NGS測序技術(shù)與分析流程圖

1、第一代測序技術(shù)Sanger測序1977年，桑格測定了第一個基因組序列，是噬菌體X174，全長5375個堿基NGS測序技術(shù)與分析流程圖第1頁Sanger法關(guān)鍵原理是：因?yàn)閐dNTP2和3都不含羥基，其在DNA合成過程中不能形成磷酸二酯鍵，所以能夠用來中止DNA合成反應(yīng)，在4個DNA合成反應(yīng)體系中分別加入一定百分比帶有放射性同位素標(biāo)識ddNTP（分為：ddATP,ddCTP,ddGTP和ddTTP），經(jīng)過凝膠電泳和放射自顯影后能夠依據(jù)電泳帶位置確定待測分子DNA序列NGS測序技術(shù)與分析流程圖第2頁新一代測序介紹三大測序平臺前世今生Lynx MPSSSolexaABI SOLiD454Ion Tor

2、rentHelicosSMRTIllumina SolexaRoche 454Polony SeqABI Ion TorrentPacific Biosciences NGS測序技術(shù)與分析流程圖第3頁Roche-454 454企業(yè)可謂新一代測序技術(shù)奠基人。底，454企業(yè)推出了革命性基于焦磷酸測序法超高通量基因組測序系統(tǒng)Genome Sequencer 20 System，被Nature雜志以里程碑事件報道，開創(chuàng)了邊合成邊測序（sequencing-by-synthesis）先河。之后，454企業(yè)被羅氏診療企業(yè)以1.55億美元收購。454測序原理NGS測序技術(shù)與分析流程圖第4頁測序試驗(yàn)流程：1、

3、文庫制備：依據(jù)樣品種類和試驗(yàn)?zāi)繕?biāo)，將基因組DNA/cDNA片段化處理至400-800bp間，經(jīng)末端修復(fù)與特異性接頭連接等修飾后變性處理回收單鏈DNA（sstDNA）；然后和兩個44個堿基長銜接子（adaptor）A、B進(jìn)行平端連接。A、B 銜接子各自含有20個堿基PCR 引物序列、20個堿基測序引物序列和4個堿基對照序列（TACG），除此之外，B銜接子5端還標(biāo)識有一個生物素基團(tuán)，供后續(xù)分離適當(dāng)測序模板使用。NGS測序技術(shù)與分析流程圖第5頁測序試驗(yàn)流程：2、Emulsion PCR：特定百分比單鏈DNA文庫被固定在尤其設(shè)計DNA捕捉磁珠上，使大部分磁珠磁珠攜帶了一個獨(dú)特單鏈DNA片斷。磁珠結(jié)合文

4、庫被擴(kuò)增試劑乳化，形成油包水混合物，每個獨(dú)特片斷在自己微反應(yīng)器里進(jìn)行獨(dú)立擴(kuò)增，而不受其它競爭性或者污染性序列影響。整個片段文庫擴(kuò)增平行進(jìn)行。擴(kuò)增后產(chǎn)生了幾百萬個相同拷貝。隨即，乳液混合物被打破，擴(kuò)增后仍結(jié)合在磁珠上片段既可被回收純化用于后續(xù)測序試驗(yàn)；NGS測序技術(shù)與分析流程圖第6頁測序試驗(yàn)流程：3、測序反應(yīng)：攜帶DNA珠子與其它反應(yīng)物混合物，隨即放入PTP板中進(jìn)行后繼測序。 PTP孔直徑（29um）只能容納一個珠子（20um）。然后將PTP板放置在GS FLX中，測序開始。每一個與模板鏈互補(bǔ)核苷酸添加都會產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光信號，并被CCD攝影機(jī)所捕捉；NGS測序技術(shù)與分析流程圖第7頁測序試驗(yàn)流程：4

5、、數(shù)據(jù)分析：GS FLX系統(tǒng)在10小時運(yùn)行當(dāng)中可取得100多萬個讀長，讀取超出4-6億個堿基信息，經(jīng)過GS FLX系統(tǒng)提供兩種不一樣生物信息學(xué)工具對測序數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。NGS測序技術(shù)與分析流程圖第8頁454 PyrosequencingNGS測序技術(shù)與分析流程圖第9頁NGS測序技術(shù)與分析流程圖第10頁454 特點(diǎn)與主要應(yīng)用讀長較長，400600bp通量較低，1Run 1M 序列，400600Mb相對成本較高主要應(yīng)用：de novo測序NGS測序技術(shù)與分析流程圖第11頁Illumina solexaSolexa 測序原理NGS測序技術(shù)與分析流程圖第12頁Illumina solexaNGS測序技術(shù)

6、與分析流程圖第13頁Illumina Solexa 橋式PCRdioldiol1st cycle denaturation1st cycle annealingdioldioln=35total1st cycle extensiondioldioldioldiol2nd cycle denaturation2nd cycle annealingdioldioldioldioldioldiol2nd cycle extensionNGS測序技術(shù)與分析流程圖第14頁Illumina Solexa Base Calling123789456T T T T T T T G T T G C T A C

7、G A T NGS測序技術(shù)與分析流程圖第15頁Solexa 特點(diǎn)與主要應(yīng)用讀長較短，100150bp通量高，25G天天，120-150G每Run主要應(yīng)用：RNA測序、表觀遺傳學(xué)研究NGS測序技術(shù)與分析流程圖第16頁ABISOLiDSOLiDSequencing by Oligo Ligation/DetectionOligo連接測序：經(jīng)過連接酶連接，再對oligo上熒光基團(tuán)進(jìn)行檢測SOLiD 5500 xlNGS測序技術(shù)與分析流程圖第17頁ABI SOLiD測序前期制備A 樣品片段化磁珠連接B 乳化PCR3末端修飾C 磁珠富集轉(zhuǎn)到測序玻片NGS測序技術(shù)與分析流程圖第18頁ABI SOLiD測序

8、原理NGS測序技術(shù)與分析流程圖第19頁ABI SOLiD熒光結(jié)合和結(jié)果示例SRR029969.1 VAB_5551_12_381_F3 length=35T11.0203.3.1113211010332111302330201+SRR029969.1 VAB_5551_12_381_F3 length=35!36!8/8:!:!4626=(8.)43),(95,A. SOLiD Oligo熒光基團(tuán)模式圖B. SOLiD 測序結(jié)果示例（Color Space)NGS測序技術(shù)與分析流程圖第20頁NGS測序技術(shù)與分析流程圖第21頁SOLiD 特點(diǎn)與主要應(yīng)用讀長較短，50-75bp精度高，可達(dá)Q40通

9、量高， 20-30G天天，1Run 可達(dá)120G主要應(yīng)用：基因組重測序、SNP檢測等NGS測序技術(shù)與分析流程圖第22頁Ion torrentIon Torrent 測序原理NGS測序技術(shù)與分析流程圖第23頁精度Examples: 90%condence(10%errorrate)=Q10 99%condence(1%errorrate)=Q20 99.9%condence(.1%errorrate)=Q30NGS測序技術(shù)與分析流程圖第24頁三種平臺技術(shù)差異平臺454SolexaSOLiDPCR磁珠乳化PCR橋式PCR磁珠乳化PCR測序載體磁珠玻片玻片測序方式焦磷酸、熒光可逆終止物、熒光連接酶、

10、熒光結(jié)果序列FastQFastQCSFastQNGS測序技術(shù)與分析流程圖第25頁三種平臺效能參數(shù)差異平 臺讀長通量周期精度Solexa HiSeqSingle-end: 1 x 35 bpPaired-end: 2 x 50 bpPaired-end: 2 x 100 bp25 Gb/d1.5d4d8d50 bp 85%以上Q30100 bp 80%以上Q30SOLiD 5500 xlSingle-end: 75 bpPaired-end: 75 x 35 bpMate-pair: 60 x 60 bp20 30 Gb/d1d/ 1lane7d/ 12 lane7d/ 12 laneQ4045

11、4 GS FLX400 - 600 bp400 600 Mb/Run10hQ20NGS測序技術(shù)與分析流程圖第26頁轉(zhuǎn)錄組測序測序流程全轉(zhuǎn)錄組總RNApolyT富集mRNA去除rRNANon-coding RNA轉(zhuǎn)錄組mRNARNA片段化、純化、檢測產(chǎn)量連接兩端接頭序列逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA選擇適當(dāng)長度cDNA進(jìn)行擴(kuò)增純化擴(kuò)增產(chǎn)物，評定產(chǎn)量上機(jī)進(jìn)行高通量測序NGS測序技術(shù)與分析流程圖第27頁轉(zhuǎn)錄組主要分析內(nèi)容無參考序列轉(zhuǎn)錄組分析內(nèi)容有參考序列轉(zhuǎn)錄組分析內(nèi)容1 測序數(shù)據(jù)產(chǎn)量統(tǒng)計，數(shù)據(jù)成份和質(zhì)量評定；2 Contig及Scaffold長度分布3 Unigene長度分布和功效注釋，GO分類，Pathway

12、分析，差異表示分析4 蛋白功效預(yù)測與分類，差異表示基因GO富集和 Pathway富集分析。 1 基本數(shù)據(jù)統(tǒng)計，比對參考序列2 序列在基因組上在分布3 測序深度分析、隨機(jī)性評定和基因差異表示分析4 新基因預(yù)測，基因可變剪接判定和基因融合判定等。NGS測序技術(shù)與分析流程圖第28頁小RNA測序NGS測序技術(shù)與分析流程圖第29頁果蠅三種組織中MiRNA表示情況NGS測序技術(shù)與分析流程圖第30頁MiRNA表示模式分析NGS測序技術(shù)與分析流程圖第31頁新miRNA預(yù)測NGS測序技術(shù)與分析流程圖第32頁miRNA編輯情況分析與統(tǒng)計NGS測序技術(shù)與分析流程圖第33頁分析軟件介紹質(zhì)量控制軟件 (Quality

13、Control)定位軟件 (Mapping the reads)已知基因（差異）表示評定軟件 (Differential Expression)新基因判定軟件 (New gene identification)可視化展示軟件 (Virsulization)基因功效注釋軟件 (GO term or KEGG pathway analysis)NGS測序技術(shù)與分析流程圖第34頁數(shù)據(jù)格式示例Fastq 格式Color Space 格式NGS測序技術(shù)與分析流程圖第35頁P(yáng)hred scoreNGS測序技術(shù)與分析流程圖第36頁質(zhì)量控制NGS測序技術(shù)與分析流程圖第37頁利用galaxy進(jìn)行原始數(shù)據(jù)處理/NGS測序技術(shù)與分