第二次討論第一題

1、PP寶藏T蛋白質(zhì)雙向電泳原理蛋白質(zhì)雙向電泳方法蛋白質(zhì)雙向電泳在醫(yī)學(xué)的應(yīng)用Western blot 即蛋白質(zhì)印跡法（免疫印跡試驗(yàn))。它是分子生物學(xué)、生物化學(xué)和免疫遺傳學(xué)中常用的一種實(shí)驗(yàn)方法。其基本原理是通過特異性抗體對(duì)凝膠電泳處理過的細(xì)胞或生物組織樣品進(jìn)行著色。通過分析著色的位置和著色深度獲得特定蛋白質(zhì)在所分析的細(xì)胞或組織中表達(dá)情況的信息。 western blot為更清楚地講清采用蛋白質(zhì)印跡法，下面我們通過一個(gè)實(shí)驗(yàn)（用蛋白質(zhì)印跡法分析小鼠肝，腎兩個(gè)器官中的CYP1A1（細(xì)胞色素的一種）的含量。）來為大家介紹蛋白質(zhì)印跡法的應(yīng)用主要在于蛋白質(zhì)檢測(cè)小鼠禁食過夜，斷頭處死，迅速剖開腹腔，取出肝、腎分別

2、稱重 按1g組織中加入冰預(yù)冷的10 ml裂解液，10mM PMSF（苯甲基磺酰氟） 1ml 冰上制成10的組織勻漿取1ml勻漿，4、離心30分鐘小心吸取上清液取少量上清液進(jìn)行蛋白定量，余下的-20保存?zhèn)溆米⒁馐马?xiàng),樣品裂解或勻漿處理不徹底，以及蛋白質(zhì)沉淀不完全，可能導(dǎo)致得率過低1.樣品制備考馬斯亮藍(lán)G250 是一種蛋白質(zhì)染料，最大吸收峰在465nm,當(dāng)它與蛋白質(zhì)以范德華力結(jié)合形成考馬斯亮藍(lán)G250蛋白質(zhì)復(fù)合物，其最大吸收峰改變?yōu)?95 nm，其吸光度與蛋白質(zhì)含量呈線性關(guān)系，故可以用于蛋白質(zhì)含量的測(cè)定。按下表操作。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算測(cè)定管的濃度2.蛋白質(zhì)定量（考馬斯亮藍(lán)染色法）裝配好制膠玻璃板按

3、下列配方配制12的分離膠：將表中的前四項(xiàng)組分混勻后，再加入APS和TEMED（四甲基乙二胺）。將上述溶液緩慢注入制膠玻璃片至梳齒下1cm,操作中注意防止產(chǎn)生氣泡，聚膠30分鐘后用ddH2O完全洗凈封閉液。3.制膠制膠所用儀器按下列配方配制5的聚集膠：將表中的前四項(xiàng)組分混勻后，再加入APS和TEMED。注入聚集膠前，用濾紙吸干分離膠上的水。緩慢注入聚集膠，過程中注意防止產(chǎn)生氣泡。插入梳齒，聚膠30分鐘后小心拔除梳齒。用ddH2O清洗梳孔，放入電泳槽備用。用Sample Buffer 按1：1稀釋樣品95加熱變性5分鐘5.上樣及電泳將電泳槽內(nèi)注滿1電泳緩沖液，徹底除去點(diǎn)樣孔中和膠底的氣泡。兩邊空白

4、的泳道點(diǎn)上等量的 Sample Buffer ，上樣量（20l含40g蛋白）向電泳外槽內(nèi)注入1電泳緩沖液，蓋上蓋子，電泳開始時(shí)電壓為80V，染料進(jìn)入分離膠后，將電壓增加到120V，穩(wěn)壓，當(dāng)染料抵達(dá)分離膠底部約80分鐘，斷開電源4.樣品處理上樣示意圖以及注意事項(xiàng)剪6塊濾紙和一塊NC膜，其大小與膠相同將濾紙預(yù)先在轉(zhuǎn)移緩沖液中浸泡5分鐘，除去氣泡凝膠電泳完成后取出。按照海綿3塊濾紙凝膠NC膜另外3塊濾紙海綿的順序依次放，應(yīng)避免氣泡用塑料支架夾緊上述各層，放入轉(zhuǎn)移內(nèi)槽及外槽，注入冰預(yù)冷的轉(zhuǎn)移緩沖液。注意NC膜一側(cè)靠正極，膠一側(cè)靠負(fù)極轉(zhuǎn)移200mA穩(wěn)流，4，1.5小時(shí)（時(shí)間根據(jù)蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量而定）

5、6.轉(zhuǎn)膜轉(zhuǎn)移完成后，取出膜放在濾紙上，用鉛筆標(biāo)好正面，室溫干燥數(shù)分鐘用western blotting封閉液封閉NC膜，室溫下振蕩1小時(shí)后4過夜（NC膜正面向上）8.一抗結(jié)合一抗用封閉液配制（按1：20（CYP1A1）及1:200(-actin)配制）室溫振搖2小時(shí)（NC膜正面向上）以TBS-T洗膜3次，每次5-10分鐘 注意事項(xiàng)，一抗、二抗的稀釋度、作用時(shí)間和溫度對(duì)不同的蛋白要經(jīng)過預(yù)實(shí)驗(yàn)確定最佳條件。7.封閉NC膜二抗以TBS-T稀釋（按1：600配制）室溫振搖孵育1.5小時(shí)（NC膜正面向上）以TBS-T洗膜3次，每次5-10分鐘10.顯色：辣根過氧化物酶顯色(1)在試管中先加入1mlHRP

6、反應(yīng)緩沖液，然后依次加入試劑A500l、試劑B500l、C500l混勻即可。(2)配制好的溶液應(yīng)避光存放，30min內(nèi)使用，染色為褐色。(3)室溫下染色時(shí)間為530min，可根據(jù)顏色變化掌握染色時(shí)間。(4)等目的條帶顯色后，用少量PBS清洗。注意事項(xiàng)， 顯色液必須新鮮配置使用11.照相保存（另有化學(xué)發(fā)光，顯影，定影凝膠圖像分析等處理方法）9.二抗結(jié)合蛋白質(zhì)雙向電泳的原理蛋白質(zhì)雙向電泳 是等電聚焦電泳和SDS（聚丙烯酰氨凝膠電泳）的組合，即先進(jìn)行等電聚焦電泳（按照pI分離），然后再進(jìn)行SDS（按照分子大小），經(jīng)染色得到的電泳圖是個(gè)二維分布的蛋白質(zhì)圖。 等電聚焦電泳 等電點(diǎn)聚焦（IEF）是在電場(chǎng)中

7、分離蛋白質(zhì)技術(shù)的一個(gè)重要發(fā)展。 等電聚焦是在穩(wěn)定的pH梯度中按等電點(diǎn)的不同分離兩性大分子的平衡電泳方法。這些分子總會(huì)是處于不斷擴(kuò)散和抗擴(kuò)散的平衡中，在pI處得以“聚焦”.等電聚焦電泳原理蛋白質(zhì)是帶有電荷的兩性生物大分子，其正負(fù)電荷的數(shù)量隨所處環(huán)境酸堿度的變化而變化。 等電聚焦（IEF）電泳就是在凝膠中加入兩性電解質(zhì)，從而構(gòu)成從正極到負(fù)極pH逐漸增加的pH梯度，處在其中的蛋白分子在電場(chǎng)的作用下運(yùn)動(dòng)，最后各自停留在其等電點(diǎn)的位置上，測(cè)出蛋白分子聚焦位置的pH值，便可以得到它的等電點(diǎn)。等電聚焦電泳原理 聚丙烯酰氨凝膠電泳 作用原理：聚丙烯酰胺凝膠為網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，具有分子篩效應(yīng)。 它有兩種形式：非變性聚丙

8、烯酰胺凝膠電泳（Native）及SDS-聚丙烯酰胺凝膠（SDS）；非變性聚丙烯酰胺凝膠，在電泳的過程中，蛋白質(zhì)能夠保持完整狀態(tài)，并依據(jù)蛋白質(zhì)的分子量大小、蛋白質(zhì)的形狀及其所附帶的電荷量而逐漸呈梯度分開。而SDS僅根據(jù)蛋白質(zhì)亞基分子量的不同就可以分開蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)雙向電泳的方法2D/MS 經(jīng)典工作流程細(xì)胞裂解勻漿除雜質(zhì)濃縮定量差異分析雙向電泳第一向第二向圖像獲取圖譜分析銀染 考染熒光 蛋白標(biāo)記樣品制備分離染色圖譜分析挖點(diǎn)酶解點(diǎn)靶蛋白鑒定體液植物微生物組織細(xì)胞樣品制備 細(xì)胞破碎蛋白沉淀溶解抑制蛋白酶活性去除 核酸脂類鹽，緩沖液，離子性小分子不溶性物質(zhì)2D/MS 經(jīng)典工作流程差異分析圖像獲取圖譜分析

9、銀染 考染熒光 蛋白標(biāo)記染色圖譜分析挖點(diǎn)酶解點(diǎn)靶蛋白鑒定體液植物微生物組織細(xì)胞Separation雙向電泳第一向第二向細(xì)胞裂解勻漿預(yù)分級(jí)除雜質(zhì)濃縮定量樣品制備蛋白質(zhì)雙向電泳：傳統(tǒng)方法sample膠在SDS 緩沖液中平衡Principle according to P.H. OFarrell and J. Klose (1975)pH 10pH 10pH 3pH 3垂直膠管中進(jìn)行等電聚焦 urea, NP-40一向:二向:SDS 丙烯酰胺凝膠電泳非連續(xù)梯度膠按等電點(diǎn)分離（電荷）按分子量分離（質(zhì)量）使用載體兩性電解質(zhì)IEF時(shí)存在的問題不同批次載體兩性電解質(zhì)的重現(xiàn)性載體兩性電解質(zhì)梯度不穩(wěn)定蛋白載量有

10、限重現(xiàn)性差導(dǎo)致梯度漂移梯度漂移導(dǎo)致酸性和堿性蛋白質(zhì)丟失管膠柔軟，尺寸不定操作者個(gè)人技術(shù)影響結(jié)果固相凝膠(支持膜上0.5 mm 厚凝膠)丙烯酰胺緩沖液: Immobiline CH2=CH-CO-NH-R,R ：羧基或叔胺基固相 pH梯度 (IPG)Immobiline 干膠條的特性可重復(fù)性無梯度漂移, 真正的平衡方法可分離酸性和堿性蛋白 容納蛋白樣本量更多水平和垂直 SDS 凝膠中都能使用允許樣本水化上樣 機(jī)械強(qiáng)度和尺寸穩(wěn)定易操作易于對(duì)樣本跟蹤標(biāo)記新pH范圍的 Immobiline 干膠條高分辨率的 IPG 膠條，聯(lián)合使用DeStreak試劑, 能改善極堿性區(qū)域蛋白點(diǎn)結(jié)果。歸功于獨(dú)特的試劑。使

11、用pH范圍相互重疊的干膠條，可提高2-D 圖譜 分析效率!新pH范圍: Immobiline DryStrip pH 3 5.6 NLImmobiline DryStrip pH 5.3 6.5Immobiline DryStrip pH 6.2 7.5Immobiline DryStrip pH 7 11 NLImmobiline DryStrip pH 3 11 NL不同pH范圍膠條 不同長(zhǎng)度、多種窄pH范圍膠條可選，尤其是1個(gè)pH范圍 pH7-11NL堿性膠條寬pH 、窄 pH 范圍膠條寬pH梯度膠條應(yīng)用:整個(gè)蛋白圖譜窄 pH梯度膠條應(yīng)用:提高分辨率增加樣品上樣量檢測(cè)分析更多蛋白pH 3

12、45678910456789提高分辨率: 斑點(diǎn)顯現(xiàn)IPG 4-7IPG 5-6IPG 4-7IPG 5.5-6.7Mouse liver proteinsFrom A. Grg et al. (1999)不同長(zhǎng)度的膠條7 cm 11 cm 13 cm 18 cm24cm2D/MS（蛋白質(zhì)雙向電泳） 經(jīng)典工作流程差異分析圖像獲取圖譜分析蛋白標(biāo)記圖譜分析挖點(diǎn)酶解點(diǎn)靶蛋白鑒定體液植物微生物組織細(xì)胞分離細(xì)胞裂解勻漿預(yù)分級(jí)除雜質(zhì)濃縮定量樣品制備雙向電泳第一向第二向銀染 考染熒光染色Coomassie Blue-考馬斯亮藍(lán)染色+ 靈敏度 ，低至0.01 mg (“膠體”考染)+ 非特異性染色+ 染料與蛋白

13、成比例結(jié)合+ 線性化好 擴(kuò)散速度受限，膠的厚度影響跑膠速度 純度不夠 有限的動(dòng)力學(xué)范圍 膠體考馬斯亮藍(lán)染色1 mg E. coli strain BColloidal CBBG250 staining銀染+ 靈敏度 ，低至0.2 ng + 在凝膠基質(zhì)中與蛋白交聯(lián)+ 自動(dòng)催化反應(yīng) 線性化程度比考染低 步驟多，某些步驟時(shí)間控制嚴(yán)格Silver stained gel of E. coli Lysate IPG 4-7Silver stainedwith PlusOneKitwithout glutaraldehydeand formaldehydein the Ag sol.2D/MS 經(jīng)典工作流

14、程差異分析蛋白標(biāo)記挖點(diǎn)酶解點(diǎn)靶蛋白鑒定體液植物微生物組織細(xì)胞分離細(xì)胞裂解勻漿預(yù)分級(jí)除雜質(zhì)濃縮定量樣品制備雙向電泳第一向第二向圖像獲取圖譜分析銀染 考染熒光染色圖譜分析ImageScanner III圖像掃描系統(tǒng)灰度校正功能平臺(tái)具有防水功能，可直接掃描SDS濕膠。3.7OD高動(dòng)態(tài)范圍，保證高、低豐度蛋白的準(zhǔn)確定量。掃描平臺(tái)大，A3掃描面積，一次可掃描2塊24cm凝膠。Gray 256 scaleTransmissive300dpi由SIB, GeneBio和GE Healthcare合作開發(fā)，為SwissProt推薦分析軟件。高效能參數(shù)自動(dòng)找點(diǎn)，全自動(dòng)蛋白定量計(jì)算方法，不受背景影響。在原始數(shù)據(jù)上

15、進(jìn)行分析，結(jié)果可靠。界面窗口可隨意設(shè)計(jì)，界面極其友好。全自動(dòng)凝膠匹配，采用先進(jìn)的算法。根據(jù)點(diǎn)的相關(guān)因素、形狀、位置、周圍情況，膠間匹配效率高。多種統(tǒng)計(jì)學(xué)分析工具，快速找到膠間蛋白表達(dá)差異?？芍苯渔溄拥紼xPASy 和 SwissProt 數(shù)據(jù)庫(kù)，進(jìn)行網(wǎng)上檢索。全部操作過程都可以撤銷/重作操作，每一步驟都附有說明，使用方便。全面支持DIGE技術(shù)，源自DeCyder 2D軟件。ImageMaster 2D雙向電泳分析軟件2D/MS 經(jīng)典工作流程差異分析蛋白標(biāo)記蛋白鑒定體液植物微生物組織細(xì)胞分離細(xì)胞裂解勻漿預(yù)分級(jí)除雜質(zhì)濃縮定量樣品制備雙向電泳第一向第二向圖像獲取圖譜分析銀染 考染熒光染色挖膠圖譜分析

16、自動(dòng)斑點(diǎn)切取Spot picker切點(diǎn)針頭膠盤蛋白質(zhì)雙向電泳在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用柳淼1，蛋白質(zhì)雙向電泳技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)的應(yīng)用現(xiàn)狀綜述1.1雙向電泳技術(shù)在病原微生物藥物抗性基因功能研究中的應(yīng)用1.2雙向電泳技術(shù)在人類惡性腫瘤研究中的進(jìn)展1.3雙向電泳技術(shù)在藥物作用機(jī)制研究的進(jìn)展1.1雙向電泳技術(shù)在病原微生物藥物抗性基因功能研究中的應(yīng)用 雙向電泳技術(shù)可以進(jìn)行微生物抗性機(jī)理的研究1.2雙向電泳技術(shù)在人類惡性腫瘤研究中的進(jìn)展 人們通過雙向電泳技術(shù)分離正常組織細(xì)胞與腫瘤之間的差異蛋白質(zhì)組分，在尋找腫瘤的特異標(biāo)志物、揭示腫瘤的發(fā)病機(jī)制以及開發(fā)新的腫瘤治療方式和治療藥物提供理論依據(jù)等方面都取得了一些重要的進(jìn)展1.3雙向電泳技術(shù)在藥物作用機(jī)制研究的進(jìn)展 比較正常細(xì)胞與藥物處理后細(xì)胞的蛋白質(zhì)表達(dá)豐度變化，可以提示藥物的毒性作用機(jī)制。細(xì)胞在施藥之后的代謝反應(yīng)做出實(shí)時(shí)的檢測(cè)，不僅能確定療效，也能