酶和細(xì)胞固定化技術(shù)(2)PPT

1、關(guān)于酶與細(xì)胞的固定化技術(shù) (2)第一張，PPT共六十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月酶應(yīng)用過(guò)程中的一些不足酶的穩(wěn)定性較差：除了某些耐高溫的酶，如-淀粉酶等；和胃蛋白酶等可以耐受較低的pH條件以外，大多數(shù)的酶在高溫、強(qiáng)酸、強(qiáng)堿和重金屬離子等外界因素影響下，都容易變性失活。 酶的一次性使用：酶一般都是在溶液中與底物反應(yīng)，這樣酶在反應(yīng)系統(tǒng)中，與底物和產(chǎn)物混在一起，反應(yīng)結(jié)束后，即使酶仍有很高的活力，也難于回收利用。這種一次性使用酶的方式，不僅使生產(chǎn)成本提高，而且難于連續(xù)化生產(chǎn)。 產(chǎn)物的分離純化較困難：酶反應(yīng)后成為雜質(zhì)與產(chǎn)物混在一起，無(wú)疑給產(chǎn)物的進(jìn)一步的分離純化帶來(lái)一定的困難。 固定化技術(shù)第二張，PPT共六十

2、四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月酶的固定化 1、什么是固定化技術(shù)和固定化酶2、固定化酶的研究歷史3、酶的固定化技術(shù)4、固定化酶的特點(diǎn)GoGoGoGo第三張，PPT共六十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 固定化生物技術(shù) 通過(guò)化學(xué)或物理的手段將酶或游離細(xì)胞定位于限定的空間區(qū)域內(nèi)，使其保持活性并可反復(fù)利用。 第四張，PPT共六十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月1.酶是蛋白質(zhì)，穩(wěn)定性差（熱、酸堿、有機(jī)溶劑對(duì)其有影響）。2.不能回收，也使產(chǎn)物中混雜酶蛋白。3.分離純化困難。 游離酶的缺點(diǎn)：第五張，PPT共六十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月什么是固定化酶？水溶性酶水不溶性載體水不溶性酶（固定化酶）固定化技術(shù)第六張，PPT共六十

3、四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月固定化酶固定化酶：是指借助物理或化學(xué)方法將酶固定在載體上，并在一定的空間內(nèi)進(jìn)行催化反應(yīng)的酶。固定化酶可以連續(xù)地進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)后的酶可以回收重復(fù)使用。固定化酶形狀：顆粒、線條、薄膜和酶管等。固定化菌體優(yōu)點(diǎn)：1）可提高穩(wěn)定性；2）能回收，易與產(chǎn)物分離，可反復(fù)使用；3）可連續(xù)化生產(chǎn)操作；4）可實(shí)現(xiàn)最優(yōu)化控制；5）酶可以再生利用。缺點(diǎn)：1）酶固定化后酶活力有損失；2）只能用于可溶性小分子底物；3）與完整細(xì)胞比較，不適于多酶反應(yīng)。第七張，PPT共六十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月制備固定化酶的依據(jù)固定化酶必須能保持酶原有的專一性、高效催化能力和常溫、常壓下能起催化反應(yīng)等特點(diǎn)。固定化

4、酶應(yīng)能回收、貯藏，利于反復(fù)使用。固定化酶應(yīng)用于機(jī)械化和自動(dòng)化操作，所用載體常有一定的機(jī)械強(qiáng)度。固定化酶應(yīng)能保持甚至超過(guò)原有酶液的活性。即要保護(hù)活性中心基團(tuán)。固定化酶應(yīng)能最大程度與底物接近，從而提高產(chǎn)量。具有最小的空間位阻。固定化酶應(yīng)有最大的穩(wěn)定性。定化酶應(yīng)易與產(chǎn)物分離。第八張，PPT共六十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月固定化方法 吸附法 結(jié)合法 交聯(lián)法 包埋法網(wǎng)格型微囊型共價(jià)鍵結(jié)合法離子鍵結(jié)合法酶的固定化方法第九張，PPT共六十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 1、吸附法 利用各種固體吸附劑將酶或含酶菌體吸附在其表面上，而使酶固定化的方法。 常用的固體吸附劑有活性炭、氧化鋁、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、

5、硅膠、羥基磷灰石等。 操作簡(jiǎn)便，條件溫和，不會(huì)引起酶變性失活，載體廉價(jià)易得，而且可反復(fù)使用。 由于靠物理吸附作用，結(jié)合力較弱，酶與載體結(jié)合不牢固而容易脫落，所以使用受到一定的限制。 第十張，PPT共六十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月優(yōu)點(diǎn)：條件溫和，操作簡(jiǎn)便，酶活力損失少。缺點(diǎn)：結(jié)合力弱，易解吸附。第十一張，PPT共六十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 2、結(jié)合法選擇適宜的載體，使之通過(guò)共價(jià)鍵或離子鍵與酶結(jié)合在一起的固定化方法。根據(jù)酶與載體結(jié)合的化學(xué)鍵不同，可分為：離子鍵結(jié)合法：通過(guò)離子鍵使酶與載體結(jié)合的固定化方法稱為離子鍵結(jié)合法。離子鍵結(jié)合法所使用的載體是某些不溶于水的離子交換劑。常用的有DEAE-纖維

6、素、TEAE-纖維素、DEAE-葡聚糖凝膠等。 共價(jià)鍵結(jié)合法：通過(guò)共價(jià)鍵將酶與載體結(jié)合的固定化方法稱為共價(jià)鍵結(jié)合法。共價(jià)鍵結(jié)合法所采用的載體主要有：纖維素、瓊脂糖凝膠、葡聚糖凝膠、甲殼質(zhì)、氨基酸共聚物、甲基丙稀醇共聚物等。酶分子中可以形成共價(jià)鍵的基團(tuán)主要有：氨基、羧基、巰基、羥基、酚基和咪唑基等。要使載體與酶形成共價(jià)鍵，必須首先使載體活化。第十二張，PPT共六十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月第一個(gè)離子結(jié)合法固定化酶：DEAE-Cellulose固定化過(guò)氧化氫酶第一個(gè)工業(yè)化的固定化酶：DEAE-Sephadex A-50固定化氨基酰化酶第十三張，PPT共六十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 借助共價(jià)鍵將酶

7、的活性非必需側(cè)鏈基團(tuán)和載體的功能基團(tuán)進(jìn)行偶聯(lián)。共價(jià)結(jié)合法（covalent binding or covalent coupling） 第十四張，PPT共六十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 1）載體：親水載體優(yōu)于疏水載體 如:天然高分子衍生物: 纖維素 葡聚糖凝膠 親和性好，機(jī)械性能差 瓊脂糖 合成聚合物： 聚丙烯酰胺 聚苯乙烯 機(jī)械性能好，但有疏水結(jié)構(gòu) 尼龍第十五張，PPT共六十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 使載體活化的方法很多，主要的有：重氮化法、疊氮法、溴化氰法、烷基化法等。第十六張，PPT共六十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月優(yōu)點(diǎn)：酶與載體結(jié)合牢固，不會(huì)輕易脫落，可連續(xù)使用。缺點(diǎn)：反應(yīng)條件較激烈，

8、易影響酶的空間構(gòu)象而影響酶的催化活性。 第十七張，PPT共六十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月3、交聯(lián)法借助雙功能試劑使酶分子之間發(fā)生交聯(lián)作用，制成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的固定化酶的方法。戊二醛有兩個(gè)醛基，這兩個(gè)醛基都可與酶或蛋白質(zhì)的游離氨基反應(yīng)，形成席夫（Schiff）堿，而使酶或菌體蛋白交聯(lián)，制成固定化酶或固定化菌體。交聯(lián)反應(yīng)既能發(fā)生在分子間，也可發(fā)生在分子內(nèi)。 酶濃度低時(shí)，交聯(lián)發(fā)生在分子內(nèi)，酶仍保持溶解狀態(tài)。 酶濃度高時(shí)，交聯(lián)發(fā)生在分子間，酶變?yōu)椴蝗軕B(tài)。交聯(lián)法制備的固定化酶或固定化菌體結(jié)合牢固，可以長(zhǎng)時(shí)間使用。但由于交聯(lián)反應(yīng)條件較激烈，酶分子的多個(gè)基團(tuán)被交聯(lián)，致使酶活力損失較大，而且制備成的固定化酶或固定化

9、菌體的顆粒較小，給使用帶來(lái)不便。為此，可將交聯(lián)法與吸附法或包埋法聯(lián)合使用，以取長(zhǎng)補(bǔ)短。 常用的雙功能試劑有戊二醛、己二胺、順丁烯二酸酐、雙偶氮苯等。其中應(yīng)用最廣泛的是戊二醛。第十八張，PPT共六十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月酶分子之間共價(jià)交聯(lián)和與水不溶性載體共價(jià)偶聯(lián) 酶分子；（a）酶分子之間用雙功能基團(tuán)的化學(xué)交聯(lián)試劑相互交聯(lián)成水不溶性的固定化酶；（b）酶分子被偶聯(lián)到水不溶性載體上形成水不溶性的固定化酶第十九張，PPT共六十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 缺點(diǎn)：(1)反應(yīng)條件激烈，酶分子的多個(gè)基團(tuán)被交聯(lián)，酶活力損失大。(2)制備的固定化酶顆粒較小，給使用帶來(lái)不便。 第二十張，PPT共六十四頁(yè)，創(chuàng)作于2

10、022年6月4. 包埋法 將酶用物理的方法包埋在各種載體（高聚物）內(nèi)。分為：網(wǎng)格型：將酶包埋在高分子凝膠細(xì)微網(wǎng)格中。微囊型：將酶包埋在高分子半透膜中。第二十一張，PPT共六十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月1）網(wǎng)格型包埋法（gel (lattic) entrapment） 又稱凝膠包埋法凝膠包埋條件酶活性強(qiáng)度天然凝膠瓊脂、海藻酸鈣、角叉菜膠、明膠溫和不變差合成凝膠聚丙烯酰胺、光交聯(lián)樹(shù)脂聚合反應(yīng)部分失活高使用的多孔載體及其特點(diǎn)第二十二張，PPT共六十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月海藻酸鈣凝膠包埋法： 滴至海藻酸鈉溶液E (or cell) CaCl2 溶液中 IE(or IC) 角叉菜膠包埋法： 滴至角叉

11、菜膠E (or cell) KCl 溶液中 IE (or IC)聚丙烯酰胺凝膠包埋法： APAcr+ Bis+E (or cell) IE (or IC) TEMED第二十三張，PPT共六十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月2）微囊型包埋法（microencapsulation） 又稱半透膜包埋法 將一定量酶液包在半透性的高分子微孔膜內(nèi) 。半透膜：直徑幾十微米到幾百微米，厚約25nm。 半透膜孔徑酶分子孔徑，小于半透膜孔徑的小分子底物和產(chǎn)物可以自由進(jìn)出，被稱為“人工細(xì)胞”。第二十四張，PPT共六十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 與網(wǎng)格型包埋法相比，微囊型包埋法的優(yōu)點(diǎn)：1）固定化酶顆粒小，有利于底物和產(chǎn)物擴(kuò)

12、散。2）半透膜能阻止蛋白質(zhì)分子滲漏和進(jìn)入，注入體內(nèi)既可避免引起免疫過(guò)敏反應(yīng)，也可使酶免遭蛋白水解酶的降解，具有較大的醫(yī)學(xué)價(jià)值。 缺點(diǎn)：反應(yīng)條件要求高,制備成本也較高。 第二十五張，PPT共六十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 包埋法是目前應(yīng)用最多的一種較理想的方法，與其它固定化方法相比：優(yōu)點(diǎn)：不與酶蛋白氨基酸殘基反應(yīng)，很少改變酶的高級(jí)結(jié)構(gòu)，酶活回收率高。缺點(diǎn)：只適合作用于小分子底物和產(chǎn)物的酶。第二十六張，PPT共六十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 吸附法 結(jié)合法 交聯(lián)法 包埋法 酶的四種固定化方法第二十七張，PPT共六十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月第二十八張，PPT共六十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月第二十九

13、張，PPT共六十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月固定化方法吸附法包埋法結(jié)合法交聯(lián)法制備難易易較難難較難結(jié)合程度弱強(qiáng)強(qiáng)強(qiáng)活力回收高，酶易流失高低中等再生可能不能不能不能費(fèi)用低低高中等底物專一性不變不變可變可變各種固定化方法的優(yōu)缺點(diǎn)比較第三十張，PPT共六十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月固定化酶性質(zhì)固定化對(duì)酶穩(wěn)定性影響：1）對(duì)熱穩(wěn)定性提高；2）對(duì)變性劑、抑制劑的耐受性提高；3）對(duì)蛋白酶抵抗能力增加、儲(chǔ)存穩(wěn)定性和操作穩(wěn)定性有所增強(qiáng)。最適溫度：一般與游離酶相似。最適pH：受載體帶電性和產(chǎn)物性質(zhì)等最適pH會(huì)受一定影響。底物特異性：是否變化與底物的分子質(zhì)量大小有一定關(guān)系。米氏常數(shù)：固定化酶的表觀米氏常數(shù)隨載體帶電性

14、能而變化。第三十一張，PPT共六十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月固定化酶操作的注意事項(xiàng)活性中心：保護(hù)酶的催化作用，并使酶的活性中心的氨基酸基團(tuán)固有的高級(jí)結(jié)構(gòu)不受到損害，在制備固定化酶時(shí)，需要在非常嚴(yán)密的條件下進(jìn)行。功能基團(tuán)：如游離的氨基、羧基、半胱氨酸的巰基、組氨酸的咪唑基、酪氨酸的酚基、絲氨酸和蘇氨酸的羥基等，當(dāng)這些功能基團(tuán)位于酶的活性中心時(shí)，要求不參與酶的固定化結(jié)合酶的高級(jí)結(jié)構(gòu)：要避免用高溫、強(qiáng)酸、強(qiáng)堿等處理，而且有機(jī)溶劑、高濃度的鹽也會(huì)使酶變性、失活，因此，操作應(yīng)盡量在非常溫和的條件下進(jìn)行。第三十二張，PPT共六十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月分類方式固定化細(xì)胞分類方式固定化細(xì)胞細(xì)胞類型微生物植

15、物動(dòng)物生理狀態(tài)死細(xì)胞:完整細(xì)胞,細(xì)胞碎片, 細(xì)胞器活細(xì)胞:增殖細(xì)胞,靜止細(xì)胞, 饑餓細(xì)胞細(xì)胞的固定化方法第三十三張，PPT共六十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 1) 直接固定法 不使用載體，借助物理（如加熱、冰凍）、化學(xué)方法（如檸檬酸、各種絮凝劑）將細(xì)胞直接固定。 一般只用于單酶或少數(shù)幾種酶催化的反應(yīng)。 2)吸附法 3)包埋法 2. 固定化方法第三十四張，PPT共六十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 與固定化酶相比，固定化細(xì)胞的情況比較復(fù)雜。 （1）有活性升高的現(xiàn)象。（2）穩(wěn)定性的增加 。（3）最適溫度和最適pH常保持不變。固定化細(xì)胞的特點(diǎn) 第三十五張，PPT共六十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月固定化酶（細(xì)

16、胞）的評(píng)價(jià)指標(biāo)（一）固定化酶（細(xì)胞）活力：固定化酶通常呈顆粒狀，一般用于測(cè)定自然酶活力的方法改進(jìn)后才能用于測(cè)定固定化酶。 通常采用間歇測(cè)定和連續(xù)測(cè)定方法。蛋白總量：1）雙辛可寧酸法(BCA法) ；2）考馬斯亮藍(lán)法 。半衰期：在連續(xù)測(cè)定條件下，固定化酶(細(xì)胞)的活力下降為最初活力一半所經(jīng)歷的連續(xù)工作時(shí)間，以t1/2表示，是衡量穩(wěn)定性的一項(xiàng)重要指標(biāo)。第三十六張，PPT共六十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 如果耦聯(lián)率與酶活力回收率相近，則表明固定化方法對(duì)酶活力沒(méi)有明顯影響。固定化酶（細(xì)胞）的評(píng)價(jià)指標(biāo)（二）偶聯(lián)率=(加入蛋白活力一上清液蛋白活力)/加入蛋白活力100%活力回收率=固定化酶總活力/加入酶的總

17、活力100%相對(duì)活力=固定化酶總活力/ (加入酶的總活力-上清液中未偶聯(lián)酶活力)100%第三十七張，PPT共六十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月乙酰 -DL Ala L Ala +乙酸乙酰 -D Ala固定化酶與固定化細(xì)胞的應(yīng)用 一、在工業(yè)生產(chǎn)上的應(yīng)用 1. 氨基?；福ˋminoacylase） 世界上第一種工業(yè)化生產(chǎn)的固定化酶第三十八張，PPT共六十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月泵儲(chǔ)罐反應(yīng)產(chǎn)物離心機(jī)消旋反應(yīng)器固定化酶柱子晶體 L-AlaL-Ala A-D-AlaA-L-Ala A-D-Ala第三十九張，PPT共六十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 2.葡萄糖異構(gòu)酶 世界上生產(chǎn)規(guī)模最大，應(yīng)用最為成功的一種固

18、定化酶。第四十張，PPT共六十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月二、固定化酶在醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用 1. 消血栓：纖溶酶是異源蛋白質(zhì)，在人體內(nèi)引起免疫反應(yīng)，無(wú)法長(zhǎng)期使用。酶的不穩(wěn)定性使其在較短的時(shí)間內(nèi)失活。 用包埋法制備的酶固定化技術(shù)可克服上述弊端，酶在囊中不能漏出，小分子物質(zhì)能自由進(jìn)出。第四十一張，PPT共六十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月2. 人工腎：原理：將病人血液中的尿素經(jīng)脲酶水解成氨，再用活性炭吸附。即：用固定化脲酶和微膠囊活性炭組成人工腎。第四十二張，PPT共六十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月酶?jìng)鞲衅?固定化酶和電化學(xué)傳感器的結(jié)合。 優(yōu)點(diǎn)：既有不溶性酶體系的優(yōu)點(diǎn)，又具有電化學(xué)電極的高靈敏度；酶的專一反應(yīng)性

19、，使其具有較高的選擇性，能夠直接在復(fù)雜試樣中進(jìn)行測(cè)定。 三、在分析檢測(cè)中的應(yīng)用第四十三張，PPT共六十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月Sensitive and specific Rapid SimpleBiosensor第四十四張，PPT共六十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 1967年Updike等采用酶的固定化技術(shù)，將葡萄糖氧化酶固定在疏水膜上，然后再和氧電極結(jié)合，組裝成了世界上第一個(gè)生物傳感器葡萄糖氧化酶電極。第四十五張，PPT共六十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 葡萄糖酶電極 酶電極示意圖D葡萄糖O2 D葡萄糖酸1，5內(nèi)酯H2O2半透膜酶膠層感應(yīng)電極第四十六張，PPT共六十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月

20、GlucoseGluconic acidGlucose oxidaseOxygenHydrogen peroxideMembraneElectrode 根據(jù)反應(yīng)中消耗的O2、生成的葡萄糖酸和H2O2的量，可以用氧電極、pH電極和H2O2電極來(lái)測(cè)定葡萄糖的含量。 第四十七張，PPT共六十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月繼酶?jìng)鞲衅鳎╡nzyme sensor）后，又出現(xiàn)：細(xì)胞器傳感器（cell organelle sensor）組織傳感器（tissue sensor）微生物傳感器（microbe sensor）免疫傳感器（immunosensor）第四十八張，PPT共六十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月1）酶

21、傳感器的原理生物傳感器 由生物識(shí)別單元（如酶、微生物、抗體等）和物理轉(zhuǎn)換器相結(jié)合所構(gòu)成的分析儀器。第四十九張，PPT共六十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月生物識(shí)別元件(Biological recognition element) 是酶、抗原(體)、細(xì)胞器、組織切片和微生物細(xì)胞等生物分子經(jīng)固定化后形成的一種膜結(jié)構(gòu)，對(duì)被測(cè)定的物質(zhì)有選擇性的分子識(shí)別能力。第五十張，PPT共六十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 換能器(Transducer) 將識(shí)別元件上進(jìn)行的生化反應(yīng)中消耗或生成的化學(xué)物質(zhì)，或產(chǎn)生的光或熱等轉(zhuǎn)換為電信號(hào)，并呈現(xiàn)一定的比例關(guān)系。第五十一張，PPT共六十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月第五十二張，PPT

22、共六十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月酶?jìng)鞲衅鞴ぷ髟硎疽鈭D酶?jìng)鞲衅髦饕晒潭ɑ改ず妥儞Q器組成：固定化酶膜：選擇性地“識(shí)別”并催化被檢測(cè)物質(zhì)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)；變換器：把催化反應(yīng)中底物或產(chǎn)物的變量轉(zhuǎn)換成電信號(hào)，通過(guò)儀表顯示出來(lái)。第五十三張，PPT共六十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月第五十四張，PPT共六十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月2）酶?jìng)鞲衅鞯膽?yīng)用 水質(zhì)監(jiān)測(cè) 用化學(xué)法測(cè)定酚時(shí)，硫化物、油類等可干擾其測(cè)定。 從馬鈴薯中提純、經(jīng)吸附交聯(lián)得到的固定化多酚氧化酶與氧電極構(gòu)成酚傳感器，可檢測(cè)大多數(shù)酚類化合物。第五十五張，PPT共六十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月醫(yī)療方面葡萄糖傳感器和血糖測(cè)定儀 用葡萄糖氧化酶（glucose oxidase,GOD）制成葡萄糖傳感器，可測(cè)定血液中葡萄糖濃度。 第五十六張，PPT共六十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月手掌型葡萄糖(glucose)分析儀第五十七張，PPT共六十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月SBA-50型單電極生物傳感分析儀第五十八張，PPT共六十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月