中大生化與細胞實驗方法

1、細胞生物學實驗方法與技術當前細胞生物學與事業(yè)聯(lián)系的較為緊密的熱點問題主要有以下幾種：1）真核細胞結(jié)構(gòu)及其表達調(diào)控；2）細胞膜、膜系、受體與信號傳遞研究；3）的研究；4) 細胞工程，細胞生長、分化、衰老、，尤其是程序性細胞包括工程及體細胞核移植的研究。一、細胞培養(yǎng)常用方法1、細胞原代培養(yǎng)（primay culture） 又稱初代培養(yǎng)，即直接從機體取下細胞、組織、或、讓他們在體外維持與生長。原代細胞的特點是細胞或組織剛離開機體，他們的生物狀態(tài)尚未發(fā)生很大的改變，一定程度上可反映他們在體內(nèi)的狀態(tài)，來源組織或細胞的特性，因此用于藥物實驗尤其是藥物對細胞活動、結(jié)構(gòu)、代謝、有無毒性或作用等研究是極好工具。

2、常用的原代培養(yǎng)方法有組織快培養(yǎng)法及消化培養(yǎng)法。前者方法簡單，細胞也較易生長，尤其是培養(yǎng)心肌有時能觀察到心肌組織塊的搏動。細胞從組織塊外長并鋪滿培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶后即可進行傳代。2、細胞的傳代培養(yǎng)當細胞生長至單層匯合時，便需要進行分離培養(yǎng)否則會因無繁殖空間、營養(yǎng)耗竭而影響生長，甚至整片細胞脫離基質(zhì)懸浮起來直至。為此當細胞達到一定密度時必須傳代或再次培養(yǎng)，目的是借此繁殖的細胞，另一方面是防止細胞的。二、培養(yǎng)方法培養(yǎng)（an culture）是指用特殊的裝置使、原基或它們的一部分在體外存活，幷保持其原有的結(jié)構(gòu)和功能。培養(yǎng)可模擬體內(nèi)的三維結(jié)構(gòu)，用于觀察組織間的相互反應、組織與細胞的分化以及外界因子包括藥物對

3、組織細胞的作用。培養(yǎng)方法很多，最經(jīng)典的方法即表玻皿培養(yǎng)法；一種最常用的方法是不銹鋼金屬網(wǎng)格法及 Wolff 培養(yǎng)法和擴散盒培養(yǎng)法，實驗者可根據(jù)情況選擇采用。三、放射自顯影術測定放射自顯影術（autoradiography）是利用放射性同位素電離輻射對核子乳膠的感光作用，顯示標本或樣品中放射物的分布、定量以及定位的方法。放射性同位素能在緊密接觸的感光乳膠中下它存在的部位和強度，準確顯示出形態(tài)與功能的定位關系。現(xiàn)已可將放射自顯影術與電鏡以及生物分子結(jié)合起來。不但可以研究放射性物質(zhì)在組織和細胞內(nèi)的分布代謝，而且可以揭示核酸及其損傷等改變，目前已在生命科學各領域被廣泛應用。四、分析技術染色質(zhì)或是遺傳物

4、質(zhì)在細胞水平的形態(tài)特征。前者是指當細胞處于期時遺傳物質(zhì)經(jīng)堿性后，呈現(xiàn)出細絲狀彌漫結(jié)構(gòu)；當細胞進入期時，染色質(zhì)細絲高度螺旋化凝聚為形態(tài)有特征的。特別是在中期，后的達到最高程度的凝聚，稱為中期染色，是進行形態(tài)觀察分析的最佳時分析應用領域越來越廣，主要用于以下幾方面：1）為臨床期。提供新；2）研究不育和發(fā)生的遺傳基礎；3) 通過檢查性的，預防有異?；純撼錾ㄓ扌停?；4）根據(jù)的多肽性進行親子和異型配子的研究；結(jié)合 DNA 重組技術可以將定位于的具體區(qū)帶上。五、電鏡技術早在 1940 年，英國實用價值。1965 年英國大學首先試制成功掃描電子顯微鏡，但因分辨率低無科學儀器開始生產(chǎn)出商品掃描電鏡，其以顯著

5、優(yōu)點廣泛用于生物學、醫(yī)學、物理學、化學、電子學及勘探、冶金、國防、機械與輕工業(yè)等諸多領域，并已成為非常有用的研究工具。電鏡主要特點：1）景深大，較光學顯微鏡大幾百倍；2）圖像富有感，是圖象；3）圖像放大范圍大，光學顯微鏡有效放大一個實感的三維結(jié)構(gòu)倍數(shù)為 1000 倍左右，電鏡的放大倍數(shù)為幾百倍至 100 萬倍，掃描電鏡可放大十幾倍至幾十萬倍；4）分辨率高，掃描電鏡可達 63nm；5）樣品可在三度空間平移和旋轉(zhuǎn)，聚焦后可以任意放大倍數(shù)，而不需調(diào)整重新聚焦。六、細胞、細胞器、及細胞間質(zhì)的分離技術、1、 細胞的分離分離不同的細胞及亞細胞組分在現(xiàn)物學研究中起著重要的作用。如研究某種藥物治療白血病的機理

6、，需要分離培養(yǎng)人或動物的骨髓細胞，觀察藥物的細胞作用；研究與細胞生長分化有關的生長因子的作用，需將與此類因子有關的細胞分離出來；分離細胞膜，線粒體等細胞的亞組分，對于研究信號傳遞，某些遺傳疾病，也都是必不可少段。2、細胞膜的分離細胞內(nèi)的膜系統(tǒng)與細胞質(zhì)膜統(tǒng)稱為生物膜（biomembrane）,他們都有共同結(jié)構(gòu)和特征。首先要分離出形狀完整的、具有生物活性的、高純度的細胞膜，用于研究細胞膜的結(jié)構(gòu)和功能，以利于觀察膜在細胞與環(huán)境進行能量交換及信息傳遞的過程。3、細胞核的分離細胞核作為一個功能，完整的保存遺傳物質(zhì)，幷指導RNA，后者為蛋白質(zhì)及其它細胞組分所必需。因此細胞核分離是研究表達及細胞核形態(tài)結(jié)構(gòu)的

7、首要步驟。不同組織來源的細胞經(jīng)勻漿后，用分級離心或超聲波處理等方法進行純化。4、溶酶體的分離溶酶體是處理細胞吞噬物的細胞器，含有高濃度的各種水解酶類，調(diào)控細胞內(nèi)的消化過程。溶酶體的分離常用于研究因溶酶體功能缺陷而引起的多種疾病。5、線粒體的分離線粒體是細胞呼吸的主要場所，細胞活動所需要的能量，主要由粒體內(nèi)進行氧化所產(chǎn)生的能量供給。線粒體關鍵是保持其完整性及高純度。6、細胞 DNA、RNA 分離與純化核酸是遺傳信息及表達的物質(zhì)基礎。核酸的提取與純化關鍵是保持核酸的完整性，但較，主要因為：一是細胞內(nèi)有活性很高的核糖核酸酶；二是酸堿等化學；三是高溫機械損傷等物理，需嚴格遵守操作規(guī)程。七、細胞凋亡研究

8、方法細胞凋亡(apoptosis),又稱為程序性（programmed cell death,PCD）指的是有核細胞在一定條件下，通過激活其自身機制，尤其是開啟與關閉某些以及內(nèi)源性 DNA 內(nèi)切酶活化，導致產(chǎn)生細胞自然性的過程。可以認為細胞的這種方式是一種生理性的自發(fā)過程。為此有人也稱其為細胞。目前認為程序性幾乎和細胞的增殖同樣重要，如果沒有細胞凋亡，不能形成與存活，或者發(fā)生疾病。只有通過細胞凋亡的發(fā)生，使特定細胞群體在特定的時間和特定的部位。從而使機體在總體上保障其細胞數(shù)量，以及形態(tài)與功能的平衡。近年來如何用藥物誘導癌細胞也成為細胞凋亡的熱點之一。電鏡觀察是研究細胞凋亡的首選方法。八、原位雜

9、交原位雜交技術是將分子雜交與組織化學相結(jié)合，用標記的DNA 或RNA 為探針，在原位檢測組織細胞內(nèi)特異互補的 DNA 或 RNA 序列。它分為三類：DNA-DNA、DNA-RNA、RNA-RNA。已廣泛用于生物學的各個領域。原位 DNA 末端標記可以用于細胞凋亡的定量研究。原位雜交技術和 PCR 技術結(jié)合用于檢測人瘤（HPV）九、單克隆抗體是 1975 年被描述的一種可產(chǎn)生無限量，并可其性質(zhì)的抗體技術。該技術的關鍵步驟在于淋巴細胞之間的融合，所以稱為“淋巴細胞雜交瘤技術”；由于雜交瘤經(jīng)過篩選可產(chǎn)生針對單一抗原決定簇抗體的細胞克隆，故稱為單克隆抗體技術。該技術的問世使得免疫學研究與實踐發(fā)生了性的改觀，同時還為生物學和學的許多領域提供了前所未有的研究工具。人們利用其可精確地識別出極為復雜的分子，測定出無法測定的物質(zhì)，識別出新的細胞群體，揭示了以往未曾了解的細胞分化途徑，為腫瘤、性疾病、自身免疫性疾病等的和治療創(chuàng)造出令人興奮的前景。十、神經(jīng)細胞培養(yǎng)神經(jīng)細胞培養(yǎng)是指從體內(nèi)取出某一種神經(jīng)組織，在無菌、適當溫度和一定營養(yǎng)條件下模擬在體生理環(huán)境，使之存活和生長，幷保持其結(jié)構(gòu)和功能。神經(jīng)細胞培養(yǎng)按培養(yǎng)前切割程度分為培養(yǎng)、組織快培養(yǎng)和細胞分離培養(yǎng)。1、培養(yǎng) （an culture ） 是切割最少型的培養(yǎng)。全或大片放在保溫的營養(yǎng)液中可保存數(shù)日。這類培養(yǎng)切斷了正常的，的營養(yǎng)交換