基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討川芎嗪對(duì)急性壞死性胰腺炎大鼠胰腺組織的保護(hù)機(jī)制

1、基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討川芎嗪對(duì)急性壞死性胰腺炎大鼠胰腺組織的保護(hù)機(jī)制川芎嗪（tetramethylpyrazine）是從傳統(tǒng)中草藥川芎中分離得到的化合物，具有血管生成和血管保護(hù)作用以及抗炎、抗氧化等功能，臨床上被長期用于治療心腦血管疾病和炎癥性疾病。近來發(fā)現(xiàn)川芎嗪可以改善AP引起的胰腺和腸道損傷，通過抑制NF-B的活化，阻斷炎癥因子釋放和增加細(xì)胞凋亡來減輕AP的嚴(yán)重程度，具有治療AP的潛能，但確切機(jī)制尚未明確。本研究借助于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選出川芎嗪治療急性壞死性胰腺炎（acute necrotizing pancreatitis, ANP）的靶點(diǎn)，進(jìn)行功能富集分析和通路富集分析，探討川芎嗪治療ANP的

2、核心靶點(diǎn)及其潛在的分子機(jī)制，并進(jìn)一步在ANP大鼠模型上進(jìn)行初步驗(yàn)證，以期為川芎嗪的基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用提供新的思路。材料與方法一、川芎嗪作用靶點(diǎn)的獲取利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺(tái)（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform, TCMSP），以“2,3,5,6-tetramethylpyrazine”為關(guān)鍵詞檢索川芎嗪的作用靶點(diǎn)，下載其mol2 格式并上傳到PharmMapper網(wǎng)站。靶點(diǎn)種類設(shè)定為Human Protein Targets Only (v2010, 2241)。利用

3、Uniprot數(shù)據(jù)庫對(duì)獲得的靶點(diǎn)進(jìn)行篩選，物種限定為“homosapiens”。二、ANP相關(guān)靶點(diǎn)的獲取通過人類疾病信息相關(guān)數(shù)據(jù)庫CTD（Comparative Toxicogenomics Database）、DisGeNET、GeneCards（The Human Gene Database)、OMIM（Online Mendelian Inheritance in Man），以“pancreatitis, acute necrotizing”為檢索詞對(duì)ANP相關(guān)基因進(jìn)行檢索篩查并整合，剔除重復(fù)項(xiàng)，獲得ANP相關(guān)的候選靶點(diǎn)。三、川芎嗪和ANP交集靶點(diǎn)蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及關(guān)鍵靶點(diǎn)篩選將

4、川芎嗪的作用靶點(diǎn)與ANP的候選靶點(diǎn)上傳至在線韋恩圖，得到川芎嗪和ANP的交集基因。將交集基因?qū)隨TRING(Search Tool for Retrieval of Interaction Genes)數(shù)據(jù)庫以構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(proteinprotein interaction networks, PPI)網(wǎng)絡(luò)，將構(gòu)建的PPI網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件，應(yīng)用Network Analyzer插件進(jìn)一步分析、調(diào)整后作圖，并利用cytoHubba插件篩選PPI的關(guān)鍵靶點(diǎn)。四、功能富集分析利用R語言（4.0.3）clusterProfiler包（3.16.1）進(jìn)行基因本體

5、（gene ontology, GO）功能富集分析和京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG）通路富集分析。參數(shù)選擇pvalueCutoff=0.05，pAdjustMethod=“BH”，qvalueCutoff=0.05。GO功能富集分析包括3個(gè)不同的水平：生物學(xué)過程，細(xì)胞組成和分子功能，根據(jù)P值從小到大選擇前10位。五、川芎嗪與ANP關(guān)鍵靶點(diǎn)分子對(duì)接將已知的關(guān)鍵靶點(diǎn)與川芎嗪進(jìn)行分子對(duì)接，得到對(duì)接親和力，反映其穩(wěn)定性。從蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫（Protein Data Bank, PDB）下載核心蛋白分子結(jié)構(gòu)，從TCMS

6、P下載川芎嗪的結(jié)構(gòu)，將蛋白和川芎嗪結(jié)構(gòu)導(dǎo)入PyMol 2.5.2和Auto Dock Tools 1.5.6軟件進(jìn)行分子對(duì)接及可視化處理。六、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組30只250350 g相同遺傳背景的SPF級(jí)雄性SD大鼠均購自上海斯拉克公司，動(dòng)物合格證號(hào)為SCXK（滬）20170005，按照數(shù)字表法隨機(jī)分為對(duì)照組、ANP組和川芎嗪治療組（川芎嗪組），每組10只。采用胰膽管逆行注射4%?；悄懰徕c1 ml/kg的方法建立ANP大鼠模型。川芎嗪組在制模后5 min內(nèi)經(jīng)腹腔注射川芎嗪注射液10 ml/kg。注射用鹽酸川芎嗪購自平光制藥股份有限公司，溶于100 ml 0.9%生理鹽水，藥物濃度為0.6%。對(duì)照組

7、僅經(jīng)尾靜脈注射等容積PBS。七、胰腺組織病理學(xué)檢查及關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白表達(dá)檢測(cè)大鼠于制模后12 h處死，取胰腺組織，常規(guī)固定，石蠟包埋，切片、蘇木精-伊紅染色，顯微鏡下觀察胰腺組織的病理學(xué)改變。應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)胰腺組織表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor, EGFR）、胱天蛋白酶3（caspase 3, CASP3）、絲裂原活化蛋白激酶1（mitogen-activated protein kinase 1, MAPK1）、B細(xì)胞淋巴瘤樣蛋白1（B-cell lymphoma-2-like protein 1, BCL2L1/Bcl-XL）蛋白的

8、表達(dá)?？笶GFR抗體（ab52894）、CASP3抗體（ab184787）、MAPK1抗體（ab109282）和BCL2L1抗體（ab32370）均購自英國ABCAM公司，二抗（PV-6001）購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)獲取染色結(jié)果的光密度值。八、血清生物化學(xué)指標(biāo)檢測(cè)大鼠處死前眼眶取血，2 000 r/min離心(離心半徑9.856 cm)收集血清，80保存。采用ELISA法檢測(cè)血清白介素-6（interleukin-6, IL-6）和腫瘤壞死因子-（tumor necrosis factor-,TNF-）水平。IL-6、TNF-試劑盒均

9、購自上海江萊生物公司，按試劑盒說明書操作。九、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS 26.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。正態(tài)分布的計(jì)量資料以xs表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD和SNK檢驗(yàn)。P0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié) 果一、川芎嗪和ANP的相關(guān)靶點(diǎn)通過TCMSP、PharmMapper數(shù)據(jù)庫最終得到川芎嗪的潛在靶點(diǎn)共142個(gè)，將靶點(diǎn)名稱上傳到Uniprot數(shù)據(jù)庫，校正靶點(diǎn)名稱并剔除重復(fù)基因，最終得到137個(gè)靶點(diǎn)。從CTD、DisGeNET、GeneCards和OMIM數(shù)據(jù)庫分別篩選出ANP相關(guān)基因24 575、62、1 876和150個(gè)，合計(jì)26 663個(gè)；剔除其中關(guān)聯(lián)得分較小的基因，分

10、別篩選出202、62、234和69個(gè)相關(guān)度得分較高的基因，經(jīng)合并剔除重復(fù)基因后得到513個(gè)高分靶點(diǎn)。二、川芎嗪和ANP交集靶點(diǎn)基因及PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建將川芎嗪潛在靶點(diǎn)信息與ANP高分靶點(diǎn)信息取交集，選擇同時(shí)存在于川芎嗪潛在靶點(diǎn)信息與ANP高分靶點(diǎn)信息中的靶點(diǎn)基因，得到川芎嗪中與ANP發(fā)病機(jī)制相關(guān)的25個(gè)作用靶點(diǎn)基因（圖1）。通過STRING數(shù)據(jù)庫構(gòu)建了川芎嗪和ANP交集的25個(gè)作用靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)其中5個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)有相互作用，分別為白蛋白（ALB）、EGFR、CASP3、MAPK1和BCL2L1，節(jié)點(diǎn)度（degree)值分別為21、18、16、15、14。三、GO功能富集分析和KEGG通路富集

11、分析對(duì)25個(gè)共同靶點(diǎn)基因進(jìn)行GO功能分析，結(jié)果顯示，生物學(xué)過程主要涉及生殖結(jié)構(gòu)發(fā)育（GO：0048608）、生殖系統(tǒng)發(fā)育（GO：0061458）、對(duì)抗生素的反應(yīng)（GO：0046677）、細(xì)胞對(duì)化學(xué)應(yīng)激的反應(yīng)（GO：0062197）和對(duì)活性氧的反應(yīng)（GO：0000302）等；細(xì)胞組成主要為囊泡腔（GO：0031983）、膜筏（GO：0045121）、膜微區(qū)（GO：0098857）、分泌顆粒腔（GO：0034774）和細(xì)胞質(zhì)囊泡腔（GO：0060205）等靶蛋白；分子功能主要包括SH2域結(jié)合（GO：0042169）、蛋白酪氨酸激酶活性（GO：0004713）、磷酸酪氨酸殘基結(jié)合（GO：000178

12、4）、蛋白酶結(jié)合（GO：0002020）和核受體活性（GO：0004879）等。對(duì)25個(gè)共同靶點(diǎn)基因行KEGG通路富集分析，結(jié)果顯示，與ANP的發(fā)展和治療相關(guān)的通路主要包括Ras信號(hào)通路（hsa04014）、PI3K-Akt信號(hào)通路（hsa04151）、鉑類藥物耐藥（hsa01524）、磷脂酶D信號(hào)通路（hsa04072）和EGFR酪氨酸激酶抑制劑耐藥（hsa01521），以及慢性粒細(xì)胞白血病、膀胱癌和黑色素瘤等腫瘤信號(hào)通路。四、川芎嗪與ANP關(guān)鍵靶點(diǎn)分子對(duì)接運(yùn)用AutoDockTools以半柔性對(duì)接方法將川芎嗪與上述關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接，得到川芎嗪與ALB、EGFR、CASP3、MAPK1和

13、BCL2L1的結(jié)合能分別為5.06、4.03、3.74、3.82、4.33kcal/mol，平均結(jié)合能為4.20kcal/mol。它們之間分子對(duì)接的詳細(xì)模式見圖2。五、各組大鼠胰腺組織病理學(xué)改變對(duì)照組大鼠無腹水，胰腺形態(tài)正常，鏡下見胰腺小葉結(jié)構(gòu)完整。ANP組大鼠腹腔內(nèi)有大量血性腹水，胰腺、腸系膜周圍可見散在的鈣化斑，胰腺腫脹、周圍滲出明顯，并可見出血壞死灶；鏡下見胰腺腺體結(jié)構(gòu)較紊亂，小葉間隙明顯增大，腺泡、血管周圍以及腺體間隙均可見中性粒細(xì)胞浸潤。川芎嗪組大鼠腹腔內(nèi)少量腹水，胰腺輕中度腫脹伴周圍少量滲出，鏡下見胰腺小葉間隙略微增大，散在中性粒細(xì)胞浸潤（圖3）。六、各組大鼠胰腺組織EGFR、CA

14、SP3、MAPK1和BCL2L1蛋白表達(dá)水平對(duì)照組胰腺組織EGFR、CASP3、MAPK1表達(dá)量分別為0.110.03、0.200.03、0.160.03；ANP組分別為0.310.04、0.430.05、0.330.08；川芎嗪組分別為0.240.05、0.340.06、0.200.05。ANP組較對(duì)照組顯著升高，川芎嗪組較ANP組顯著降低（P值均0.01）；對(duì)照組、ANP組和川芎嗪組胰腺組織BCL2L1表達(dá)量分別為0.190.05、0.280.06和0.430.20，ANP組較對(duì)照組顯著升高，川芎嗪組又較ANP組顯著升高（P值均0.05，圖4）。七、各組大鼠血清IL-6和TNF-水平ANP

15、組大鼠血清IL-6和TNF-水平均較對(duì)照組顯著增高，而川芎嗪組血清IL-6和TNF-水平均較ANP組顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表2）。討 論氣不通是AP的基本病機(jī)，通里攻下應(yīng)貫穿治療的始終，在疏肝解郁、清熱化濕、通腑瀉熱、祛瘀通腑、回陽救逆的基本治療原則下，可采用中藥口服、灌腸、外敷和針刺等內(nèi)外治法相結(jié)合的多途徑治療方案。川芎嗪是從傳統(tǒng)中草藥川芎中分離得到的化合物。本研究共獲得25個(gè)川芎嗪治療ANP的靶點(diǎn)，其中ALB、EGFR、CASP3、MAPK1和BCL2L1為治療的核心靶點(diǎn)。一般認(rèn)為配受體間相互作用的親和力越強(qiáng)，所需的能量就越少，其發(fā)生作用的可能性就越大。本研究分子對(duì)接的平均結(jié)合能為

16、4.20kcal/mol，表明川芎嗪與這些關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白均有較好的結(jié)合活性。同時(shí)，GO功能富集分析顯示，川芎嗪治療ANP的生物學(xué)過程涉及生殖結(jié)構(gòu)及系統(tǒng)發(fā)育、對(duì)抗生素的反應(yīng)、細(xì)胞對(duì)化學(xué)應(yīng)激的反應(yīng)和對(duì)活性氧的反應(yīng)等；KEGG通路富集分析結(jié)果表明，川芎嗪治療ANP的主要通路富集在Ras信號(hào)通路、PI3K-Akt信號(hào)通路、鉑類藥物耐藥、磷脂酶D信號(hào)通路和EGFR酪氨酸激酶抑制劑耐藥等。MAPK1又稱細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶2（extracellular signal-regulated kinase 2, ERK2），作為多種生物化學(xué)信號(hào)的整合點(diǎn)，參與多種細(xì)胞的增殖、分化、轉(zhuǎn)錄調(diào)控和發(fā)育等過程。有研究表明，M

17、APK信號(hào)通路與重癥急性胰腺炎的炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激損傷密切相關(guān)，通過抑制MAPK信號(hào)通路減少腸道炎癥反應(yīng)和菌群失調(diào)，可減輕胰腺組織損傷。本研究結(jié)果顯示，MAPK1蛋白在ANP組大鼠中高表達(dá)，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而川芎嗪組MAPK1表達(dá)則較ANP組顯著降低，血清IL-6和TNF-也顯著降低，說明川芎嗪可以抑制MAPK1的表達(dá)及下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，減少IL-6、TNF-等炎癥因子的釋放，從而減輕ANP后的炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激損傷。EGFR是ErbB受體家族的成員之一，屬于受體酪氨酸激酶類。ErbB受體信號(hào)通過Akt、MAPK以及其他多種通路來調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、遷移、分化和凋亡。在多種類型的惡性腫瘤中

18、，ErbB家族成員及其部分配體通常過表達(dá)、擴(kuò)增或突變，這使其成為重要的治療靶標(biāo)。ANP小鼠存在著EGFR信號(hào)的過度激活，F(xiàn)an等研究也發(fā)現(xiàn)EGFR可能在AP的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮著重要作用，可作為AP診斷和治療的潛在生物標(biāo)志物。EGFR配體細(xì)胞素已被證實(shí)對(duì)AP小鼠有保護(hù)作用，雨蛙素和L-精氨酸不能誘導(dǎo)過表達(dá)細(xì)胞素的轉(zhuǎn)基因小鼠引發(fā)AP。本研究發(fā)現(xiàn)對(duì)照組大鼠EGFR蛋白表達(dá)水平最低，ANP組表達(dá)水平最高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，經(jīng)過川芎嗪干預(yù)后，EGFR表達(dá)水平則較ANP組明顯降低，推測(cè)川芎嗪具有類似細(xì)胞素的作用，能夠促進(jìn)胰腺細(xì)胞新生，在胰腺再生中發(fā)揮一定的作用，對(duì)ANP具有保護(hù)性作用，可作為治療AP的常規(guī)藥物。細(xì)胞凋亡參與AP感染性并發(fā)癥的發(fā)生和進(jìn)展，與ANP多器官功能障礙有關(guān)，因而，控制細(xì)胞凋亡可能是改善ANP臨床預(yù)后的有效策略。CASP3是一種半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶，在細(xì)胞凋亡半胱天冬酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)的執(zhí)行階段起著核心作用，參與細(xì)胞凋亡、細(xì)胞壞死和炎癥的信號(hào)通路。BCL2L1/Bcl-XL則是Bcl-2家族的一種抗凋亡蛋白，是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子之一。Loo等在研究人類多能干細(xì)胞分化為胰腺細(xì)胞的過程中觀察到Bcl-XL的表達(dá)上調(diào)及caspase 3的相應(yīng)下調(diào)，調(diào)節(jié)Bcl-XL的表達(dá)水平可以顯著改善胰腺細(xì)胞的存活率和穩(wěn)定性。本研究發(fā)現(xiàn)ANP組