小鼠肝DNA提取及鑒定

1、小鼠肝組織DNA的提取及其含量測(cè)定實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?、掌握從組織細(xì)胞中提取DNA的基本原理。2、掌握DNA提取和鑒定的方法。實(shí)驗(yàn)原理：本實(shí)驗(yàn)所用的是DNA酚抽提法，是對(duì)1976年Stafford及其同事提出的方案的改進(jìn)。可用于多種來(lái)源標(biāo)本的高分子量DNA樣品的制備，包括單層培養(yǎng)細(xì)胞、懸浮生長(zhǎng)細(xì)胞、新鮮組織以及血液標(biāo)本等。提取DNA的基本思路，DNA以核蛋白形式存在于細(xì)胞核中。利用DNA與RNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等在物理和化學(xué)性質(zhì)方面的差異，提取DNA，去除其他成分。它是以含EDTA、SDS及無(wú)DNA酶的RNA酶的裂解緩沖液裂解細(xì)胞，經(jīng)蛋白酶K處理后，用pH8.0的Tris飽和酚進(jìn)行抽提，離心分層后，蛋白

2、質(zhì)因變性位于有機(jī)相與水相的界面，而DNA進(jìn)入水相,再用酚、酚/氯仿抽提除去蛋白質(zhì)，接著用氯仿抽提以除去DNA溶液中微量酚的污染。重復(fù)抽提DNA至一定純度后，根據(jù)不同需要進(jìn)行透析或沉淀處理，獲得所需大小范圍的高分子量DNA樣品。沉淀處理常以乙酸銨為沉淀用鹽，用無(wú)水乙醇沉淀。其中EDTA為二價(jià)金屬離子螯合劑，可以抑制DNA酶的活性，同時(shí)降低細(xì)胞膜的穩(wěn)定性。SDS為生物陰離子去垢劑，SDS可破壞細(xì)咆膜、核膜，并使組織蛋白與DNA分子分離，并能與脂質(zhì)和蛋白質(zhì)結(jié)合使他們沉淀，同時(shí)還有降解DNA酶的作用。無(wú)DNA酶的RNA酶可以有效水解RNA，而避免DNA的消化。蛋白酶K或鏈霉蛋白酶E均為廣譜蛋白酶,其重

3、要特性是能在SDS和EDTA存在下保持很高的活性。將蛋白質(zhì)降解成小肽或氨基酸，可以消化DNA酶、DNA上的蛋白質(zhì)，使DNA分子完整地分離出來(lái)也有裂解細(xì)胞的作用。酚可以使蛋白質(zhì)變性沉淀，也抑制DNA酶的活性。氯仿可除去微量酚。實(shí)驗(yàn)材料：小鼠器材：解剖盤(pán)、解剖剪、鑷子、勻漿器、微量加樣槍、燒杯、試管架、EP管、低溫高速離心機(jī)、紫外分光光度計(jì)試劑：生理鹽水、10%的SDS溶液、飽和酚、氯仿:異戊醇(24:1)、無(wú)水乙醇、10mmol/L的乙酸銨溶液、1xTE(pH8.0)緩沖液(注：1xTE(pH8.0)緩沖液由10mmol/L(pH=8.0)的Tris-HCI和1mmol/L(pH=8.0)的ED

4、TA配制而成)。操作步驟：一、小鼠肝勻漿液的制備：1、頸椎脫臼法處死小鼠，解剖，取肝臟組織一塊于生理鹽水中洗脫血液。2、將洗脫的肝組織剪碎放入勻漿器中，在加入5ml冷的TE緩沖液，進(jìn)行充分研磨。制成勻漿液。二、提取DNA：1、取0.5ml勻漿液加入1.5ml的離心管中，加入10%SDS溶液0.1ml,顛倒混勻后，室溫5min。2、在上述溶液中加入飽和酚0.25ml,氯仿:異戊醇(24:1)0.25ml，充分混勻，室溫放5min，12000rpm離心5min。3、小心取上清液約0.4-0.5ml，加入0.5ml氯仿:異戊醇(24:1)，混勻，室溫放5min，12000rpm離心5min。4、取上

5、清液0.2ml，加入0.3體積（即60p1）的NH4Ac,2.5體積（即0.5ml）的無(wú)水乙醇充分混勻，12000rpm離心5min,小心倒去溶液，吸干。DNA沉淀加入l.OmlTE緩沖液溶解。三、DNA的含量測(cè)定取0.5mlDNA樣品加TE緩沖液至4ml，用TE緩沖液調(diào)零，用紫外分光光度計(jì)分別測(cè)A260nm值和A280nm值。結(jié)果記錄與處理：l、結(jié)果記錄：用紫外分光光度計(jì)分別測(cè)的A260值為0.498,A280值為0.362260nm280nm2、結(jié)果計(jì)算：A260nm/A280nm=0.498/0.362=l.376雙鏈DNA樣品濃度（pg/ml）=A260nmX稀釋倍數(shù)X50=199.2

6、g/ml結(jié)果分析：DNA的質(zhì)量鑒定包括濃度分析、純度鑒定以及大小完整性的分析。濃度分析與純度鑒定，最簡(jiǎn)單快速的方法是紫外分光光度計(jì)。1、通過(guò)A260/A280的比值可以分析其純度，DNA純品：A260/A280=1.8260nm280nm260nm280nmRNA純品：A260nm/A280nm=2.0A260nm/A280nm的比值為是高純度DNA的標(biāo)志，高于或低于此值均表示不純。但比值為1.8時(shí)的DNA溶液也不能斷定為純的DNA溶液，可能兼有蛋白質(zhì)、酚與RNA的污染。其中蛋白質(zhì)與酚的污染均使比值下降，而RNA的污染則使比值升高，一般情況下，A260/A280的比值在1.75-1.80之間是

7、可以接受的。但A260/A280TOC o 1-5 h z260nm280nm260nm280nm的比值若低于1.75，則表明有顯著的蛋白質(zhì)污染。經(jīng)計(jì)算此次實(shí)驗(yàn)所提取的DNA樣品的A260/A280的比值為1.376明顯低于1.75，260nm280nm可見(jiàn)樣品中明顯有蛋白質(zhì)污染，可能是由于加入的SDS未能充分混勻，致組蛋白未能與DNA完全分離，可能由于酚未能與提取液混合充分，未能使蛋白質(zhì)完全沉淀，更有可能是由于在第4步中吸取上清液時(shí)，吸到了蛋白質(zhì)沉淀，造成蛋白污染。鑒于A260/A280的比值低于1.75時(shí)，明顯有蛋白質(zhì)污染，此時(shí)需要加入終濃度為260nm280nm0.5%的SDS，并重復(fù)提取DNA步驟中的2-4。2、通過(guò)A260值可以定量，核酸在波長(zhǎng)260nm的紫外線(xiàn)下，1個(gè)OD值的光密度大260nm約相當(dāng)于50pg/ml的雙鏈DNA、40pg/ml的單鏈DNA或RNA、20pg/ml的寡核苷酸。但紫外分光光度法只用于測(cè)定濃度大于0.25pg/ml的核酸溶液。雙鏈DNA樣品濃度（pg/ml）=A260nmX稀釋倍數(shù)X50據(jù)此計(jì)算出本次實(shí)驗(yàn)的DNA樣品濃度為199：2pg/ml。注意事項(xiàng)：1、對(duì)組織標(biāo)本的高分子量DNA提取時(shí)，最好是新鮮標(biāo)本，需要首先清楚血液和筋膜等纖維結(jié)締組織