生物化學(xué)DNA生物合成

1、核酸與蛋白質(zhì)的生物 合成及基因工程第一節(jié) DNA的生物合成一. DNA的半保留復(fù)制 Watson和Crick開(kāi)創(chuàng)性的論文，對(duì)DNA雙螺旋的描述以這樣一段陳述結(jié)尾：“不出我們的意料，我們所假設(shè)的特異性配對(duì)立即提示一種遺傳物質(zhì)可能的復(fù)制機(jī)制?！?復(fù)制時(shí), 每一條DNA鏈在新鏈合成中充當(dāng)模板，按堿基配對(duì)方式形成兩個(gè)新的DNA分子，每個(gè)分子都含有一條新鏈和一條舊鏈，這種復(fù)制方式即半保留復(fù)制(semiconservative replication)。DNA復(fù)制可能的三種方式新鏈舊鏈DNA的半保留復(fù)制的生物學(xué)意義：DNA的半保留復(fù)制表明DNA在代謝上的穩(wěn)定性，保證親代的遺傳信息穩(wěn)定地傳遞給后代。 （但D

2、NA在代謝上的穩(wěn)定性并非指DNA是一種惰性物質(zhì)。）DNA Replication半保留復(fù)制親代第一代第二代半保留復(fù)制的實(shí)驗(yàn)證據(jù) 1958年Meselson和Stahl用同位素15N標(biāo)記大腸桿菌DNA，首先證明了DNA的半保留復(fù)制。由Meselson和Stahl設(shè)計(jì)證明半保留復(fù)制的實(shí)驗(yàn)被譽(yù)為 生物學(xué)最美麗的實(shí)驗(yàn)Meselson和Stahl于42年以后在最初他們相遇的一顆樹(shù)下重逢時(shí)的合影Meselson 和Stahl的證明DNA半保留復(fù)制的實(shí)驗(yàn)流程 重輕雜和 DNA雜和 DNA二. 復(fù)制的起點(diǎn)和方向 復(fù)制是一個(gè)高度協(xié)調(diào)的過(guò)程，母鏈解鏈和復(fù)制同時(shí)進(jìn)行。（一）概念 復(fù)制子(replicon)：從一個(gè)D

3、NA復(fù)制起點(diǎn)開(kāi)始，最終由這個(gè)起點(diǎn)起始的復(fù)制叉完成的片段。基因組能獨(dú)立進(jìn)行復(fù)制的單位。 起點(diǎn)(origin)：控制復(fù)制起始，是約含有100200個(gè)堿基對(duì)的一段DNA。細(xì)胞內(nèi)存在著能識(shí)別起點(diǎn)的特殊蛋白質(zhì)。終點(diǎn)(terminus)：終止復(fù)制的序列位點(diǎn).復(fù)制叉(replication fork)：復(fù)制開(kāi)始后由于DNA雙鏈解開(kāi)，在兩股單鏈上進(jìn)行復(fù)制，形成在顯微鏡下可看到的叉狀結(jié)構(gòu)。原核生物：只有一個(gè)復(fù)制子真核生物：多個(gè)復(fù)制子，多個(gè)起點(diǎn)，形成多個(gè) “復(fù)制眼”或“復(fù)制泡”（二）起始點(diǎn)和方向 1. 原核生物和真核生物復(fù)制都是在DNA分子特定的位置起始的，如大腸桿菌起始點(diǎn)有固定的保守順序GATC和TTATCCA

4、CA，多次出現(xiàn)，可被酶識(shí)別。 2. 方向：大多是雙向、對(duì)稱(chēng)復(fù)制, 也有單向或不對(duì)稱(chēng)的。 3. 速度： 原核生物復(fù)制叉移動(dòng)快(約105bp/min); 真核生物復(fù)制叉移動(dòng)慢 (約51025103bp/min) 復(fù)制起始點(diǎn)、復(fù)制子與復(fù)制叉（動(dòng)畫(huà)演示）概述-DNA復(fù)制的一般特征以原來(lái)的DNA兩條鏈作為模板，4種dNTP為前體，需要Mg2模板DNA需要解鏈半保留復(fù)制需要引物主要是RNA，少數(shù)是蛋白質(zhì) 復(fù)制的方向始終是53 具有固定的起點(diǎn) 多為雙向復(fù)制，少數(shù)為單向復(fù)制 半不連續(xù)性 具有高度的忠實(shí)性三. 原核細(xì)胞DNA的復(fù)制（一）DNA聚合酶 ( DNA polymerase, DNA-pol )DNA聚

5、合酶是一種催化依賴(lài)模板的由脫氧核苷三磷酸前體合成DNA的酶。1956 年 Arthur kornberg 等首先從大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)DNA聚合酶，其后在廣泛不同的生物中都找到有這種酶。以大腸桿菌為代表的 “-復(fù)制”系統(tǒng)為例 DNA聚合酶的反應(yīng)特點(diǎn)： 4種dNTP底物：(dATP dGTP dCTP dTTP)； 接受模板指導(dǎo): 解開(kāi)成單鏈的DNA母鏈； 需引物提供3-OH； 新鏈生長(zhǎng)方向： 53； 產(chǎn)物DNA性質(zhì)與模板相同。 此外, DNA復(fù)制過(guò)程中還需其它酶和蛋白質(zhì)因子.模板DNA鏈引 物新加入的dNTP脫氧核糖親核攻擊53生長(zhǎng)的DNA鏈* 引物 (primer) 是一個(gè)和模板鏈互補(bǔ)的線性片段,

6、 其上帶有能與核苷酸相結(jié)合的游離3-OH. 引物通常是寡聚RNA.1. 大腸桿菌DNA聚合酶 pol 也稱(chēng)Kornberg酶, 是各種DNA聚合酶中研究最透徹的，它的一些特點(diǎn)代表了DNA聚合酶的基本特點(diǎn)：（1） pol 的性質(zhì) 分子量：103 000，單鏈，球形，活性部位含 Zn2， 電鏡下可以看到二聚體，每個(gè)細(xì)胞有400個(gè)酶分子。（2）功能： 53聚合酶活性； 酶與模板結(jié)合后構(gòu)象改變，識(shí)別堿基，正 確配對(duì)后才發(fā)揮聚合作用(對(duì)底物進(jìn)行專(zhuān)一性核對(duì)) 3 5外切酶活性； 主要是對(duì)新生DNA鏈進(jìn)行校對(duì)，防止“錯(cuò)配” 53外切酶活性。 主要是對(duì)DNA損傷的修復(fù)，以及在DNA復(fù)制時(shí)RNA引物的切除及其空

7、隙的填補(bǔ) 可見(jiàn)，DNA pol是1個(gè)多功能酶。（DNA復(fù)制過(guò)程中堿基配對(duì)要受到雙重核對(duì)）2. 大腸桿菌DNA聚合酶 pol (1) 多亞基, 聚合酶亞基 (單鏈) 分子量為88 000, 每個(gè)細(xì)胞有100個(gè)酶分子（2）功能： 53聚合酶活性； 35外切酶活性。 （該酶無(wú)53外切酶活性 ） 目前認(rèn)為該酶主要參與DNA損傷的修復(fù)。3. 大腸桿菌DNA聚合酶 pol 真正的DNA復(fù)制酶，1972年發(fā)現(xiàn) （1）pol 是真正起復(fù)制作用的酶，由10種亞基組成不對(duì)稱(chēng)二聚體, 、組成核心酶 （2）功能： 53聚合酶活性； 35外切酶活性。 該酶在原核細(xì)胞中主要負(fù)責(zé)DNA鏈的延伸，是復(fù)制延長(zhǎng)中真正起催化作用的

8、酶。 (該酶無(wú)53外切酶活性) E. coli DNA 聚合酶不對(duì)稱(chēng)二聚體可滑動(dòng)的 夾持器亞基催化亞基35外切酶亞基前導(dǎo)鏈 合成后隨鏈 合成 夾持器裝置催化亞基 亞基保持核心酶 的二聚體結(jié)構(gòu)亞基具有53方向合成DNA的催化活性亞基具有35外切酶活性，起校對(duì)功能， 可提高聚合酶復(fù)制DNA的保真性 亞基可能起組建的作用亞基猶如夾子，功能是識(shí)別引物、夾住DNA 分子向前滑動(dòng) 亞基起著促使核心酶二聚化的作用其余的亞基構(gòu)成 -復(fù)合物，主要功能是幫助 亞基夾住DNA（也稱(chēng)夾子裝置器），并有 增強(qiáng)核心酶活性的作用DNA 聚合酶 pol pol pol 亞基數(shù)目 1 7 105 3 聚合酶活性 + + + 3

9、 5 外切酶活性 + + +5 3 外切酶活性 + - -聚合速度(核苷酸/分) 1 000-1 200 2 400 15 000-60 000 持續(xù)合成能力 3-200 1 500 500 000功能 切除引物,修復(fù) 修復(fù) 復(fù)制表 大腸桿菌3種DNA聚合酶性質(zhì)比較（1）DNA的半不連續(xù)復(fù)制： DNA雙鏈復(fù)制時(shí)，一條鏈?zhǔn)沁B續(xù)合成的(前導(dǎo)鏈, leading strand), 另一條鏈?zhǔn)遣贿B續(xù)合成的(滯后鏈或后隨鏈, lagging strand), 這種前導(dǎo)鏈的連續(xù)復(fù)制和后隨鏈的不連續(xù)復(fù)制方式稱(chēng)DNA的半不連續(xù)復(fù)制。（二）雙鏈DNA復(fù)制的分子機(jī)制1、岡崎片段和半不連續(xù)復(fù)制（2）岡崎片段： 在不

10、連續(xù)的后隨鏈DNA合成中形成的DNA短片段，在原核生物有10002000核苷酸，真核生物約100200核苷酸。1968年岡崎發(fā)現(xiàn)。 35353535解鏈方向領(lǐng)頭鏈(leading strand)后隨鏈(lagging strand)DNA的半不連續(xù)復(fù)制35復(fù)制叉起點(diǎn)復(fù)制叉延伸延伸起點(diǎn)領(lǐng)頭鏈領(lǐng)頭鏈隨后鏈隨后鏈3535DNA的雙向復(fù)制5555555533333332、DNA半不連續(xù)復(fù)制中的RNA引物 （1）前導(dǎo)鏈和滯后鏈的合成都需要RNA引物。 （2）引物合成酶(引發(fā)酶)：是以DNA為模板的RNA聚合酶（合成方向53）, 合成的引物長(zhǎng)度為510多個(gè)核苷酸。 (3) 引物RNA的起始和終止的位置受解

11、鏈酶、引發(fā)酶、模板順序及其二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響。 （4）DNA聚合酶切除前導(dǎo)鏈及岡崎片段的引物后, 填補(bǔ)空缺，由DNA連接酶將切口連接。 RNA引物的合成稱(chēng)作“引發(fā)” 。 后隨鏈的合成需多次引發(fā)作用，而發(fā)動(dòng)前導(dǎo)鏈的合成只需一次引發(fā)。 前導(dǎo)鏈的引物一般比岡崎片段的引物略長(zhǎng)一些，前者大約為1060nt，后者通常為幾個(gè)10多個(gè)nt。 成熟的DNA是不含RNA的，RNA引物最終被DNA所置換。3、DNA連接酶（ligase）催化兩段DNA之間的連接:35535353HOP DNA ligaseNADATPNMNAMP+PPi+ DNA連接酶（1967年發(fā)現(xiàn)）：若雙鏈DNA中一條鏈有切口, 一端是3-OH,

12、另一端是5-磷酸基, 連接酶可催化這兩端形成磷酸二酯鍵，而使切口連接。 但它不能將兩條游離的DNA單鏈連接起來(lái)。 大腸桿菌和其它細(xì)菌的DNA連接酶需要NAD+提供能量;在真核生物、病毒和噬菌體中，則要ATP提供能量。3535OHP4. 母本DNA雙鏈的分離 (1) DNA解鏈酶(解螺旋酶)：通過(guò)水解ATP將復(fù)制叉前方的DNA雙鏈打開(kāi)。每解開(kāi)一對(duì)堿基需要水解2個(gè)ATP分子。 (2) 單鏈結(jié)合蛋白(single-strand binding protein, SSB)：穩(wěn)定已被解開(kāi)的DNA單鏈，阻止復(fù)性和保護(hù)單鏈不被核酸酶降解。 (3) DNA轉(zhuǎn)軸酶（拓?fù)洚悩?gòu)酶）和旋轉(zhuǎn)酶（拓?fù)洚悩?gòu)酶）: 兼有內(nèi)切

13、酶和連接酶活性, 可迅速使DNA兩條鏈斷開(kāi)又接上, 消除解鏈酶產(chǎn)生的拓?fù)鋸埩Α．?dāng)引入負(fù)超螺旋時(shí)需要由ATP提供能量, 同復(fù)制有關(guān)?？偨Y(jié): 原核生物DNA的復(fù)制過(guò)程:(以大腸桿菌為例) 雙鏈的解開(kāi) 起始-RNA引物的合成 DNA鏈的延伸 終止B. RNA引物的合成 引發(fā)體先與DNA起始部位雙鏈結(jié)合，通過(guò)引物合成酶形成前導(dǎo)鏈引物后，再沿53模板鏈與復(fù)制叉同向移動(dòng)，在移動(dòng)中斷斷續(xù)續(xù)形成岡崎片段的RNA引物。A. 雙鏈的解開(kāi) DNA旋轉(zhuǎn)酶(拓?fù)洚悩?gòu)酶)、 DNA解鏈酶、單鏈結(jié)合蛋白協(xié)同作用C. DNA鏈的延伸 在DNA pol 的催化下，以四種dNTP為底物，在RNA引物的3 端以磷酸二酯鍵連接上脫氧

14、核苷酸并釋放出焦磷酸。DNA鏈的延伸同時(shí)進(jìn)行領(lǐng)頭鏈和后隨鏈的合成。 5 35dATPdGTPdTTPdCTPdTTPdGTPdATPdCTPOH 33DNA-pol前導(dǎo)鏈的延長(zhǎng)： DNA pol 全酶二聚體的一個(gè)亞基與前導(dǎo)鏈的模板結(jié)合而發(fā)揮催化作用，與復(fù)制叉同向。滯后鏈的延長(zhǎng): DNA pol 全酶二聚體的另一亞基與形成一個(gè)環(huán)的滯后鏈的模板結(jié)合發(fā)揮催化作用。 由于模板形成環(huán), 酶向前移動(dòng)時(shí), 滯后鏈合成片段也沿53方向生長(zhǎng), 與酶催化方向一致。 滯后鏈片段合成接近前方滯后鏈片段5末端時(shí), 模板被釋放, 環(huán)消失。繼續(xù)重復(fù), 連續(xù)進(jìn)行。 當(dāng)新形成的岡崎片段延長(zhǎng)至一定長(zhǎng)度, 其3-OH遇到上一個(gè)岡崎

15、片段時(shí)即停止合成。 一旦岡崎片段合成完成，其RNA引物即被除去，通過(guò)DNA聚合酶催化合成DNA取而代之，并形成一個(gè)切口，此切口由DNA連接酶連接封閉。D. 復(fù)制終止 細(xì)菌環(huán)狀染色體的兩個(gè)復(fù)制叉向前推移，在終止區(qū)相遇而停止復(fù)制，復(fù)制體解體。 這樣, 以?xún)蓷l親代DNA鏈為模板，各自形成一條新的DNA互補(bǔ)鏈，結(jié)果形成了兩個(gè)DNA雙股螺旋分子。 就目前所知，起始階段是DNA復(fù)制中唯一一個(gè)可以受調(diào)節(jié)的階段，由于受到調(diào)節(jié)而使得DNA在一個(gè)細(xì)胞周期中只發(fā)生一次復(fù)制。 細(xì)菌復(fù)制終止區(qū)含有多個(gè)約22bp的終止子(terminator)位點(diǎn)，E. coli 有6個(gè)終止子位點(diǎn)。大腸桿菌DNA復(fù)制終止區(qū)的結(jié)構(gòu) 復(fù)制的

16、保真性 ( fidelity )(忠實(shí)性)主要依賴(lài) 5 種機(jī)制：5. DNA復(fù)制的高度忠實(shí)性 大腸桿菌DNA復(fù)制錯(cuò)配率約10-910-10。其染色體中有4.5106bp，平均每1 00010 000個(gè)細(xì)胞經(jīng)過(guò)一次分裂才會(huì)插入一個(gè)不正確的堿基。（1）四種dNTPs濃度的平衡（2）DNA聚合酶的高度選擇性（3）DNA聚合酶的自我校對(duì)(proofreading)（4）錯(cuò)配修復(fù)（5）使用RNA作為引物并最終被切除、置換(一) 真核生物的DNA聚合酶:至少5種- DNA-pol 現(xiàn)認(rèn)為其功能只是合成引物DNA-pol 在復(fù)制延長(zhǎng)中起催化作用DNA-pol 校對(duì)、修復(fù)、填補(bǔ)(類(lèi)似E.coli DNA po

17、l I )DNA-pol 線粒體DNA合成DNA-pol 核DNA修復(fù) 四、真核細(xì)胞DNA的復(fù)制（DNA指導(dǎo) 下的DNA合成）推測(cè)在復(fù)制叉上有一個(gè)DNA pol, 以合成引物; 兩個(gè)DNA pol, 分別合成前導(dǎo)鏈和滯后鏈。（二）真核生物中DNA的復(fù)制特點(diǎn)1、真核生物染色體有多個(gè)復(fù)制起點(diǎn)，多復(fù)制眼，呈雙向復(fù)制，多復(fù)制子。2、岡崎片段長(zhǎng)約200bp.3、真核生物DNA復(fù)制速度比原核慢。4、真核生物染色體在全部復(fù)制完之前起點(diǎn)不再重新開(kāi)始復(fù)制；而在快速生長(zhǎng)的原核中，起點(diǎn)可以連續(xù)發(fā)動(dòng)復(fù)制。真核生物快速生長(zhǎng)時(shí)，往往采用更多的復(fù)制起點(diǎn)。5、真核生物有多種DNA聚合酶。6、真核生物線性染色體兩端有端粒結(jié)構(gòu)，

18、防止染色體間的末端連接。由端粒酶負(fù)責(zé)新合成鏈5端RNA引物切除后的填補(bǔ)，亦保持端粒的一定長(zhǎng)度。五、反轉(zhuǎn)錄作用（RNA指導(dǎo)的DNA合成）定義: 以RNA為模板, 按照RNA中的核苷酸順序合成DNA的過(guò)程稱(chēng)為反轉(zhuǎn)錄(reverse transcription, RT)。該過(guò)程由反轉(zhuǎn)錄酶催化進(jìn)行。1970年Temin和Baltimore同時(shí)分別從(雞)勞氏肉瘤病毒和小白鼠白血病病毒等致病RNA病毒中分離出反轉(zhuǎn)錄酶，迄今已知的致癌RNA病毒都含有反轉(zhuǎn)錄酶。+RNA+DNA-RNA+DNA-DNA+病毒RNA的反轉(zhuǎn)錄過(guò)程 （以前病毒形式整合到宿主細(xì)胞DNA中而使細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化） 單鏈病毒RNA RNA-DNA雜交分子 雙鏈DNA（前病毒） 反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄酶 逆轉(zhuǎn)錄酶是多功能酶，兼有3種酶的活性： RNA指導(dǎo)的DNA聚合酶活性 DNA指導(dǎo)的DNA聚合酶活性 核糖核酸酶H的活性，專(zhuān)一水解RNA-DNA雜交分子 中的RNA，可沿5 和3兩個(gè)方向起核酸外切酶的 作用，切除雜交分子中的RNA反轉(zhuǎn)錄酶也和DNA聚合酶一樣, 沿53 方向合成