總的提取電泳鑒定及詳解演示文稿

1、總的提取電泳鑒定及詳解演示文稿第一頁，共二十七頁。（優(yōu)選）總的提取電泳鑒定及第二頁，共二十七頁。實(shí)驗(yàn)一. 提取小鼠肝臟組織的RNA第三頁，共二十七頁。一、真核細(xì)胞的總RNA 1、mRNA: 1-5% 5鳥嘌呤7位甲基化CH3修飾。 1）免受核酸酶破壞， 2）起始、促進(jìn)蛋白質(zhì)合成。 3poly(A)尾巴結(jié)構(gòu) 20-200個(gè)A. 翻譯所必需。 起始密碼：AUG 終止密碼：UAA,UAG,UGA。 2、tRNA: 10-15% 3、rRNA: 80-85% 大亞基60S: 28S=4718nt 5S=120nt 5.8S=160nt 小亞基40S: 18S=1874nt第四頁，共二十七頁。二、RNA

2、提取的注意事項(xiàng) RNA酶：廣泛存在：灰塵、人體唾液、實(shí)驗(yàn)器材表面。 生物活性非常穩(wěn)定：耐熱、耐酸、耐堿。 1、 盡量避免外源性RNase 污染 A. 操作環(huán)境空氣潔凈。帶手套、口罩。 B. 用新開封的化學(xué)試劑。（試劑應(yīng)該專用） C. 一次性塑料器材最好是新開封， (DEPC水處理后）高壓滅菌。 D. 玻璃器材、水都應(yīng)該經(jīng)過去RNase 處理。 對(duì)玻璃器材還應(yīng)該進(jìn)行高溫烘烤。 2、抑制內(nèi)源性RNase 活性： RNase 抑制劑。 RNA分離的關(guān)鍵因素：避免RNA酶的污染。第五頁，共二十七頁。1)發(fā)放口罩，帽子，每個(gè)組來一個(gè)人領(lǐng)取。 將1 mL Trizol 試劑移入Eppendorf管中。2)

3、實(shí)驗(yàn)教師操作: 取新鮮小鼠肝臟組織，組織塊不宜過大, 放在玻片上立即研磨,研磨要徹底。 3)將研磨后的組織(小米粒大小)轉(zhuǎn)移至1 mL Trizol 試劑中，蓋緊蓋，上下顛倒混合2 min以上。使組織細(xì)胞充分裂解。肉眼觀察可見液體變成均勻渾濁狀。 4)室溫孵育10 min。三、RNA提取的實(shí)驗(yàn)操作 播放有聲課件1: RNA提取方法及注意事項(xiàng)第六頁，共二十七頁。1、異硫氰酸胍法： GuSCN 是一種強(qiáng)的蛋白質(zhì)變性劑，能夠裂解細(xì)胞的同時(shí)，還能有效地抑制內(nèi)源性 Rnase的活性，通過有機(jī)溶劑的分步抽提，可獲得純度較高的細(xì)胞總RNA。 特點(diǎn)：需低溫操作，但價(jià)格經(jīng)濟(jì)。2、Trizol 試劑（商品化產(chǎn)品）

4、 特點(diǎn)：在室溫下可以提取細(xì)胞總RNA， 簡(jiǎn)單、快速、提取量大、純度高。3、mRNA提取試劑盒 真核細(xì)胞mRNA的3末端有ploy(A)尾，利用寡聚 dT纖維素結(jié)合mRNA，將其從細(xì)胞總RNA中分離出來。RNA提取的幾種方法室溫孵育10 min介紹第七頁，共二十七頁。RNase抑制劑1、DEPC ( 二乙基焦炭酸鹽) 最常用的RNase抑制劑: 與蛋白質(zhì)中的組氨酸結(jié)合， 使蛋白質(zhì)變性。 有效濃度：0.05%-0.1%(DEPC水)，室溫磁力攪拌20分鐘。用于浸泡各種器材。滅活條件：高壓。 在Tris溶液中半衰期為1.25min。 試劑的配制:無RNase的溶液(用DEPC水配制, 高壓) 儲(chǔ)存方

5、法：不能用聚苯乙烯器皿。4 C ，或液氮中。2、肝素： 使用濃度：0.110mg/ml 效 果: 37 C 時(shí)，可抑制95%的RNase 活力。 如果與DEPC聯(lián)合應(yīng)用， 具有極強(qiáng)的抑制效果。第八頁，共二十七頁。5)加入200 l氯仿，震蕩混勻20-30 s，室溫放置5 min （此期間液體開始分層，不要輕易攪動(dòng)液體）。6)10000 rpm， 離心 5 minRNA (清澈透明)DNAProtein7)將清澈透明的上層水相 轉(zhuǎn)移至另一離心管中。有聲課件2: RNA干燥及溶解技巧第九頁，共二十七頁。8) 沉淀RNA： 加0.5 ml異丙醇，上下顛倒混勻，室溫10 min。 10, 000rpm

6、，4C，離心10 min棄上清。) 加1ml 75%乙醇洗滌管壁。 (注意貼管壁在沉淀的對(duì)側(cè)緩慢加入，不要攪動(dòng)沉淀)10) 7500rpm，4C 離心 1 min，棄上清 再離心幾秒鐘， 將管壁液體（用加樣器）完全移凈。用TriZol試劑提取總RNA時(shí)，全程均在室溫進(jìn)行。當(dāng)RNA沉淀用水溶解后，應(yīng)該注意在冰上操作，操作要迅速。第十頁，共二十七頁。11)室溫干燥35 min （根據(jù)RNA沉淀大小決定，干燥后的沉淀應(yīng)該是無色膠樣透明狀，避免過分干燥,此步驟非常關(guān)鍵。）注意事項(xiàng)：RNA:避免放在37 C孵箱中過度干燥以防無法溶解。RNA沉淀必須絕對(duì)干燥，微量乙醇?xì)埩?，容易造成RT的失敗，但過分干燥又

7、是造成RNA不溶解的主要原因 。判斷RNA沉淀是否充分干燥但又不是過分干燥是逆轉(zhuǎn)錄成功的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。RNA pellet：透明膠樣干燥后應(yīng)該無色透明第十一頁，共二十七頁。12） RNA的溶解：用加樣器吸取冰冷DEPC-H2O 13.5 l，加到RNA上，進(jìn)行吹打溶解RNA 沉淀。溶解的RNA應(yīng)置冰上保存。13) 吸出 4.5 l溶液放到冰上備用(將用于電泳).14) 剩余 9 l溶液,放到冰上備用（將用于RTPCR）.注意： RNA沉淀的溶解一定要耐心充分，一定要用加樣器反復(fù)多次吹打方可。但由于溶液體積非常小，要避免出現(xiàn)氣泡影響RNA的溶解。避免氣泡的方法：用加樣器的第一擋每次吹打都不要打出氣體

8、判斷溶解程度：吹打時(shí)液體流動(dòng)不拐彎為止。第十二頁，共二十七頁。實(shí)驗(yàn)二. RNA 的瓊脂糖凝膠電泳第十三頁，共二十七頁。 基本過程同DNA電泳一樣，但應(yīng)明確一點(diǎn)的是，因?yàn)镽NA分子對(duì)RNA酶的作用非常敏感，因此必須用對(duì)RNA酶有抑制作用DEPC水來配置所有溶液，所有與RNA接觸的儀器和裝置都要嚴(yán)格處理以盡量減少RNA酶對(duì)樣品的降解RNA 的瓊脂糖凝膠電泳第十四頁，共二十七頁。 RNA樣品： 4.5 l 上樣緩沖液： 1 l 混勻后， 5.5 l 直接電泳上樣（100伏，1030分鐘） 上樣前預(yù)電泳5min。 注意: 電泳槽的清潔！所有試劑、器材、溶液需要滅RNA酶處理。 瓊脂糖凝膠要新鮮配制！

9、紫外透射儀觀察電泳結(jié)果RNA的電泳上樣：第十五頁，共二十七頁。 RNA電泳結(jié)果 rRNA可以作為內(nèi)部Marker分子，通過觀察rRNA的兩條帶（28S和18S）的比例，可以判斷所提取mRNA是否存在降解。 RNA電泳并不能判斷mRNA是否提取成功，也不作為鑒定RNA提取質(zhì)量的常規(guī)方法，因?yàn)樵陔娪具^程中RNA可能發(fā)生降解。第十六頁，共二十七頁。 分析本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果：28S、 18S和5S的比例。RNA電泳結(jié)果分析第十七頁，共二十七頁。實(shí)驗(yàn)三：逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)及PCR（RT-PCR)第十八頁，共二十七頁。逆轉(zhuǎn)錄酶： 存在于逆轉(zhuǎn)錄病毒體內(nèi)。 常見有哺乳動(dòng)物型37oC，禽類型42oC 。 以mRNA為模板的D

10、NA聚合酶，形成與RNA堿基相互補(bǔ)DNA鏈，后者稱為互補(bǔ)DNAcDNA。 RNAaseH的活性：切掉DNA和RNA雜合鏈上的RNA。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)原理AAAAAA(n)mRNAAAAAAA(n)3-TTTTTT(18)-568-70oC, annealingAAAAAA(n)3-TTTTTT(18)-537-42oC, RTase mRNAmRNAcDNA10min1-2h 逆轉(zhuǎn)錄有聲課件3: RT 的原理和注意事項(xiàng)第十九頁，共二十七頁。 總RNA 9 l Oligo dT (0.05g/ml) 1 l (終：2.5 ng/ml) 輕彈管底混合， 置65水浴10min， 立即冰浴2min（防止RN

11、A形成二級(jí)結(jié)構(gòu)）。第一步：打開RNA鏈之間的二級(jí)結(jié)構(gòu)，使Oligo dT 特異性地結(jié)合到 PolyA 尾。第二十頁，共二十七頁。 5RT-buffer 4 l RNasin (RNA酶抑制劑，40U/ml) 1 l dNTPs (10mmol/L) 4 l AMV （逆轉(zhuǎn)錄酶） 1 l 輕彈管底混合。置42 oC 水浴1h。第二步：向上述反應(yīng)溶液中依次加入下列試劑第三步：將上述反應(yīng)移至68 oC水浴10min以滅活 RTase，并冰浴，保存?zhèn)溆玫诙豁摚捕唔?。?休第二十二頁，共二十七頁。 PCR反應(yīng)體系的建立 PCR 反應(yīng)的進(jìn)行 PCR產(chǎn)物的電泳 結(jié)果觀察與分析 PCR產(chǎn)物回收實(shí)驗(yàn)操

12、作內(nèi)容 有聲課件（1）： PCR的基本原理及反應(yīng)體系的組成PCR反應(yīng)動(dòng)畫目的基因片斷的體外擴(kuò)增（2）：PCR 反應(yīng)條件的確定及PCR常見問題的解決方案第二十三頁，共二十七頁。1）模板DNA (上次課逆轉(zhuǎn)錄的cDNA） 4 l2）加入下列試劑,，順序可以改變 10X PCR buffer (含MgCl2 ) 5 l dNTPs (10mM) 1 l 3 引物 (10mol/L) 1 l 5 引物 (10mol/L) 1 l 3）加去離子水 ，補(bǔ)足50l最終反應(yīng)體系4）Taq DNA 聚合酶(2U/l) 1 l實(shí)驗(yàn)操作一、建立 PCR 反應(yīng)體系3. 輕彈管底混勻，然后放入離心機(jī)的套管內(nèi)，用離心機(jī)甩一下；4. 將PCR小管交給老師，老師統(tǒng)一將樣品放入PCR儀。取 1 支200 l 微量離心管（在第一組同學(xué)的實(shí)驗(yàn)臺(tái)上方的平皿里）中，用 Marker 筆 在管的側(cè)面 標(biāo)記；2. 依次加入下列試劑：第二十四頁，共二十七頁。注意：（1） PCR相關(guān)試劑均放在每排實(shí)驗(yàn)臺(tái)上方中間位置處的藍(lán)色 圓盒中 （2）加樣的體積要準(zhǔn)確，1 l 的體積不應(yīng)該超過白色槍頭的第一個(gè)格。 第二十五頁，共二十七頁。實(shí)驗(yàn)操作二、 PCR 反應(yīng)的進(jìn)行1、將樣品放入 PCR 儀中2. PCR反應(yīng)條件 94 30 S DNA變性 (Denaturation) 5