新一代測序技術(shù)的原理

1、Next-generation sequencing technology overview第1頁Agenda測序技術(shù)簡史第一代測序技術(shù)第二代測序技術(shù)第三代測序技術(shù)第2頁1 測序技術(shù)簡史19501960197019801990Development of Sanger Sequencing(1977)Invention of Automated FluorescentSequencer(1985)Invention of CapillarySequencer(1996)Invention of Applied BiosystemsSolid System()Invention of Illum

2、ina Genome Analyzer System()Invention of 454 GS 20 Sequencer()chemical degradation method by Maxam-Gilbert method(1977)Chemical degradation method by Whitfield (1954)Invention of Heliscope single molecular sequencerInvention of Single molecule real time(SMRT) DNA sequencingInvention of Nanopore sing

3、le molecular sequencing (Oxford Nanopore corporation)Invention of personal genome machineInvention of optical mappingsystem第3頁 1977年，英國人Fred Sanger 發(fā)覺，假如在DNA復(fù)制過程中摻入ddNTP，就會產(chǎn)生一系列末端終止DNA鏈，并能經(jīng)過電泳按長度分辨。 不一樣末端終止DNA鏈長度是由摻入到新合成鏈上隨機(jī)位置ddNTP決定。 由此誕生了以Sanger命名測序原理即雙脫氧鏈終止法測序原理。第4頁5磷酸3羥基3,5 -磷酸二酯鍵核苷酸形成3,5-磷酸二酯鍵示

4、意圖核酸序列形成基礎(chǔ)第5頁“雙脫氧末端終止”含義第6頁TemplatePrimerdNTPPolymeraseTerminatorCGTA終止物標(biāo)識方法因?yàn)轭伾灰粯樱?種終止物能夠在一起進(jìn)行反應(yīng)。第7頁第8頁第9頁3730 xl Sequence Map第10頁BirthdayPrinciplePyrosequencingSequencing-by-SynthesisSequencing-by-LigationRoche 454Genome Analyzer/Hiseq ABI SOLiDNext-generation sequencing/Deep sequencing technolog

5、y main platforms第11頁454測序原理測序反應(yīng)以磁珠上大量擴(kuò)增ssDNA為模板，在每一輪測序反應(yīng)中，依照T、A、C、G次序依次循環(huán)進(jìn)入，每次只進(jìn)入一個堿基。假如這種dNTP能與待測序列配對，則會在合成后釋放焦磷酸基團(tuán)。釋放焦磷酸基團(tuán)會與反應(yīng)體系中ATP硫酸化酶反應(yīng)形成ATP。生成ATP和熒光素酶共同氧化反應(yīng)體系中熒光素分子并發(fā)出熒光。經(jīng)過檢測熒光信號釋放有沒有和強(qiáng)度，確定被測分子序列。光信號由CCD攝像機(jī)檢測并反應(yīng)為峰。每個峰高度（光信號）與反應(yīng)中摻入核苷酸數(shù)目成正比。反應(yīng)結(jié)束后，ATP和未摻入dNTP由雙磷酸酶降解，淬滅光信號，并再生反應(yīng)體系。第12頁454測序流程第13頁待

6、測DNA文庫構(gòu)建將基因組DNA/cDNA片段打斷至400-800bp，將用于后繼擴(kuò)增測序接頭A和一段含有生物素接頭B連接到DNA片段上，會產(chǎn)生含有接頭AA、AB、BB、BA四種DNA片段，然后與可結(jié)合生物素磁珠結(jié)合，其中片段AA被洗脫掉，片段ABBABB結(jié)合到磁珠上，經(jīng)過變性處理回收含有接頭A和接頭B單鏈DNA。第14頁EmulsionPCR將這些ssDNA分別單獨(dú)與水油包被直徑大約28 m磁珠在一起孵育、退火，因?yàn)榇胖楸砻婧信c接頭互補(bǔ)寡聚核苷酸序列，所以ssDNA會特異地連接到磁珠上。同時孵育體系中含有PCR反應(yīng)試劑，所以能夠確保每一個與磁珠結(jié)合小片段都會在各自孵育體系內(nèi)獨(dú)立擴(kuò)增, 擴(kuò)增產(chǎn)

7、物仍能夠結(jié)合到磁珠上。反應(yīng)完成后，破壞孵育體系并富集帶有DNA磁珠。經(jīng)過擴(kuò)增反應(yīng)，每一個小片段都將被擴(kuò)增大約100萬倍，從而到達(dá)下一步測序反應(yīng)所需模板量。第15頁測序?qū)y帶DNA磁珠與其它反應(yīng)物混合物，放入PTP板中進(jìn)行測序。PTP板上含有很多直徑約為44 m小孔，每個小孔僅能容納一個磁珠，經(jīng)過這種方法固定每個磁珠位置以監(jiān)測接下測序反應(yīng)。第16頁454特點(diǎn)較高測序通量，每個循環(huán)能產(chǎn)生總量為400-600 Mb序列。提升測序讀長，長度到達(dá)400 bp，使得后繼序列拼接工作愈加高效、準(zhǔn)確。主要缺點(diǎn)是無法準(zhǔn)確測量同聚物長度。比如當(dāng)待測序列中出現(xiàn)Poly(A)情況下，測序反應(yīng)中會一次加上多個T，而加入

8、T數(shù)目只能從熒光信號強(qiáng)度來推測，有可能造成結(jié)果不準(zhǔn)確。所以454技術(shù)主要錯誤不是來自核苷酸替換，而是來自插入或缺失。第17頁BirthdayPrinciplePyrosequencingSequencing-by-SynthesisSequencing-by-LigationRoche 454Genome Analyzer/Hiseq ABI SOLiDNext-generation sequencing/Deep sequencing technology main platforms第18頁第19頁n=degenerate bases z=universal bases第20頁第21頁第2

9、2頁第23頁第24頁第25頁第26頁第27頁第28頁第29頁SOLiD特點(diǎn)通量大成本低序列短Ligase方式即使能一定程度防止phasing/pre-phasing，但增加復(fù)雜度也降低了效率靈活性差，對小數(shù)據(jù)量測序不適用Two-base coding第30頁BirthdayPrinciplePyrosequencingSequencing-by-SynthesisSequencing-by-LigationRoche 454Genome Analyzer/Hiseq ABI SOLiDNext-generation sequencing/Deep sequencing technology m

10、ain platforms第31頁2 Hiseq （Solexa）測序原理 Solexa是一個基于邊合成邊測序技術(shù)(Sequencing-By-Synthesis，SBS)新型測序方法。經(jīng)過利用單分子陣列實(shí)現(xiàn)在小型芯片(Flow Cell)上進(jìn)行橋式PCR反應(yīng)。因?yàn)樾驴赡孀钄嗉夹g(shù)能夠?qū)崿F(xiàn)每次只合成一個堿基，并標(biāo)識熒光基團(tuán)，再利用對應(yīng)激光激發(fā)熒光基團(tuán)，捕捉激發(fā)光，從而讀取堿基信息。第32頁可逆阻斷技術(shù)第33頁CTAGCTA5-3-5GT合成第一個堿基Cycle 1:按次序加入反應(yīng)試劑去除未反應(yīng)堿基和試劑激發(fā)堿基熒光并搜集熒光信號 去除阻斷基團(tuán)和熒光基團(tuán)Cycle 2-n:重復(fù)前面步驟GTCTAG

11、TCTGCTAGA基于SBSSolexa測序技術(shù)第34頁3 Hiseq 測序技術(shù)流程 制備芯片模板雜交橋式PCR擴(kuò)增測序引物準(zhǔn)備測序2 測序測序生成 base calls3 數(shù)據(jù)分析拍照圖片IntensitiesReadsAlignments4DNA打斷末端修復(fù)加A加接頭純化 文庫制備1第35頁3.1 文庫制備 Solexa有三種不一樣測序種類：Single-Read Sequencing 單向測序Paired-End Sequencing 雙向測序Indexed Sequencing 混合樣品測序這三種測序類型文庫構(gòu)建大致一致，主要區(qū)分在于接頭。第36頁Single-Read Sequenc

12、ingFragment DNA535+355+53351.End repair T4 polymerase , DNA Pol 1 (Klenow fragment)35po4po453PhosphorylationT4 polynucleaotide kinase, ATP3.Ligation of adaptors3Apo45A35po42.Add 3 Adenosine with Klenow (3exo- ) and dATP+DNA insert5533SBS oligoP7 反向互補(bǔ)序列3T5po435SBS oligoP7反向互補(bǔ)序列第37頁P(yáng)CR enrichment55335

13、55533331st round PCRP7P5SBS oligoP7 反向互補(bǔ)序列P73第38頁P(yáng)CR enrichment (cont.)5533535353532nd round PCRInsertP7P5SBS oligoP7 反向互補(bǔ)序列P5Cluster templateSBS oligoP7第39頁P(yáng)aired-End Sequencing 雙向測序Indexed Sequencing 混合樣品測序第40頁第41頁3.2 芯片制備和測序Cluster 生成步驟:固定擴(kuò)增線性化 阻斷引物雜交Cluster 生成化學(xué)步驟cBOT第42頁Flow Cell想像圖進(jìn)樣孔出樣孔第43頁Si

14、ngle-Read Sequencing(SR, 單向測序)OHFlow Cell接頭diol P7 P5 dioldiol模板雜交dioldiol 延長dioldiol 變性堿基片段雜交固定第44頁dioldiol1st cycle 變性1st cycle 退火dioldiol1st cycle 延長dioldioldioldiol2nd cycle 變性2nd cycle 退火dioldioldioldioldioldiol2nd cycle 延長n=35總數(shù)堿基片段擴(kuò)增成簇第45頁線性化OH用ddNTP ()阻斷Cluster 擴(kuò)增完成OHdioldiolOHCluster Statio

15、n 結(jié)束Primer加測序引物OHNaIO4第46頁每一個基因簇就是信號搜集照片上一個亮點(diǎn)第47頁YX經(jīng)過熒光信號讀取序列信息第48頁123789456T T T T T T T G T T G C T A C G A T 經(jīng)過熒光信號讀取序列信息第49頁3.3 測序Paired-End Sequencing (PE, 雙向測序)和Indexed SequencingSR與PEFlow Cell接頭對比 Single ReadPaired End第50頁Template Hybridization模板雜交UUOHOH Grafted flowcell芯片上接頭U P7 P5 DNA片段雜交和固

16、定 Initial extension 第一鏈延長UU Denaturation 變性UU第51頁1st cycle denaturation 變性n=25total堿基片段擴(kuò)增成簇UU1st cycle annealing退火UU1st cycle extension延長UU2nd cycle denaturation再變性UU2nd cycle annealing退火UUU2nd cycle extension延長UUU第52頁Cluster Station 結(jié)束Cluster Amplification擴(kuò)增后簇UUP5 Linearization(USER)線性化Block with ddNTPs阻斷Primer加測序引物第53頁P(yáng)aired End 雙向測序SBS進(jìn)行測序Sequencing First Read第一端測序Denaturation and De-Phosphorylation(PNK)變性與去磷酸化OHOHResynthesis of P5 Str