灌注層析-高等生物分離技術

1、灌注層析高等生物分離技術2 一、概念二、灌注層析的提出三、灌注層析的原理四、層析介質的種類五、介質的制備及性能表征六、灌注層析的應用七、灌注層析的問題3一、概念灌注層析 ( Perfusive chromatography ) 通稱流通色譜 ( Flowthrough chromatography )，是指利用含有對流孔的介質為固定相的液相色譜法，其分離模式包括各種吸附色譜，如離子交換色譜、疏水性相互作用色譜、親和色譜和反相色譜等。4二、灌注層析的提出 傳統(tǒng)的吸附色譜介質的孔徑較小，介質的孔徑越小，比表面積越大，分子尺寸與介質孔徑相適應的目標溶質的吸附容量越高。 但是，由于介質孔徑較小，流體阻

2、力大，在通常的色譜操作壓力下，流體不能對流進入固相介質的孔內。所以，固相介質內部的傳質僅靠溶質的內擴散來完成。5 液相中溶質的擴散系數(shù)很小，尤其是生物大分子，在固相中的阻滯擴散系數(shù)更小，固相傳質速率很低。因此，傳統(tǒng)吸附色譜的柱效隨流速增大而迅速下降，動態(tài)吸附容量也隨流速增大而迅速降低。 為獲得較大的色譜分辨率和動態(tài)容量，傳統(tǒng)色譜只能在適當?shù)偷牧魉傧虏僮鳌＜词故鞘褂昧綌?shù)微米的高效液相色譜，分析柱的流速不超過500cm/h，大規(guī)模制備分離受操作壓力的限制，流速更低。6流通色譜，它含有穿透孔和擴散孔兩種孔道，穿透孔之間以擴散孔相連，保證了介質的大比表面積和溶質的吸附容量。最大的特點是分離速度快，一

3、般可在數(shù)分鐘內完成，而利用 HPLC 則需要數(shù)十分鐘到一個小時，流通色譜法利用流動相和溶質的對流作用，降低了溶質在介質內滯留的限制，明顯縮短了蛋白質的分離時間。7三、灌注層析的原理折合板高h是間接評價分離介質性能的參數(shù)之一，它受多種因素的影響，通常可表示為；擔體即一種多孔性化學惰性固體。8910四、層析介質的種類POROS介質（美國Perspective Biosystem 公司開發(fā)、取名）粒徑規(guī)格為10 m（H型）和20 m（M型）兩種；隨著連接的官能團不同，又分為反相（R型）、強陰離子交換（Q型）和強陽離子交換（S型）等多種模式的介質類型。整體柱111、POROS介質（雙分散孔色譜介質）穿

4、透孔:孔徑大（600-800nm），對流流過擴散孔：孔徑?。?0-150nm）而短（孔深不超過1um），擴散時間短分離速度極快，幾分鐘內完成122、整體柱（聚合物單塊）用色譜柱為模具，在柱內原位合成的多孔型聚合物單塊連續(xù)床，經過適當?shù)墓δ芑捎糜谏V分離。與傳統(tǒng)的固體粒子填充床相比，整體柱具有如下優(yōu)點：其在柱內原位合成制備，避免了顆粒制備和色譜柱的填充等復雜過程；整體柱介質在柱內為多孔型連續(xù)相，孔徑在亞微米級至微米級之間，在中低壓力下，液體可高速透過連續(xù)床的孔隙，兩相間發(fā)生對流傳質。故可基本消除顆粒內傳質阻力，相間傳質速度快，柱效高；整體柱介質為連續(xù)相，內部孔隙率大，大大提高了色譜柱的有效利

5、用空間（即色譜柱的吸附容量），有利于提高色譜分離能力。13五、介質的制備POROS流通色譜介質的制備：先由苯乙烯（ST）和二乙烯基苯（DVB）通過懸浮聚合、乳液聚合合成微球，然后將其進一步聚集形成聚集體，最后經過聚集體的再聚集合成所需粒徑的分離介質。由于介質的骨架結構為疏水性很強的苯乙烯-二乙烯基苯的共聚物，對蛋白質等生物物質的非特異性吸附極強。1415圖 2 雙乳介質的合成工藝流程圖16從上圖可以看出，制得的雙孔介質的平均粒徑是 42.8 m，體積平均粒徑為45.0 m，主要分布在 3060 m 之間。圖 3 BiPB（雙孔介質）的粒徑分布圖兩種介質的性能表征17從上圖可以看出，MiPB的平

6、均粒徑為42.3 m，體積平均粒徑為44.9 m，與BiPB的平均粒徑與體積平均粒徑都很相近，說明其粒度分布狀態(tài)類似。圖 4 MiPB(常規(guī)微孔球) 的粒徑分布圖18 圖 5 :雙孔介質的掃描電鏡圖（ a:1800 b:10000）從圖可以看出在低倍的SEM圖上小球的表面呈海綿狀，與Perspective Biosystem 公司POROS介質外形相近，說明超孔致孔劑在上面留下的超孔，在高倍的SEM上可以看到超孔與微孔交錯存在的現(xiàn)象。利用 SEM （掃描電鏡）觀察雙孔介質的微觀結構，并拍攝照片，結果如圖19利用 SEM 觀察微孔球可以得到如圖 圖 6 微孔介質的掃描電鏡圖(a: 2,500;

7、b: 10,000)從上圖可以看出微孔球上的微孔的數(shù)量很多，從而增加了微孔球的比表面積。20對雙孔介質與微孔介質利用汞壓計進行測定，得到如圖7 所示的孔徑分布圖。圖 7 兩種介質的孔徑分布圖21圖 8 兩類介質的孔體積分布圖22從圖7和8可以看出雙孔介質的孔徑公布主要是兩個范圍，一個是 20100 nm，另一個是 3004000 nm，而微孔介質的孔徑范圍是 20100nm。說明了甘油溶液微滴在介質聚合過程中起到了形成超孔的作用。23微孔介質含有大量的孔道，所以能夠得到大的吸附容量；而雙孔介質中即含有超孔，又含有微孔，所以也具有相對大的吸附容量。圖 9 兩類介質的對 BSA 的靜態(tài)吸附圖24圖

8、 10 流速對背壓的影響注：背壓即后端的壓力。通常是指運動流體在密閉容器中沿其路徑流動時，由于受到障礙物或急轉彎道的阻礙而被施加的與運動方向相反的壓力。25 從圖10可以看出，微孔介質填充柱的背壓隨流速增加很快，而且不符合線性關系，說明其粒子內部傳質靠擴散作用，傳質阻力大。雙孔介質的填充柱背壓比較低，這是由于色譜介質中含有流動相可以對流流過的孔徑為1 m 的超孔，從而提高了流動相在色譜介質內部的傳質速率。 同時可以發(fā)現(xiàn)，在 03600 cm/h 的流速范圍內，呈線性關系，證明在設定的操作范圍內，色譜介質沒有發(fā)生壓縮形變。這也表明雙孔介質具有較好的機械強度，為在高流速下快速分離蛋白質提供了條件。

9、26以灌注POROS為介質的反相色譜填料類似于硅膠基質的反相填料，其特點是可以在堿性條件下分離。血管擴張素異構體、ii、iii在通常的酸性條件下（0.1% TFA）無法被完全分離；而在堿性條件下（10 m mol/L Na3PO4）,在POROS R/H 柱上2 min內即得到很好的分離。另外，用POROS R/M 填料能在較短時間內完成含有核糖核酸酶、卵清蛋白等蛋白質標準品混合物的分離。六、灌注層析的應用R型：反相 M型:粒徑為20um27Q型：強陰離子交換 H型：粒徑為10umR型：強陽離子交換 在快速條件下（5 mL/min）,在50 mm 4.6 mm i.d. 的POROS Q/H

10、的灌注離子交換色譜柱上，5 min即可完全分離牛血清白蛋白（BSA）和鐵傳遞蛋白,而且在強陽離子交換色譜柱上每5 min循環(huán)1次，在1 mL柱體積上可在1天內得到5 g血清蛋白質。用陽離子交換柱POROS S(100 mm 4.6 mm i.d.)，在5 mL/min的流速下，經梯度沖洗，5 min內能分離200 g脈管活化腸多肽（VIP）。282930用POROS Protein A（醛結合的填料）微型色譜柱（30 mm 2.1 mm i.d.）純化雜交細胞培養(yǎng)的上清液中的免疫球蛋白（IgG），IgG在 10 m mol/L 磷酸鹽+ 0.15 mol/L NaCl緩沖液中,用0.3 mol/L 乙酸+ 0.3 mol/L MgCl2來洗脫，流速為2 mL/min，進樣量為500L。動態(tài)柱容量約為每毫升柱體積