腎缺血預(yù)處理對兔未成熟心肌Bcl

1、腎缺血預(yù)處理對兔未成熟心肌Bcl孫忠東，高尚志，池一凡，夏家紅，楊辰垣【關(guān)鍵詞】缺血預(yù)處理EffetsfrenalisheiprenditiningntheexpressinsfBl2,Bax,FasprtEinsiniatureyardialellsinrabbits【Abstrat】AI:Tinvestigatetheeffetsfrenalisheiprenditining(RIP)napptsisandexpressinsfBl2,BaxandFasprteinsiniatureyardialellsinrabbits.ETHDS:Islatedrkingrabbitheartdela

2、susedinthisstudyand24iaturerabbitsererandlydividedintntrlgrup,isheia/reperfusin(I/R)grupandRIPgrup.TheTUNEL,nulesalladderfDNAfragentsandtheexpressinfBl2,BaxandFasprteinseredeteted.RESULTS:parediththatinI/Rgrup,TUNELellapptsisasler(4.191.13)%vs(12.302.10)%,P0.01,ladderfDNAfragentsasler(573501765vs135

3、2003370,P0.01),Bl2expressinashigher(335251026vs12385860,P0.01),Baxexpressinasler(8640768vs324721128,P0.01)andFasexpressinasler(8936912vs321001260,P0.01)inRIPgrup.NLUSIN:RIPdereasesiatureyardialellapptsisandaffetstheexpressinsfBl2,BaxandFasprteins.【Keyrds】kidney;isheiprenditining;apptsis;Bl2;Bax;Fas【

4、摘要】目的：討論腎缺血預(yù)處理(RIP)對兔未成熟心肌細(xì)胞凋亡和Bl2,Bax,Fas蛋白表達(dá)的影響.方法：24只幼兔采用Langendrff離體心臟灌注模型，隨機(jī)分為正常對照組、心臟缺血/再灌注組(I/R)和腎缺血預(yù)處理組(RIP)，每組8只，測定各組未成熟心肌細(xì)胞凋亡和Bl2,Bax,Fas蛋白表達(dá).結(jié)果：RIP組與I/R組比擬，心肌細(xì)胞凋亡率明顯減少(4.191.13)%vs12.302.10%,P0.01，DNA片段梯光密度明顯減少(573501765vs1352003370,P0.01),Bl2表達(dá)增多(335251026vs12385860,P0.01),Bax(8640768vs3

5、24721128,P0.01)和Fas(8936912vs321001260,P0.01)表達(dá)明顯減少.結(jié)論：RIP可減少缺血再灌注后兔未成熟心肌細(xì)胞凋亡和影響B(tài)l2,Bax,Fas蛋白的表達(dá).【關(guān)鍵詞】腎；缺血預(yù)處理；細(xì)胞凋亡；Bl2；Bax；Fas0引言實(shí)驗(yàn)說明，成熟心肌和心肌外的組織器官缺血預(yù)處理可減少心肌細(xì)胞凋亡的發(fā)生，其中Bl2,Bax,Fas等基因蛋白的表達(dá)在細(xì)胞凋亡中起重要作用.腎缺血預(yù)處理(renalisheiprenditining,RIP)對未成熟心肌細(xì)胞凋亡是否有影響的報(bào)道甚少.本實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖怯^察RIP對兔未成熟心肌細(xì)胞凋亡和Bl2,Bax,Fas等基因蛋白表達(dá)的影響.1材

6、料和方法1.1材料出生1421d的安康長耳大白兔24只(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物室提供)，雌雄不拘.PIAS1000型多媒體病理圖像分析系統(tǒng)華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院清平影像工程公司消費(fèi)進(jìn)展光密度測定.細(xì)胞凋亡試劑盒購自南京建成生物技術(shù).1.2方法1.2.1模型建立及分組按處理方式不同將動(dòng)物隨機(jī)分為3組,每組8只.開胸，右心耳注入肝素(300U/kg)，切開主動(dòng)脈插入灌注管，即行KH液Langendrff灌流，灌注壓為6kPa(45.0Hg).切取心臟，結(jié)扎肺靜脈，剪開左心耳將內(nèi)徑3左房灌注管插入左房，內(nèi)徑1測壓管插入左心室.左房灌注壓為1kPa(7.5Hg)，左心后負(fù)荷為3.0kPa(22.5

7、Hg).KH緩沖液成分(l/L):Nal118.50,Kl4.70,al22.50,gS41.20,NaH325.00,KH2P41.20,Gluse11.10,Na2EDTA0.50.使用時(shí)新穎配制，經(jīng)0.45濾器過濾，灌流前給予體積分?jǐn)?shù)為950L/L2和50L/L2混合氣體按1.5L/in向儲(chǔ)液瓶內(nèi)的灌流液中通氣30in，灌流液維持在37，pH為7.4，浸透壓為824850kPa/L320330s/L,1s=2.5787kPa(37).正常對照組:僅灌注KH液180in，然后取心肌標(biāo)本.缺血/再灌注組(I/R)：灌注20in后，停灌45in，復(fù)灌120in.腎缺血預(yù)處理組(RIP)：反復(fù)2

8、次阻斷腎血流5in/放開5in，建立Langendrff模型，然后重復(fù)I/R組缺血/再灌注方法.1.2.2觀察指標(biāo)凋亡細(xì)胞原位標(biāo)記與半定量分析：左心室心肌組織常規(guī)石蠟包埋，采用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(TdT酶)介導(dǎo)帶熒光的deuridinetriphsphate(dUTP)缺口末端標(biāo)記法(terinaltransferaseUTPnikendlabeling,TUNEL)1，標(biāo)記凋亡細(xì)胞核中DNA3H末端，經(jīng)脫蠟，洗脫，消化，孵育，洗脫，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，鏡下觀察.根據(jù)凋亡陽性細(xì)胞分布情況，每張切片拍攝5個(gè)陽性視野，每視野計(jì)數(shù)300個(gè)心肌細(xì)胞中陽性細(xì)胞數(shù)，以平均計(jì)算陽性細(xì)胞所占的百分比

9、作為凋亡細(xì)胞陽性指數(shù)(AI).瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA片段梯：采用快速法檢測DNA片段梯2.Bl2,Bax,Fas基因蛋白的表達(dá)：采用esternBlt法.用2SDS樣品緩沖液裂解細(xì)胞，搜集細(xì)胞蛋白質(zhì)，經(jīng)SDSPAGE別離后迅速轉(zhuǎn)移至尼龍膜，按文獻(xiàn)3法參加單抗(11000)及堿性磷酸酶偶聯(lián)的抗小鼠IgG(11000)用BIP/NBT顯色.應(yīng)用PIAS1000型多媒體彩色病理圖像分析系統(tǒng)進(jìn)展定量測定A值.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：數(shù)據(jù)以xs表示，采用t檢驗(yàn)，P0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.2結(jié)果2.1凋亡細(xì)胞原位標(biāo)記與半定量分析RIP組的細(xì)胞凋亡率為(4.191.13)%，與I/R組的(12.302.10)%比

10、擬P0.01(Fig1).2.2瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA片段梯DNA片段梯光密度測定RIP組(573501765)與I/R組(1352003370)比擬差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01).2.3Bl2,Bax,Fas蛋白的表達(dá)密度測定Bl2蛋白RIP組(335251026)與I/R組(12385860)比擬差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)；Bax蛋白RIP組(8640768)與I/R組(324721128)比擬差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)；Fas蛋白RIP組(8936912)與I/R組(321001260)比擬差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01).3討論缺血再灌注損傷可誘發(fā)細(xì)胞凋亡的發(fā)生4，細(xì)胞凋亡已成

11、為再灌注損傷發(fā)病機(jī)制中一個(gè)重要環(huán)節(jié).通過干預(yù)凋亡基因的表達(dá)阻斷細(xì)胞凋亡以減輕再灌注損傷的研究是近年來細(xì)胞分子生物學(xué)研究的重點(diǎn)之一.近年來研究認(rèn)為心肌缺血預(yù)處理可減少細(xì)胞凋亡的發(fā)生5.心肌缺血預(yù)處理是通過PK的信號傳遞來保護(hù)心肌的，PK和itKATP與凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑相關(guān)連，從而影響心肌的細(xì)胞凋亡6，而RIP的心肌保護(hù)作用亦與PK和itKATP相關(guān).Bl2主要表達(dá)于線粒體外膜、核膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上，其表達(dá)可抑制細(xì)胞凋亡，Bax表達(dá)那么促進(jìn)細(xì)胞凋亡.細(xì)胞凋亡是一種受促凋亡基因如fas和抗凋亡基因如bl2調(diào)控的主動(dòng)性細(xì)胞死亡過程.Fas屬于TNF受體家族.由Fas介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡存在于多種細(xì)胞系中.心肌細(xì)

12、胞膜表達(dá)功能性的Fas和FasL，但是在正常情況下Fas和FasL并不介導(dǎo)心肌細(xì)胞發(fā)生凋亡.我們通過建立Langendrff灌注模型檢驗(yàn)了RIP對兔未成熟心肌細(xì)胞凋亡及Bl2,Bax,Fas基因蛋白表達(dá)的影響,發(fā)現(xiàn)RIP使缺血再灌注后兔未成熟心肌細(xì)胞凋亡明顯減少，Bl2基因蛋白的表達(dá)明顯增多，而Bax,Fas基因蛋白的表達(dá)明顯減少，說明在兔未成熟心肌，RIP可通過影響B(tài)l2,Bax,Fas基因蛋白的表達(dá)而減少心肌細(xì)胞凋亡.【參考文獻(xiàn)】1GavrieliY,SheranY,BenSassnSA.Indentifiatinfprgraedelldeathinsituviaspeifilabelin

13、gfnulearDNAfragentatinJ.JellBil,1992;119:493-501.2姜泊.分子生物學(xué)常用實(shí)驗(yàn)方法.北京：人民軍醫(yī)出版社，1996：177.3SabrkJ,FritshEF,aniatisT.leularlning:Alabratryanual.2nded.NeYrk:ldSpringHarbrLabratry.1989:1860-1874.4GttliebRA,BurlesnK,KlnerRA,etal.ReperfusininjuryinduesapptsisinrabbitardiyytesJ.JlinInvest,1994;94:1621-1628.5angNP,BufkinBL,Nakaura,etal.Isheiprenditi