油磷脂脂類的水解氨基

15、酸的水解：脫羧酶：Lys 1,5-戊二胺CO2脫氨酶 脫氫酶：Glu alpha-酮戊二酸NH3 去飽和脫氨：Asp 延胡羧酸NH3 水解脫氨：尿素 2NH3CO2轉(zhuǎn)氨作用: 氨基酸酮酸 氨基酸酮酸 NADH2核酸的分解代謝 磷酸二酯酶 磷酸單酯酶核酸 核苷酸 核苷 磷酸 核苷酶 嘌呤嘧啶核糖 進(jìn)一步降解 9 從N2的固定到蛋白質(zhì)的合成固氮微生物非共生固氮菌：自生固氮菌，固氮菌屬，固氮單孢菌屬，巴氏固氮梭菌，藍(lán)細(xì)菌，肺炎克雷伯氏菌，多粘芽孢桿菌，產(chǎn)甲烷細(xì)菌共生固氮菌：根瘤菌與豆科作物，地衣藍(lán)細(xì)菌與藻類等聯(lián)合固氮菌：包括根際菌，內(nèi)生菌；固氮螺菌屬，假單孢菌屬，泛菌屬，腸桿菌屬，醋桿菌屬 大豆與根

16、瘤菌大豆起源：5000年前 商代：甲骨文 記載周朝：詩經(jīng)大雅生民：藝之在荏，荏菽旆旆。 晉朝：陶潛桃花源詩：桑竹垂余蔭，菽稷時時藝 “豆”字演變楷體小篆金文甲骨文 錯金銅蓋豆 (青銅) 戰(zhàn)國盛食器和禮器。源于新石器時代的同名陶器，出現(xiàn)于商代晚期，盛行于春秋戰(zhàn)國時期。最早用于盛放黍稷，后演變?yōu)閷ｉT盛放腌菜、肉醬等調(diào)味品的器物古人如何吃大豆粟菽（豆 飯）霍羹（豆葉湯）一直到戰(zhàn)國乃至秦漢時期淮南 豆腐豆油：北宋 蘇軾（10361101）物類相感應(yīng)豆油煎豆腐，有味 河南省打虎亭漢墓磚雕上的豆腐加工圖(25220 A.D.) 新石器時代 黍稷粟麻豆稻麥商代 黍稷粟豆麻稻麥春秋戰(zhàn)國 粟豆麥?zhǔn)蝠⒙榈厩貪h 粟

17、麥豆稻黍稷麻三國兩晉南北朝 粟麥稻豆黍稷麻隋唐 粟稻麥?zhǔn)蚨孤樗卧?粟稻麥?zhǔn)蚨垢吡幻髑?稻麥粟黍玉米紅薯高粱大麥馬鈴薯歷代主要糧食作物演變表根瘤：豆血紅蛋白：血紅素（輔基部分）類菌體合成 蛋白部分：植物合成固氮酶 鐵蛋白：結(jié)合ATP 釋放能量活化電子，固氮酶還原酶 鉬鐵蛋白：真正固氮酶低氧環(huán)境：耗氧，豆血紅蛋白，異型細(xì)胞：不產(chǎn)O2 光合作用，合成ATP，而NADH2由鄰近的細(xì)胞提供固定1 mol 需要21 mol ATP植物內(nèi)生細(xì)菌舉例（成團(tuán)泛菌YS19 ）成團(tuán)泛菌YS19 Symplasmata 形成過程SP與SC之比較YS19在宿主水稻根部的定殖YS19在宿主水稻根部的定殖10 酶的合成調(diào)節(jié)

18、誘導(dǎo)：當(dāng)培養(yǎng)基中存在有相應(yīng)底物時，細(xì)胞便合成與分解這些底物有關(guān)的酶 。乳糖操縱子 ：R O Z Y A阻遏蛋白 RNA聚合酶R O Z Y A乳糖末端產(chǎn)物阻遏：當(dāng)培養(yǎng)基中存在某一合成代謝有關(guān)的末端產(chǎn)物時，與該產(chǎn)物的合成有關(guān)的酶的合成便停止精氨酸合成過程中的鳥氨酸甲?；D(zhuǎn)移酶：調(diào)節(jié)基因產(chǎn)生阻遏蛋白，與共阻遏物結(jié)合，成為有活性的阻遏物 R O 阻遏蛋白 RNA聚合酶11 酶活調(diào)節(jié)別構(gòu)調(diào)節(jié)一個多步驟組成的代謝途徑中，反應(yīng)產(chǎn)物的積累會造成產(chǎn)物與酶的結(jié)合，而抑制了該酶的活性。末端產(chǎn)物反饋抑制通常是第一個酶。如大腸桿菌的EMP第一個酶別構(gòu)效應(yīng)：調(diào)節(jié)物或效應(yīng)物與酶分子上的非催化部位結(jié)合后，誘導(dǎo)出或穩(wěn)定住酶分

19、子的某種構(gòu)象，使酶活性中心對底物的結(jié)合和催化作用受到影響，從而調(diào)節(jié)酶反應(yīng)速度及代謝過程，此效應(yīng)即為酶的別構(gòu)調(diào)節(jié)【圖解】效應(yīng)物，正 負(fù)天冬氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶(ATCase)ATCase reactionCatalyzes the first step in the biosynthesis of pyrimidines 酶 低活性狀態(tài) 高活性狀態(tài) 來源 糖原合成酶 去磷酸化 磷酸化 真核細(xì)胞丙酮酸脫氫酶 去磷酸化 磷酸化 真核細(xì)胞糖原磷酸化酶 磷酸化 去磷酸化 真核細(xì)胞磷酸化酶 b激酶 磷酸化 去磷酸化 哺乳動物谷氨酰胺合成酶 腺苷?；?去腺苷?；?原核細(xì)胞*可逆共價修飾：磷酸化/去磷酸化，乙?；?

20、去乙?；佘挣；?去腺苷?；?，尿苷?；?去尿苷酰化，甲基化/去甲基化，SS/SH修飾調(diào)節(jié)通過修飾酶使共價調(diào)節(jié)酶的多肽鏈上的某些基團(tuán)進(jìn)行可逆的共價修飾，使之處于活性與非活性的互變狀態(tài)，從而導(dǎo)致調(diào)節(jié)酶的活化或抑制，以控制代謝的速率與方向易經(jīng) 賁 上九 象曰：白賁，無咎，上得志也紅樓夢第24回：寶玉一面吃茶,在一面仔細(xì)打量那丫頭:穿著幾件半新不舊的衣裳,倒是一頭黑鬒鬒的頭發(fā),挽著個纉兒,容長臉面,細(xì)巧身材,卻十分俏麗干凈12 代謝工程代謝工程（Metabolic engineering）是指利用多基因重組技術(shù)有目的地對細(xì)胞代謝途徑進(jìn)行修飾、改造，改變細(xì)胞特性，并與細(xì)胞基因調(diào)控、代謝調(diào)控及生化工程相

21、結(jié)合，為實現(xiàn)構(gòu)建新的代謝途徑生產(chǎn)特定目的產(chǎn)物而發(fā)展起來的一個新的學(xué)科領(lǐng)域代謝工程調(diào)控與技術(shù)：以氨基酸發(fā)酵為例氨基酸的用途與生產(chǎn)方法降低反饋作用物濃度：谷氨酸棒桿菌瓜氨酸缺陷型進(jìn)行的鳥氨酸發(fā)酵，限制Arg濃度Glu N-乙酰谷氨酸N-乙酰-谷氨酰磷酸N-乙酰-谷氨酸半縮醛N-乙酰鳥氨酸鳥氨酸瓜氨酸精氨酸反饋抑制降低反饋作用物濃度谷氨酸棒桿菌瓜氨酸缺陷型進(jìn)行的鳥氨酸發(fā)酵,限制Arg濃度13 轉(zhuǎn)基因工程Lysine deficiency cause disease of malnutrition. Lysine fortification improved stress response, immu

22、ne status and child growth Cereals seeds are the main source of protein in many countries, but their nutritional quality is limits by the low lysine content Thus improving their lysine content and therefore nutritional quality is an important goal Approaches to improve the nutritional values of tran

23、sgenic plants by increasing their lysine contentThe biological value of a plant-based diet with limited lysine and methionine contents can be equivalent to only 50-75% of a diet with balanced essential amino acidsIn cultures with a primarily vegetarian diet, such amino acid deficiencies can lead to

24、retarded mental and physical development in young children as well as reduction in protein content and in the immune status Lysine content in cereals (g/100 g of food) 0.3 0.2 Beef1.6 0.1 2.1 mole%3.7 mole%2.1 mole% The level of lysine should be 5.5 mole% aa derived from ingested protein must be present in balanced amounts. Any that are present in amounts in excess of saturation levels defined by the first limiting aa are catabolized for energy productionThe biosynthesis of