流式基礎(chǔ)原理精品課件

1、流式基礎(chǔ)原理第1頁，共50頁，2022年，5月20日，1點(diǎn)29分，星期五流式基本概念第2頁，共50頁，2022年，5月20日，1點(diǎn)29分，星期五流式細(xì)胞術(shù)的基本概念流式細(xì)胞術(shù)（Flow Cytometry, 簡稱FCM）是一種可以快速、準(zhǔn)確、客觀，并且能夠同時(shí)檢測快速直線流動(dòng)狀態(tài)中的單個(gè)細(xì)胞的多項(xiàng)物理及生物學(xué)特性，加以分析定量的技術(shù)，同時(shí)可以對特定群體加以分選。流式細(xì)胞儀（Flow Cytometer）集激光技術(shù)、電子物理技術(shù)、光電測量技術(shù)、電子計(jì)算機(jī)技術(shù)、細(xì)胞熒光化學(xué)技術(shù)、單克隆抗體技術(shù)為一體的一種新型高科技儀器。第3頁，共50頁，2022年，5月20日，1點(diǎn)29分，星期五流式細(xì)胞術(shù)的特點(diǎn)檢

2、測速度快，分析樣本量大：在極短時(shí)間內(nèi)可分析大量細(xì)胞，這是流式不同于其他細(xì)胞分析儀器的主要特點(diǎn)，只要標(biāo)本中的細(xì)胞數(shù)量足夠，流式細(xì)胞儀可以每秒鐘成千上萬個(gè)細(xì)胞的速率進(jìn)行測量，測量的細(xì)胞總數(shù)可達(dá)數(shù)千、數(shù)萬乃至數(shù)百萬個(gè) 可同時(shí)分析單個(gè)細(xì)胞的多種特征：使用不同熒光素標(biāo)記的單克隆抗體或熒光染料對細(xì)胞進(jìn)行多色熒光染色，通過流式細(xì)胞分析，可獲得單細(xì)胞的多種信息，使細(xì)胞亞群的識(shí)別、計(jì)數(shù)更為準(zhǔn)確強(qiáng)大的分選功能：在分析的同時(shí)可以對特定群體加以分選第4頁，共50頁，2022年，5月20日，1點(diǎn)29分，星期五流式檢測的樣本可檢測的樣本種類多樣：各種細(xì)胞（如外周血，骨髓，細(xì)針穿刺，灌洗液，實(shí)體組織，懸浮或貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞）

3、，微生物，人工合成微球等New!血清、血漿、培養(yǎng)上清、細(xì)胞裂解液樣本制備：單細(xì)胞懸液（天然，機(jī)械研磨/消化）51051107cells/ml，約0.51ml，300目篩網(wǎng)過濾第5頁，共50頁，2022年，5月20日，1點(diǎn)29分，星期五流式細(xì)胞儀的檢測范圍 細(xì)胞結(jié)構(gòu)細(xì)胞大小細(xì)胞顆粒度細(xì)胞表面積核漿比例DNA含量與細(xì)胞周期RNA含量蛋白質(zhì)含量 細(xì)胞功能細(xì)胞表面/胞漿/核的特異性抗原細(xì)胞活性細(xì)胞內(nèi)/外的細(xì)胞因子激素結(jié)合位點(diǎn)、細(xì)胞受體蛋白磷酸化pH值鈣離子濃度細(xì)胞膜電位、線粒體膜電位 第6頁，共50頁，2022年，5月20日，1點(diǎn)29分，星期五流式細(xì)胞儀的檢測信號(hào)第7頁，共50頁，2022年，5月20

4、日，1點(diǎn)29分，星期五散射光信號(hào) 當(dāng)細(xì)胞顆粒通過聚集的激光束時(shí)，激光向各個(gè)方向散射。與激光束 方向同軸的稱前向角散射光信號(hào)（FSC）。與激光束垂直的稱為 側(cè)向角散射光信號(hào)（SSC）。第8頁，共50頁，2022年，5月20日，1點(diǎn)29分，星期五散射光信號(hào)Right Angle Light Detector Cell ComplexitySSCForward Light Detector Cell Surface Area FSCIncident Light Source前向角散射光（FSC, Forward Scatter）細(xì)胞相對大小及其表面積 側(cè)向角散射光（SSC, Side Scatter

5、）細(xì)胞顆粒度及細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器的相對復(fù)雜性第9頁，共50頁，2022年，5月20日，1點(diǎn)29分，星期五前向角散射光信號(hào)第10頁，共50頁，2022年，5月20日，1點(diǎn)29分，星期五側(cè)向角散射光信號(hào)第11頁，共50頁，2022年，5月20日，1點(diǎn)29分，星期五外周全血細(xì)胞散射光雙參數(shù)點(diǎn)圖（紅細(xì)胞溶解后） 顆粒雜質(zhì)、氣泡對檢測的影響第12頁，共50頁，2022年，5月20日，1點(diǎn)29分，星期五熒光信號(hào)使用不同熒光標(biāo)記的單克隆抗體染色，做多色分析熒光信號(hào)的強(qiáng)弱，反映了細(xì)胞抗原的表達(dá)含量第13頁，共50頁，2022年，5月20日，1點(diǎn)29分，星期五熒光樣本制備雙色直接染色第14頁，共50頁，2022年，5

6、月20日，1點(diǎn)29分，星期五熒光素的激發(fā)和發(fā)射光譜任何發(fā)熒光的物質(zhì)分子都具有這兩個(gè)特征光譜（nm）激發(fā)光譜（Excitation，Ex）：是指能特異性地激發(fā)某種熒光素的一定波長范圍內(nèi)的光線，也稱為吸收光譜。吸收波峰（最大吸收波長）：Ex-Max發(fā)射光譜（Emission，Em）：是指某一波長激發(fā)光引起熒光素發(fā)射的一定波長范圍內(nèi)的熒光發(fā)射波峰（最大發(fā)射波長）：Em-Max熒光素的使用：選擇正確的激光器確定所需探測器（PMT）區(qū)別488nm 520nm異硫氰酸熒光素（FITC）第15頁，共50頁，2022年，5月20日，1點(diǎn)29分，星期五光學(xué)系統(tǒng)：濾光片如何將一束混合的熒光區(qū)分開來，分別進(jìn)行收集呢

7、？濾光片置于熒光探測器前，限定其接收的熒光的波長范圍 Longpass(LP) Shortpass(SP) Bandpass(BP)460 500 540460 500 540460 500 540SP 500LP 500BP 500/50第16頁，共50頁，2022年，5月20日，1點(diǎn)29分，星期五FACSCalibur光學(xué)濾片檢測器組（激光器）PMT位置帶通/長通透鏡適用染料488nm藍(lán)色激光FL1530/30FITCFL2585/42PE, PIFL3670 LPPerCP,PerCP-Cy5.5, PE-Cy7635nm紅色激光FL4661/16APC第17頁，共50頁，2022年，5

8、月20日，1點(diǎn)29分，星期五Fluorescence Spectrum Viewer 第18頁，共50頁，2022年，5月20日，1點(diǎn)29分，星期五Fluorescence Spectrum Viewer 第19頁，共50頁，2022年，5月20日，1點(diǎn)29分，星期五Fluorescence Spectrum Viewer 第20頁，共50頁，2022年，5月20日，1點(diǎn)29分，星期五Fluorescence Spectrum Viewer 第21頁，共50頁，2022年，5月20日，1點(diǎn)29分，星期五Fluorescence Spectrum Viewer 第22頁，共50頁，2022年，5

9、月20日，1點(diǎn)29分，星期五Fluorescence Spectrum Viewer 第23頁，共50頁，2022年，5月20日，1點(diǎn)29分，星期五Fluorescence Spectrum Viewer 第24頁，共50頁，2022年，5月20日，1點(diǎn)29分，星期五流式數(shù)據(jù)分析形式第25頁，共50頁，2022年，5月20日，1點(diǎn)29分，星期五數(shù)據(jù)存儲(chǔ)FCS 2.0格式常以列表模式（LIST MODE)：將每個(gè)細(xì)胞的每個(gè)檢測參量依次排列順序存儲(chǔ)FITC/PE雙染樣本第26頁，共50頁，2022年，5月20日，1點(diǎn)29分，星期五第27頁，共50頁，2022年，5月20日，1點(diǎn)29分，星期五數(shù)據(jù)顯

10、示直方圖（Histogram）二維點(diǎn)圖（Dot Plot）等高線圖（Contour Plot）密度圖（Density）三維圖（3D Plot）等第28頁，共50頁，2022年，5月20日，1點(diǎn)29分，星期五單參數(shù)直方圖分析 熒光峰的高低即在縱軸對應(yīng)的高度反映了？ 熒光峰的高低即在縱軸對應(yīng)的高度反映了具有此種熒光強(qiáng)度的細(xì)胞在樣本中所占比例的相對多少，而非絕對數(shù)目第29頁，共50頁，2022年，5月20日，1點(diǎn)29分，星期五雙參數(shù)散點(diǎn)圖分析第30頁，共50頁，2022年，5月20日，1點(diǎn)29分，星期五等高圖和密度圖第31頁，共50頁，2022年，5月20日，1點(diǎn)29分，星期五流式細(xì)胞儀的組成和工作

11、原理第32頁，共50頁，2022年，5月20日，1點(diǎn)29分，星期五第33頁，共50頁，2022年，5月20日，1點(diǎn)29分，星期五液流系統(tǒng)：鞘液包繞著單行排列的細(xì)胞依次高速通過流動(dòng)池，而激光聚焦于流動(dòng)池中心的樣本流上，隨后經(jīng)檢測的樣本和鞘液流向廢液桶。第34頁，共50頁，2022年，5月20日，1點(diǎn)29分，星期五光學(xué)系統(tǒng)：經(jīng)熒光染色的細(xì)胞在激光的照射下產(chǎn)生散射光和熒光信號(hào)，同時(shí)被前向光電二極管和一組光電倍增管（PMT）接收，熒光信號(hào)經(jīng)一系列雙色性反射鏡和帶通或長通濾光片的分離，形成多個(gè)不同波長的熒光信號(hào)第35頁，共50頁，2022年，5月20日，1點(diǎn)29分，星期五電子系統(tǒng)：熒光信號(hào)和散射光信號(hào)經(jīng)

12、二極管和PMT接收后可轉(zhuǎn)換為電信號(hào)，再通過模/數(shù)轉(zhuǎn)換器轉(zhuǎn)換為可被計(jì)算機(jī)識(shí)別的數(shù)字信號(hào)，以列表模式存儲(chǔ)，最終以圖形形式呈現(xiàn)第36頁，共50頁，2022年，5月20日，1點(diǎn)29分，星期五第37頁，共50頁，2022年，5月20日，1點(diǎn)29分，星期五流式對照的設(shè)置第38頁，共50頁，2022年，5月20日，1點(diǎn)29分，星期五熒光染色對照的設(shè)置1陰性對照空白對照自發(fā)熒光，即不經(jīng)熒光染色細(xì)胞內(nèi)部熒光分子經(jīng)光照發(fā)出的熒光。自發(fā)熒光信號(hào)為噪聲信號(hào)。一般說來，細(xì)胞成分中能產(chǎn)生自發(fā)熒光的分子（核黃素、細(xì)胞色素等）的含量越高，自發(fā)熒光越強(qiáng)，如腫瘤細(xì)胞、粒細(xì)胞等；樣本死細(xì)胞比例越高自發(fā)熒光越強(qiáng)實(shí)驗(yàn)樣本特異熒光，即抗

13、體F(ab)2段與細(xì)胞抗原特異結(jié)合上的熒光染料受光照發(fā)出的熒光非特異熒光，即抗體Fc段與細(xì)胞表面的Fc受體非特異結(jié)合上的熒光染料受光照發(fā)出的熒光自發(fā)熒光特異熒光非特異熒光同型對照（自發(fā)熒光非特異熒光）合適？第39頁，共50頁，2022年，5月20日，1點(diǎn)29分，星期五同型對照同型對照（Isotype Control） ：與實(shí)驗(yàn)染色的單克隆抗體特異性無關(guān)的免疫球蛋白亞型 （即Fc段相同， F(ab)2段不同）與染色的單克隆抗體 相同種屬來源 相同免疫球蛋白及亞型 相同熒光素標(biāo)記 相同劑量和濃度 但由未免疫動(dòng)物血清純化而來用于消除由于抗體非特異性結(jié)合到細(xì)胞表面的Fc受體而產(chǎn)生的背景染色例如，標(biāo)記F

14、ITC的單克隆抗體為小鼠IgG1亞類抗體，標(biāo)記PE的單克隆抗體為小鼠IgG2a亞類抗體，同型對照應(yīng)用相同濃度和劑量的未免疫小鼠血清的純化IgG1（1）和IgG2a（ 2a），并分別標(biāo)記FITC和PE第40頁，共50頁，2022年，5月20日，1點(diǎn)29分，星期五商業(yè)化熒光素的發(fā)射光譜spectral overlap第41頁，共50頁，2022年，5月20日，1點(diǎn)29分，星期五Fluorescence Spectrum Viewer spectral overlap如何解決？第42頁，共50頁，2022年，5月20日，1點(diǎn)29分，星期五熒光染色對照的設(shè)置2補(bǔ)償對照（雙色或多色分析中，熒光素發(fā)射光譜

15、重疊時(shí)）熒光補(bǔ)償（compensation）是指在流式細(xì)胞多色分析中，糾正熒光素發(fā)射光譜重疊（spectral overlap）的過程，即從一個(gè)被檢測的熒光信號(hào)中去除任何其他的干擾熒光信號(hào)已染色樣本？真雙陽？假雙陽？第43頁，共50頁，2022年，5月20日，1點(diǎn)29分，星期五熒光染色對照的設(shè)置2補(bǔ)償對照（雙色或多色分析中，熒光素發(fā)射光譜重疊時(shí)）熒光補(bǔ)償（compensation）使用單種熒光素標(biāo)記的單克隆抗體和其余熒光素對應(yīng)的同型對照抗體分別進(jìn)行染色 幾色分析需要制備幾個(gè)補(bǔ)償對照管分析類型管功能 加入的抗體雙色分析1Isotype1-FITC2a-PE2Compensation1A-FITC2a-PE3Compensation21-FITCB-PE4Sample1,2A-FITCB-PENo.AntibodyIsotypeMouse anti-human未免疫M(jìn)ouse血清純化而來1A-FITC（1）1-FITC2B-PE（2a）2a-PE第44頁，共50頁，2022年，5月20日，1點(diǎn)29分，星期五雙色熒光補(bǔ)償1 FL1單染補(bǔ)償管第45頁，共50頁，2022年，5月20日，1點(diǎn)29分，星期五雙色熒光補(bǔ)償2 FL2單染補(bǔ)償管第46頁，共50頁，2022年，5月20日，