亞油酸氧化引起大足黑山羊肌原纖維蛋白保水性變化的機(jī)制研究

1、PAGE PAGE - 12 -亞油酸氧化引起大足黑山羊肌原纖維蛋白保水性變化的機(jī)制研究肌肉保水性的變化會(huì)導(dǎo)致肉的風(fēng)味、多汁性等隨之改變，提高加工成本，導(dǎo)致經(jīng)濟(jì)損失1。目前，許多研究表明蛋白氧化對(duì)肉保水性有著不可忽視的作用。BERTRAM等2發(fā)現(xiàn)肌原纖維蛋白(myofibrillarprotein，MP)在氧化后，MP保水性下降，形成大量二聚酪氨酸，提出氧化交聯(lián)產(chǎn)物會(huì)對(duì)MP保水性產(chǎn)生消極影響。BAO等3研究認(rèn)為氧化對(duì)于肉蛋白的保水能力是促進(jìn)因子(氧化導(dǎo)致凈負(fù)電荷增多)和抑制因子(氧化導(dǎo)致交聯(lián)聚集)之間的平衡。ZHANG等4的研究也表明適度氧化有助于蛋白質(zhì)凝膠保持較高的保水性，而過(guò)高的氧化會(huì)導(dǎo)致

2、保水性降低。通常，肌肉中的氧化以脂質(zhì)氧化為主。脂質(zhì)氧化過(guò)程中易生成、-不飽和醛等次級(jí)脂質(zhì)氧化產(chǎn)物，例如丙二醛、丙烯醛等。不飽和脂肪酸易于氧化，生成多種活性氧(reactiveoxygenspecies，ROS)物質(zhì)，形成氧化脅迫環(huán)境5。ROS會(huì)攻擊肌肉蛋白質(zhì)并導(dǎo)致氧化修飾，從而影響其電荷變化以及肉品的保水性6。ZHANG等7研究表明,脂質(zhì)氧化產(chǎn)生的ROS可以攻擊蛋白質(zhì)的敏感氨基酸側(cè)鏈，從而誘發(fā)MP氧化。此外，蛋白質(zhì)氧化產(chǎn)生的自由基物質(zhì)也可以轉(zhuǎn)移到脂質(zhì)部分，從而促進(jìn)脂質(zhì)氧化8。目前，亞油酸已被廣泛用于構(gòu)建模擬脂質(zhì)氧化系統(tǒng)。JIANG等9構(gòu)建亞油酸氧化體系誘導(dǎo)MP去折疊和交聯(lián)，發(fā)現(xiàn)MP凝膠保水性降

3、低。楊玉玲等10通過(guò)亞油酸體系研究MP氧化對(duì)凝膠質(zhì)構(gòu)的影響，結(jié)果表明，適度氧化有助于改善凝膠特性。我國(guó)肉用山羊中，重慶大足黑山羊因其處于特殊的自然環(huán)境與近百年的封閉養(yǎng)殖，具有營(yíng)養(yǎng)豐富、肉質(zhì)鮮美等特點(diǎn)，成為國(guó)內(nèi)市場(chǎng)食用的優(yōu)勢(shì)品種，極具經(jīng)濟(jì)價(jià)值11-12。與其他肉類相比，大足黑山羊肉的多不飽和脂肪酸含量較高13，其中，亞油酸含量約占總脂肪酸的10.48%12。黑山羊肌肉組織中，MP是最主要的功能性蛋白，在肉品中起著非常重要的作用。在羊肉推廣運(yùn)輸和加工過(guò)程中，不可避免地會(huì)發(fā)生脂質(zhì)氧化和蛋白質(zhì)氧化等嚴(yán)重問(wèn)題，使羊肉保水性及其制品品質(zhì)下降，造成經(jīng)濟(jì)損失。保水性是肉制品的重要品質(zhì)屬性，MP的氧化修飾會(huì)使得

4、保水性發(fā)生改變4。凈電荷的增加會(huì)引起MP膨脹并改善保水性，而結(jié)構(gòu)限制則禁止無(wú)限膨脹14。然而，MP氧化如何調(diào)節(jié)促進(jìn)因子和抑制因子之間的平衡來(lái)影響保水性，以及哪一個(gè)因子對(duì)這種平衡起主導(dǎo)作用還很少被探討。因此，本研究基于亞油酸氧化體系探究黑山羊肉MP的氧化修飾及對(duì)電荷與保水性的影響，以期從電荷水平深入理解MP氧化并為有效調(diào)控黑山羊肉蛋白氧化帶來(lái)的品質(zhì)劣變提供理論參考。1材料與方法1.1材料與試劑選取重慶大足縣同一牧場(chǎng)(246)月齡的黑山羊，宰后取其背最長(zhǎng)肌，在04下分割成每塊200g，置于液氮中快速運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室，保存在-80冰箱中待使用。酒石酸鉀鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、氯化鈉、三氯乙酸、乙酸乙

5、酯、甘氨酸、溴酚藍(lán)、2,4-二硝基苯肼、5,5-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)、十二烷基硫酸鈉、亞油酸(分析純)，范德(北京)生物科技有限公司；SDS試劑盒，北京索萊寶科技有限公司；脂肪氧合酶(分析純)，上海源葉生物科技有限公司。1.2儀器與設(shè)備YP-B10002電子分析天平，上海光正醫(yī)療儀器有限公司；2K-15冷凍離心機(jī)，德國(guó)Sigma公司；F-2500熒光分光光度計(jì)、UV-16001紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)，日本島津儀器有限公司；XHF-D內(nèi)切式勻漿機(jī)、SCIENTZ-12N真空冷凍干燥機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司；DYY-8C型電泳儀，北京六一生物科技有限公司。1.3實(shí)驗(yàn)方法1.3.1MP提

6、取參考JIANG等9的方法提取MP。將黑山羊里脊肉的結(jié)締組織和筋膜剔除，切碎后加入4倍體積的磷酸鹽緩沖液(pH7.0)，11500r/min均質(zhì)化2min后冷凍離心(4、3500g、10min)，整個(gè)過(guò)程重復(fù)3次。隨后加入磷酸鹽緩沖液(pH6.25、0.1mol/LNaCl)，相同條件下均質(zhì)離心。接著加入磷酸鹽緩沖液(pH6.0、0.1mol/LNaCl)，均質(zhì)后用4層紗布過(guò)濾，濾液離心10min，所得沉淀即為MP提取物，貯存在4條件下并在12h內(nèi)使用。采用雙縮脲法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。1.3.2亞油酸氧化處理參考JIANG等9的方法建立氧化體系。將MP重懸在磷酸鹽緩沖液(pH6.0、0.6mol/

7、LNaCl)中，調(diào)節(jié)MP質(zhì)量濃度為10mg/mL。在MP重懸液中加入3750unit/mL脂肪氧合酶和不同質(zhì)量的亞油酸，其終濃度為0(對(duì)照組)、2、5、10、15、20mmol/L。將樣品置于4、黑暗、密封環(huán)境中孵育24h后，加入丁基羥基甲苯終止反應(yīng)，3500g、4離心10min，所得沉淀用磷酸鹽緩沖液(pH6.0)洗滌2次，除去多余的丁基羥基甲苯和亞油酸。1.3.3保水性測(cè)定參考PENG等15的方法并稍作修改。將MP置于離心管中，80干燥12h。保水性計(jì)算如公式(1)所示：保水性/(g水g-1蛋白(1)式中：W0，離心管質(zhì)量，g；W1，干燥前離心管與MP沉淀質(zhì)量，g；W2，干燥后離心管與MP

8、沉淀質(zhì)量，g。1.3.4Zeta電位測(cè)定參考CAI等16的方法并稍作修改。將MP溶液(1mg/mL)注入Zeta電位皿中，散射角調(diào)節(jié)為90，平衡時(shí)間60s，在25下進(jìn)行測(cè)試。1.3.5氨基酸分析參考ZHANG等4的方法并稍作修改。稱取20mg凍干MP于帶蓋消化玻璃管中，加入5mL6mol/LHCl混勻，110水解24h。冷卻后，用氮?dú)鈱⑺猱a(chǎn)物吹干。隨后用0.02mol/LHCl定容至50mL。取少量溶液離心后，用0.22m濾膜過(guò)濾。用自動(dòng)氨基酸分析儀測(cè)試過(guò)濾后的溶液。1.3.6羰基含量測(cè)定參考LEVINE等17的方法評(píng)估羰基含量。將MP溶液質(zhì)量濃度稀釋至5mg/mL。取2份等量MP溶液(0.

9、8mL)于5mL的離心管中。其中一份用1600L的2mol/LHCl(含有2g/L的2,4-二硝基苯肼)處理，記為處理組；另一份用1600L的2mol/LHCl處理，記為空白組。在室溫下反應(yīng)30min后，加入800L的三氯乙酸(400g/L)沉淀蛋白質(zhì)。隨后離心處理(5000g，5min，4)，棄清液。加入2mL乙醇-乙酸乙酯混合液(體積比11)沉淀用2，4-二硝基苯肼進(jìn)行洗滌，5000g離心5min除去不溶物質(zhì)。隨后用乙醇-乙酸乙酯洗滌3次。所得沉淀用3mL磷酸鹽緩沖液(pH6.5、6mol/L鹽酸胍)溶解，37孵育30min后，測(cè)量溶液在370nm處的吸光度，羰基含量計(jì)算如公式(2)所示：

10、羰基含量(2)1.3.7總巰基含量測(cè)定根據(jù)WANG等18的方法評(píng)估總巰基含量。取1mL5mg/mLMP溶液用9mL磷酸鹽緩沖液(50mmol/L、pH7.0、0.6mol/LNaCl、10mmol/LEDTA-2Na和8mol/L尿素)稀釋。取3mL稀釋液與400L1mmol/L2-硝基苯甲酸溶液混合，40孵育30min后，測(cè)量溶液在412nm處的吸光度。通過(guò)摩爾消光系數(shù)13600mol/(Lcm)計(jì)算總巰基的含量。1.3.8表面疏水性測(cè)定參考CHELH等19的方法并稍作修改。用蒸餾水配制1mg/mL的溴酚藍(lán)溶液。將MP溶液稀釋至5mg/mL。分別取1mL的稀釋液、1mL磷酸鹽緩沖液(對(duì)照組)

11、與200L的溴酚藍(lán)混勻，充分振蕩，25的條件下反應(yīng)10min，離心(2000g，15min，4)。取0.4mL上清液，加入3.6mL磷酸鹽緩沖液(40mmol/L，pH6.8)稀釋，在595nm處測(cè)定吸光度。表面疏水性以溴酚藍(lán)的結(jié)合量表示，計(jì)算如公式(3)所示：溴酚藍(lán)(3)1.3.9傅里葉紅外光譜分析參考ZHOU等20的方法并稍作修改。準(zhǔn)確稱取1mgMP凍干粉末，與100mgKBr標(biāo)準(zhǔn)品混合研磨，壓片后在4004000cm-1進(jìn)行全波段掃描，掃描次數(shù)累加64次。1.3.10色氨酸內(nèi)源熒光分析參考CAO等21的方法并稍作修改。將MP質(zhì)量濃度調(diào)節(jié)至1mg/mL。用熒光分光光度計(jì)在300400nm的

12、光譜范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，激發(fā)波長(zhǎng)為295nm，掃描速度為1500nm/min，激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均為5nm。1.3.11十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodiumdodecylsulfatepolyacrylamidegelelectrophoresis，SDS)分析參考JIANG等9的方法并稍作修改。將MP質(zhì)量濃度調(diào)節(jié)至2mg/mL。加入3倍體積的buffer溶液(未還原狀態(tài)不添加-巰基乙醇)制備電泳樣品，使用時(shí)取上清液進(jìn)行電泳操作。電泳完成后，將凝膠染色30min，隨后用脫色液脫色40min。分子質(zhì)量由蛋白質(zhì)標(biāo)記物測(cè)定(10180kDa)。1.3.12數(shù)據(jù)處理本研究中每個(gè)處理均進(jìn)行3次平行

13、試驗(yàn)。用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件(19.0版本，美國(guó)SPSS公司)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，采用單因素方差分析法進(jìn)行顯著性差異檢驗(yàn)(P0.05表示差異顯著)。通過(guò)PeakFit4.12分析紅外光譜，用Origin8.5進(jìn)行數(shù)據(jù)繪圖。2結(jié)果與分析2.1保水性及電荷分析2.1.1保水性保水性主要取決于MP的結(jié)構(gòu)性質(zhì)與分子間相互作用力。由圖1可知，MP保水性隨著氧化強(qiáng)度的增加而顯著上升(P0.05)。當(dāng)亞油酸濃度為5mmol/L時(shí)，MP保水性約為對(duì)照組(0mmol/L)的2倍。這可能是由于低強(qiáng)度氧化時(shí)，凈負(fù)電荷增加(圖2)導(dǎo)致保水性增加。隨著氧化強(qiáng)度的進(jìn)一步提高，MP保水性顯著下降(P0.05)，且均低于對(duì)照組。這與B

14、AO等3對(duì)豬肉MP保水性的研究結(jié)果一致。LIU22的研究指出,高度氧化修飾引起的蛋白質(zhì)交聯(lián)和聚集可能是降低保水性的一個(gè)重要因素。圖1不同濃度亞油酸氧化體系對(duì)MP保水性的影響Fig.1TheeffectofdifferentconcentrationsoflinoleicacidoxidationsystemonMPwater-holding注：不同字母表示差異顯著(P0.05)(下同)2.1.2Zeta電位Zeta電位值可以監(jiān)測(cè)蛋白質(zhì)物理和化學(xué)狀態(tài)的細(xì)微變化，是直觀表現(xiàn)蛋白凈負(fù)電荷變化情況的重要指標(biāo)23。由圖2可知，電位絕對(duì)值整體呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)，亞油酸濃度較低時(shí)(10mmol/L)，

15、MP的凈負(fù)電荷增加(P0.05)，說(shuō)明低強(qiáng)度的氧化使MP溶液體系變得穩(wěn)定，這與張海璐等24的研究結(jié)果相同。BAO等3的研究指出,輕度氧化修飾使蛋白質(zhì)凈負(fù)電荷增加，改善交聯(lián)和靜電相互作用，從而提高保水性。亞油酸濃度較高時(shí)(10mmol/L)，電位絕對(duì)值顯著降低(P0.05)，這可能是因?yàn)檠趸瘡?qiáng)度過(guò)高，使得MP劇烈氧化而發(fā)生蛋白間的聚集和包埋，導(dǎo)致凈負(fù)電荷下降16。圖2不同濃度亞油酸氧化體系對(duì)MPZeta電位值的影響Fig.2TheeffectofdifferentconcentrationsoflinoleicacidoxidationsystemonMPZetapotential2.1.3氨基

16、酸分析氧化處理后MP總氨基酸含量明顯少于對(duì)照樣品(表1)。含硫氨基酸(半胱氨酸和蛋氨酸)和脯氨酸對(duì)ROS非常敏感25，因此，這3種氨基酸含量大幅度下降。同時(shí)，脂質(zhì)過(guò)氧化分解產(chǎn)物與賴氨酸共價(jià)結(jié)合26，導(dǎo)致賴氨酸含量顯著降低。與對(duì)照組相比，高亞油酸濃度(20mmol/L)氧化導(dǎo)致組氨酸減少了17%(P0.05)。通常，組氨酸殘基以質(zhì)子化形式存在，帶有正電荷，且其氧化是羰基形成的原因27(圖3)。組氨酸含量降低使MP失去正電荷，導(dǎo)致肌球蛋白和肌動(dòng)蛋白絲的凈負(fù)電荷增加。此外，肽鏈斷裂后的碎片可能會(huì)對(duì)MP產(chǎn)生額外的電荷28。一般認(rèn)為，凈負(fù)電荷增加可以提高肉的保水性6。表1不同濃度的亞油酸氧化體系對(duì)MP氨

17、基酸含量的影響單位：mg/gTable1EffectofdifferentconcentrationlinoleicacidoxidationsystemontheaminoacidcontentofMP注：同行字母不同小寫字母表示差異顯著(P0.05)2.2蛋白質(zhì)氧化分析2.2.1羰基和巰基蛋白質(zhì)羰基化可以由多種途徑引發(fā)并且涉及某些氨基酸殘基的損失。通常，這些氨基酸以正電荷形式存在，損失后會(huì)增加蛋白質(zhì)的凈負(fù)電荷，從而預(yù)估蛋白質(zhì)凈電荷改變29-30。由圖3可知，隨著亞油酸濃度的增大，羰基含量由0.44nmol/mg增加到2.09nmol/mg，呈現(xiàn)連續(xù)上升趨勢(shì)(P0.05)，這一結(jié)果與JIAN

18、G等9報(bào)道的牛肉MP中羰基含量一致。UTRERA等30研究發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)羰基化與許多功能性指標(biāo)(溶解度、保水性、起泡性等)相關(guān)，可質(zhì)子化氨基酸的損失會(huì)改變MP電荷分布和整體電子排列，引起MP分子間相互作用發(fā)生變化，從而影響蛋白質(zhì)的保水性。MP中的半胱氨酸巰基在氧化體系中非常敏感，易提取氫原子生成硫中心自由基，從而導(dǎo)致巰基含量降低12。由圖3可知，與未氧化(0mmol/L)MP相比，氧化后MP巰基含量顯著降低(P0.05)，該值接近于ZHOU等31報(bào)道的豬肉氧化過(guò)程中MP巰基含量。氧化程度越高，被氧化成二硫鍵的巰基越多，測(cè)得的總巰基含量就越少。圖3不同濃度亞油酸氧化對(duì)MP羰基和巰基含量的影響Fig.

19、3EffectofdifferentconcentrationlinoleicacidoxidationonthecarbonylandtotalsulfhydrylcontentofMP2.2.2表面疏水性蛋白質(zhì)表面疏水性是影響蛋白基團(tuán)表面正負(fù)電荷數(shù)量和排列方式變化并表征蛋白水合效應(yīng)和變性程度的重要指標(biāo)32。由圖4可知，隨著亞油酸濃度的增加(010mmol/L)，MP表面疏水性逐漸增加(P0.05)，這一結(jié)果反映出疏水基團(tuán)的暴露有助于增強(qiáng)表面疏水性，從而導(dǎo)致MP構(gòu)象變化。較高亞油酸濃度(10mmol/L)下，MP的表面疏水性降低，這是由于MP之間形成高分子聚集體，部分屏蔽了蛋白解折疊的影響，

20、或破壞了一些非極性氨基酸7。這與Zeta電位絕對(duì)值的變化趨勢(shì)一致。SUN等32的研究表明，MP輕微氧化暴露疏水基團(tuán)，并誘導(dǎo)電離基團(tuán)數(shù)量增加，從而導(dǎo)致凈負(fù)電荷增加，改善保水性。圖4不同濃度亞油酸氧化對(duì)MP表面疏水性的影響Fig.4InfluenceofdifferentconcentrationlinoleicacidoxidationonsurfacehydrophobicityofMP2.2.3二級(jí)結(jié)構(gòu)分析(傅里葉紅外光譜)亞油酸濃度的增加沒(méi)有導(dǎo)致紅外譜線發(fā)生明顯的偏移和變化，趨勢(shì)基本保持一致。由圖5分析可知，酰胺I帶(16001700cm-1)中呈現(xiàn)的二級(jí)結(jié)構(gòu)含量變化非常明顯。與對(duì)照相比，

21、隨著氧化劑的增加，-螺旋和-折疊含量呈現(xiàn)降低趨勢(shì)，這意味著MP結(jié)構(gòu)更加松散20；而無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)顯著增加，-轉(zhuǎn)角含量呈現(xiàn)先少量增加后降低趨勢(shì)。結(jié)果表明,氧化使得羊肉MP的螺旋、折疊之間相互轉(zhuǎn)化，且是有序向無(wú)序的轉(zhuǎn)變。這是因?yàn)?螺旋主要由肽鏈內(nèi)的氫鍵穩(wěn)定，-折疊主要由肽鏈間的氫鍵穩(wěn)定33。隨著氧化程度的增加，MP膨脹，分子內(nèi)氫鍵減少34，導(dǎo)致-螺旋的破壞和通過(guò)肽鏈間氫鍵穩(wěn)定的-折疊的形成，繼而使-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)在蛋白發(fā)生解折疊后形成。本試驗(yàn)結(jié)果與SUN等32報(bào)道的氧化豬肉MP中，-螺旋變化趨勢(shì)一致。圖5不同濃度的亞油酸氧化對(duì)MP二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響Fig.5Theeffectofdifferen

22、tconcentrationsoflinoleicacidoxidationonthesecondarystructureofMP2.2.4內(nèi)源熒光強(qiáng)度蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化可以通過(guò)內(nèi)源熒光強(qiáng)度反映。由圖6可知，當(dāng)在295nm激發(fā)波長(zhǎng)時(shí)，MP的色氨酸最大熒光發(fā)射波長(zhǎng)(max)接近335nm。隨著亞油酸濃度的增加，熒光強(qiáng)度逐漸下降。這與GAN等35的研究結(jié)果類似。色氨酸熒光的損失可能是由于色氨酸殘基被破壞或蛋白質(zhì)的展開(kāi)將色氨酸暴露在親水性的環(huán)境中，因而導(dǎo)致熒光的淬滅36。上述結(jié)果與酪氨酸含量的變化趨勢(shì)一致(表1)。因此，亞油酸氧化會(huì)降低色氨酸熒光強(qiáng)度，色氨酸殘基暴露于更親水的環(huán)境，從而導(dǎo)致MP構(gòu)象變化

23、。圖6不同濃度的亞油酸氧化對(duì)MP熒光強(qiáng)度的影響Fig.6TheeffectofdifferentconcentrationsoflinoleicacidoxidationonthefluorescenceintensityofMP2.2.5SDSSDS能夠直觀地反映蛋白亞基間發(fā)生的聚集、斷裂或降解等情況。在不含有-巰基乙醇的情況下(非還原條件，圖7-A)，MP肌球蛋白重鏈(myosinheavychain，MHC)和肌動(dòng)蛋白(actin)條帶濃度隨著亞油酸濃度的增加逐漸變淺，同時(shí)濃縮膠頂端條帶變深，這說(shuō)明氧化促進(jìn)MHC和actin間的交聯(lián)和聚集，使得MP分子質(zhì)量過(guò)大而不能進(jìn)入濃縮膠。在含有-巰基乙醇的情況下(還原條件，圖7-B)，大部分消失的MP組分逐漸復(fù)原，表明MP聚合物通過(guò)二硫鍵促進(jìn)蛋白質(zhì)交聯(lián)。該結(jié)果與總巰基含量變化趨勢(shì)相一致。然而，圖7-B仍然可以觀察到濃縮膠頂端有聚合物堆積，這表明非蛋白質(zhì)二硫鍵也參與了蛋白質(zhì)交聯(lián)。一方面，脂質(zhì)氧化可通過(guò)多種途徑引起蛋白